乙型肝炎动物模型的研究现状与挑战

Current research status and challenges of animal models for hepatitis B

摘要

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球面临的主要健康问题之一，是导致肝硬化和肝细胞癌的重要病因之一。由于HBV感染具有严格的种属特异性，目前尚未建立能够支持完整HBV感染周期并真实模拟宿主免疫和发病机制的动物模型。现有用于HBV研究的动物模型包括黑猩猩、树鼩和小鼠等多种宿主，以及利用相关嗜肝病毒建立的替代模型。尽管这些模型在研究HBV复制、免疫反应及抗病毒药物评估方面发挥了重要作用，但仍存在伦理、感染效率低、成本高或缺乏持续感染等局限。近年来，人源化肝脏与免疫系统的小鼠模型、转基因模型及病毒载体介导的感染模型等新策略的出现，显著推动了HBV生物学研究进展。未来，通过结合基因编辑、组织工程及多系统整合等新技术，构建更符合人类病理生理特征的HBV感染动物模型，将为深入理解病毒-宿主互作机制、探索HBV清除途径及开发根治性治疗策略提供坚实基础。

Abstract

Hepatitis B virus （HBV） infection is one of the major global health problems， and it can lead to the development of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Due to the strict species specificity of HBV infection， no animal model has yet been established to fully support the complete life cycle of HBV infection and accurately reflect host immune responses and pathogenesis. Current animal models used for HBV research include various hosts such as chimpanzees， tree shrews， and mice， as well as surrogate models based on related hepatotropic viruses. Although these models have contributed significantly to the research on HBV replication， immune response， and antiviral drug evaluation， they still have certain limitations such as ethical concerns， low infection efficiency， high costs， and a lack of persistent infection. In recent years， the development of novel strategies， such as humanized mouse models with reconstituted human liver and immune systems， transgenic models， and viral vector-mediated infection systems， has greatly promoted the research on HBV biology. In the future， with the integration of emerging technologies including gene editing， tissue engineering， and multi-system reconstruction， it is possible to establish HBV infection models that can more closely mimic human pathophysiology， thereby laying a robust foundation for understanding virus-host interactions， exploring the pathways for viral clearance， and developing radical treatment strategies.

Graphical abstract

关键词

乙型肝炎病毒 / 共价闭合环状DNA / 模型， 动物

Key words

Hepatitis B Virus / Covalently Closed Circular DNA / Models， Animal

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）是感染肝脏的重要病原体，可引起急性或慢性肝炎，并引发包括肝纤维化、肝硬化甚至肝癌在内的病毒感染相关并发症。据统计，HBV感染每年约造成80万人死亡，给全球公共卫生带来了巨大负担^［1］。尽管疫苗能够有效预防新发HBV感染，但针对已经感染HBV的患者，目前尚无有效清除感染的药物。此外，HBV实验模型的缺乏，特别是免疫健全的动物感染模型的缺乏，严重阻碍了HBV相关的机制研究和药物研发。

1 HBV基因组和生活周期（图1）

HBV是一种带包膜的DNA病毒，基因组全长约3.2 kb，为松弛环状双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）^［2］，包含4个开放阅读框（open reading frames， ORF）：聚合酶、表面蛋白（surface，S）、前核心（precore， preC）/核心（core， C）和X。HBV感染肝细胞后，通过与肝细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和病毒受体钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（Na⁺-taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）的相互作用，完成感染进入过程^［3］。随后，经内化、脱衣壳、释放rcDNA入核并修复形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）^［4-5］。HBV cccDNA可在肝细胞中以染色体形式稳定存在，作为转录模板生成病毒RNA并翻译相应病毒蛋白^［6-8］。在核衣壳内，前基因组RNA（pre-genomic RNA， pgRNA）作为逆转录模板合成新的rcDNA。含有rcDNA的核衣壳或被转运至细胞核中扩增cccDNA池，或被包装成子代病毒粒子释放至细胞外^［9］。

2 HBV动物模型

HBV感染具有严格的种属特异性，目前仅能在人类和黑猩猩中发生自然感染。研究表明，不同物种来源的肝细胞对HBV感染的易感性主要受到2个关键环节的限制：（1）受体介导的病毒内吞进入细胞；（2）病毒进入后至cccDNA形成的过程（表1）。以小鼠肝细胞为例，研究证实其中第2个限制环节主要涉及病毒核衣壳的分解与去组装^［10］。一旦cccDNA成功形成，后续的病毒复制过程通常不再受到明显限制。然而，目前尚缺乏能够完整支持HBV感染周期，并能真实模拟宿主免疫反应与疾病进展的动物模型。因此，建立易于操作、成本合理的实验动物模型对于HBV相关研究具有重要意义。

2.1 黑猩猩

研究显示，即使一个病毒基因组当量的HBV便足以成功感染黑猩猩^［14］。感染HBV后，黑猩猩会出现与HBV感染者中非常相似的免疫反应和炎症特征^［15］，并且可以造成急性和慢性感染。急性感染期间的病毒清除主要通过非细胞毒性抗病毒机制，清除HBV复制中间体和cccDNA实现^［16］；进展为慢性感染的黑猩猩血清和肝组织中可以检测到病毒抗原和核酸，同时出现与HBV感染者中相似的门静脉周围炎症反应^［17］。然而，由于价格昂贵、体型较大以及动物伦理学等问题，使黑猩猩模型在HBV动物模型中的研究应用受到限制。

2.2 树鼩

树鼩能在实验条件下感染HBV，并且会出现短暂性病毒血症、病毒清除以及乙型肝炎表面抗原血清学转换^［22］。尽管新生树鼩感染HBV后可出现低病毒血症的慢性感染^［22］，但是成年树鼩感染HBV后多为一过性感染，且病毒复制水平较低、维持时间较短^［23］。

2.3 猕猴/食蟹猴

猕猴能支持较长时间的HBV复制^［24］。然而，猕猴肝细胞并不支持HBV感染，过表达人源NTCP（human NTCP，hNTCP）后可支持HBV的感染并完成整个生活周期，表明NTCP是关键限制因子^［11］。Müller等^［25］将猴NTCP第158位氨基酸替换为hNTCP上的对应氨基酸，即可赋予其HBV易感性。Burwitz等^［18］研究发现，在猕猴体内过表达hNTCP后，可支持HBV感染和肝内cccDNA形成，同时检测到核心抗体和HBV特异性T细胞应答。然而，该模型为急性感染，需要使用免疫抑制剂才可以建立长期感染^［26］。为提高该模型的感染效率，研究人员构建了hNTCP转基因猕猴，并发现其肝细胞支持HBV感染^［27］。这些研究为建立HBV感染猴模型提供了理论基础和依据。

2.4 小鼠

小鼠是研究中最常用的动物模型，但其本身并不能直接感染HBV。即使在小鼠肝细胞中过表达hNTCP或hNTCP转基因，小鼠仍不支持HBV感染^{［21， 28］}。研究表明，小鼠肝细胞除了缺少病毒进入受体之外，在其细胞质中病毒核衣壳无法解离是限制HBV感染的重要原因^［10］。尽管如此，研究人员已建立一系列小鼠模型，用于模拟HBV感染或复制过程中的部分环节，广泛应用于各类研究，包括HBV转基因小鼠模型、高压水动力注射介导的HBV转染小鼠模型、重组腺病毒（adenovirus，AdV）介导的HBV转导小鼠模型、重组腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的HBV转导小鼠模型、cccDNA替代小鼠模型、人-鼠嵌合肝脏小鼠模型以及人免疫系统和肝双人源化小鼠模型（表2）。

HBV转基因小鼠模型支持较高水平病毒复制并可产生完整病毒粒子^［29］。然而，该模型中的HBV感染并非自然获得、对HBV抗原天然免疫耐受且不能形成cccDNA，因此并不适于病毒感染和转录活性机制等方面的研究。高压水动力注射介导的HBV转染小鼠模型可在野生型小鼠中出现急性自限性反应，模拟HBV急性感染；而在免疫缺陷小鼠中，病毒复制状态可维持至少81 d^［30］。然而，该模型无法形成cccDNA，质粒骨架、小鼠品系等因素都会影响小鼠中HBV的复制持续时间。此外，高压水动力注射操作本身会引起较为严重的肝组织损伤，可能干扰对发病机制和免疫应答等实验结果的判断。重组AdV介导的HBV转导小鼠模型中急性和慢性感染的建立取决于病毒注射剂量^［31］。然而，该模型中无法形成cccDNA，载体编码的非HBV病毒蛋白产物可能刺激机体免疫应答，进而存在HBV被清除的风险，从而干扰对HBV诱发免疫反应的判断。重组AAV介导的HBV转导小鼠模型可模拟慢性HBV感染的部分病毒学和免疫学特征^［32］，同时可通过同源重组形成cccDNA^［33］。然而，该模型仍缺少HBV感染进入过程，且病毒复制的主要模板并非cccDNA。cccDNA替代小鼠模型是由研究人员开发出的用于替代cccDNA研究的小鼠模型，包括重组cccDNA^［34］、HBVcircle^［35］和时空控制的重组cccDNA^［36］。然而，这些模型形成的cccDNA分子与野生型cccDNA仍然存在区别。Xu等^［37］建立的AAV-HBV1.04小鼠模型，可通过宿主共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶介导的DNA损伤修复途径修复形成cccDNA，进而建立病毒持续复制，该模型中乙型肝炎表面抗原的表达可以指示cccDNA的形成，并用于抗病毒药物的临床前评估。尽管如此，该模型仍然缺少HBV感染全过程，且cccDNA形成机制也与真实感染存在差异。人-鼠嵌合肝脏小鼠模型是通过将人源肝细胞移植到严重联合免疫缺陷病和肝细胞受损的小鼠体内构建，该模型支持HBV自然感染^［38］。然而，这些小鼠模型缺失正常的免疫系统，模型构建复杂、死亡率高、费用昂贵，因此不适用于研究HBV诱发的免疫病理机制。人免疫系统和肝双人源化小鼠模型具备正常的免疫系统^［39］。虽然该模型感染HBV后可以完成病毒的生命周期，但是由于能与小鼠嵌合的肝细胞较少，且小鼠模型构建流程复杂、死亡率高、对饲养环境的要求较严格等因素，尚未实现广泛应用。

2.5 其他潜在HBV动物模型

基于对HBV动物模型的迫切需求，研究人员扩大了筛选宿主范围。Chen等^［13］研究发现，来源于土拨鼠、雪貂、土豚、马、兔、鲸鱼、大棕蝙蝠、猫和犀牛的NTCP同源物在人肝癌细胞（HepG2）中异源表达后，可使其支持HBV感染。进一步研究表明，猫、猪和仓鼠有望被开发为新型动物模型。Xu等^［12］进一步评估了包括猫在内的多个物种的肝原代细胞对HBV的易感性，首次发现猫肝原代细胞支持HBV自然感染，同时猫肝细胞可用于抗HBV药物筛选。值得注意的是，尽管雪貂和兔的NTCP在HepG2细胞中异源表达后支持HBV感染，但是其肝原代细胞并不支持HBV感染，表明病毒进入后依然存在限制因素^［12-13］。Zhang等^［20］研究发现，仓鼠的NTCP 并不支持HBV感染，但过表达hNTCP后可支持HBV感染。猪NTCP同样不支持HBV感染，但在猪的肝原代细胞中过表达hNTCP可支持HBV的感染以及完整生活周期^{［11， 19］}。深入的研究揭示了猪NTCP中限制与HBV相互作用的158位和167位氨基酸^［40］。此外，有研究指出，大鼠和狗的NTCP支持丁型肝炎病毒而非HBV感染，且其肝原代细胞仅在过表达hNTCP后支持丁型肝炎病毒感染^［11］。以上研究为进一步建立感染动物模型提供了依据。

3 基于HBV相关嗜肝病毒的替代模型

HBV所属的嗜肝DNA病毒科包含与其他物种密切相关的嗜肝病毒，包括毛里求斯食蟹猴HBV（mauritian cynomolgus macaques HBV，mcHBV）、绒毛猴HBV（woolly monkey HBV，WMHBV）、卷尾猴HBV（capuchin monkey HBV， CMHBV）、土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHV）、鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV）、家猫肝炎病毒（domestic cat hepadnavirus，DCH）和松鼠乙型肝炎病毒等。这些病毒与其自然宿主有望成为HBV感染的替代模型。

3.1 猴类肝炎病毒

Dupinay等^［41］在毛里求斯岛发现了少量自然状态下可感染mcHBV的食蟹猴群。mcHBV与人HBV D基因型ayw3血清型的临床分离株序列的同源性高达99%，且mcHBV与人HBV preS1区第68位氨基酸的差异也是限制其感染的关键因素^［18］。Lanford等^［42］从患有暴发性肝炎的圈养毛猴中分离得到WMHBV。松鼠猴可以感染WMHBV，并可表现出持续6～8个月的病毒血症^［43］。研究表明，狨猴肝原代细胞和诱导多能干细胞来源的肝样细胞支持HBV和更有效的WMHBV感染，且WMHBV preS1 1～48残基嵌合HBV病毒的感染效率高于野生型HBV^［44］。CMHBV最初是从金腹悬猴中分离鉴定出，其可通过hNTCP感染人肝癌细胞^［45］。这些嗜肝病毒的发现为建立猴模型提供了依据，但是其与HBV之间仍然存在差异。

3.2 WHV

WHV在病毒学特征上与HBV相似，包括基因组大小、结构、核苷酸序列（60%～70%相似性）和蛋白表达，且在病毒感染时宿主的先天和适应性免疫反应方面也十分相似^［46］。因此，该模型已被用于评价抗HBV药物^［47］和筛选针对HBV的免疫治疗策略^［48］。然而，土拨鼠与人类的遗传背景仍然存在差异，并不能完全真实地反映人感染HBV的状态。

3.3 DHBV

DHBV由Mason等^［49］在北京鸭血清中发现。DHBV感染北京鸭模型价格经济、易饲养与操作，早期被广泛应用于研究HBV基因突变、病毒的免疫清除机制以及筛选HBV抗病毒药物^［50］。然而，DHBV与人HBV的同源性较低（约40%），且其不含X-ORF^［51］，使其在研究HBV分子机制方面受限。此外，不同种类的鸭感染DHBV后的表现形式也存在差异，因此该模型仍然无法完全模拟人HBV感染的全过程。

3.4 DCH

近年研究发现了一种新型猫嗜肝病毒——DCH，其感染与猫慢性肝炎相关^［52-53］。DCH具有部分双链、环状的DNA基因组，长度约为3 200个碱基，与其他嗜肝病毒类似，DCH的基因组包含P、S、C和X-ORF^［52］。值得注意的是，DCH的preS1序列在遗传上比WHV或北极地松鼠乙型肝炎病毒更接近人类HBV，提示DCH preS1可能具有与HBV preS1类似的功能^［54］。与HBV不同，DCH的X蛋白降解染色体结构维持蛋白6并不依赖于DNA结合蛋白1^［55］。此外，DCH感染的猫会出现持续性病毒血症和肝脏炎症，同时也可以通过整合导致猫肝癌的发生^［56］。

4 小结

HBV研究长期受到缺乏理想动物模型的限制，现有的模型体系包括黑猩猩、树鼩、小鼠及其他潜在宿主（如猫、猪和仓鼠等），以及利用相关嗜肝病毒（如WHV、DHBV和DCH等）建立的替代模型。这些模型在HBV感染、复制、免疫反应及肝病进展等方面提供了宝贵的信息，但均存在一定局限：灵长类模型虽能较好地模拟人类感染过程，但受伦理与成本限制；树鼩模型可支持感染过程，却难以稳定维持慢性感染；小鼠模型虽具有高可操作性与遗传可塑性，却普遍缺乏对HBV的自然易感性。近年来，人源化肝脏和免疫系统的小鼠模型、NTCP转基因模型以及基于病毒载体的感染模型等新技术的出现，显著推动了HBV感染及cccDNA生物学研究的进展。同时，对HBV受体跨物种差异和宿主限制因子的深入解析，也为构建新型感染模型提供了理论基础。

未来，构建能够同时再现HBV完整生命周期、宿主免疫应答及慢性肝病进展的理想模型，仍是该领域的核心挑战之一。随着基因编辑、人源化重建、多器官类器官及体内-体外联合系统等的不断发展，多维度、互补性的HBV研究模型体系有望逐步建立。这将为深入阐明HBV感染与宿主相互作用机制、揭示cccDNA维持与清除规律，以及开发根治性抗HBV疗法，提供坚实的实验基础与技术支撑。

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基金资助

新发突发与重大传染病防控国家科技重大专项(2025ZD01906700)

中央高校基本科研业务费(2042024kf0026)

国家自然科学基金(32570193)

国家自然科学基金(81971936)

国家自然科学基金(32300131)

中国博士后科学基金(2023M732695)