鳖甲煎丸对肝癌Huh-7细胞皮下移植裸鼠模型的影响及作用机制

Effect and mechanism of Biejiajian Pill on subcutaneous xenograft tumor model of hepatocellular carcinoma Huh7 cells

摘要

目的 评估鳖甲煎丸对肝癌生长的抑制作用，并阐明其通过线粒体能量代谢介导AMP活化的蛋白质激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路调控的潜在机制。 方法 采用人肝癌Huh-7细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，将18只荷瘤裸鼠随机分为模型组、鳖甲煎丸组（2.2 g/kg）和二甲双胍组（250 mg/kg），灌胃给药14 d。实验期间监测肿瘤体积与质量；采用HE染色观察组织病理学变化；检测瘤组织活性氧（ROS）与三磷酸腺苷（ATP）水平；采用免疫组化法、蛋白质免疫印迹法检测AMPK/mTOR通路相关蛋白表达水平。满足正态分布的计量资料采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步两两比较采用Tukey’s法检验；不满足正态分布的计量资料采用Kruskal-Wallis H检验进行多组间比较，进一步两两比较采用Dunn’s法。 结果 与模型组比较，鳖甲煎丸组相对肿瘤体积与质量均显著降低（P值均<0.01），抑瘤率达45.73%。病理学显示，与模型组比较，鳖甲煎丸组肿瘤细胞数量减少，并出现广泛坏死；机制研究表明，与模型组比较，鳖甲煎丸组ROS水平显著升高（P<0.001），ATP水平显著降低（P<0.001）；同时，p-AMPK/AMPK比值（0.81±0.20 vs 0.13±0.04）与p-ULK1/ULK1比值（0.69±0.17 vs 0.18±0.13）均显著升高（P值均<0.01），而p-mTOR/mTOR比值（1.34±0.16 vs 3.20±0.62）显著降低（P<0.01）。 结论 鳖甲煎丸可能通过诱导线粒体能量代谢障碍，即升高ROS水平并降低ATP水平，进而激活AMPK/mTOR信号通路，抑制肝癌生长。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of Biejiajian Pills （BJJW） on the growth of liver cancer， as well as its potential mechanism in mediating the AMP-activated protein kinase （AMPK）/mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway through mitochondrial energy metabolism. Methods Human hepatoma Huh7 cells were used to establish a nude mouse model of subcutaneous xenograft tumor. A total of 18 tumor-bearing nude mice were randomly divided into model group， BJJW group （2.2 g/kg）， and metformin group （250 mg/kg）， and the corresponding drug was given by gavage for 14 consecutive days. Tumor volume and weight were monitored during the experiment； HE staining was used to observe histopathological changes； the levels of reactive oxygen species （ROS） and adenosine triphosphate （ATP） in tumor tissue were measured； immunohistochemistry and Western blotting were used to measure the expression levels of proteins associated with the AMPK/mTOR pathway. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the Tukey’s test was used for further comparison between two groups； the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between multiple groups， and the Dunn’s test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the model group， the BJJW group had a tumor inhibition rate of 45.73%， with significant reductions in both tumor volume and weight （P<0.01）. Pathological examination showed that compared with the model group， the BJJW group had a significant reduction in the number of tumor cells and the presence of extensive necrosis. Mechanistic studies showed that compared with the model group， the BJJW group had a significant increase in ROS level （P<0.001） and a significant reduction in ATP level （P<0.001）， as well as significant increases in p-AMPK/AMPK ratio （0.81±0.20 vs 0.13±0.04， P<0.01） and p-ULK1/ULK1 ratio （0.69±0.17 vs 0.18±0.13， P<0.01） and a significant reduction in p-mTOR/mTOR ratio （1.34±0.16 vs 3.20±0.62， P<0.01）. Conclusion BJJW may inhibit the growth of liver cancer by inducing mitochondrial energy metabolism dysfunction， increasing the level of ROS， reducing the level of ATP， and activating the AMPK/mTOR signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

鳖甲煎丸 / 肝肿瘤 / AMP活化的蛋白质激酶 / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

Key words

Biejiajian Pills / Liver Neoplasms / AMP-activated Protein Kinase / Mammalian Target of Rapamycin

原发性肝癌是一种恶性程度高、预后差的肝脏肿瘤，主要包括肝细胞癌和肝内胆管癌2种类型。该病起病隐匿，多数患者确诊时已进展至中晚期，对常规治疗反应不佳，5年生存率不足30%。据统计，全球每年新发病例约86.5万例，且发病率呈持续上升趋势，其中我国病例数占全球总数的40%以上^［1-4］。由于肝癌治疗周期长、治疗手段复杂，相关医疗开销巨大，给患者家庭和社会层面带来沉重的经济负担，且这一负担呈持续上升趋势^［5］。肝癌的临床发病具有高度隐匿性，早期常缺乏特异性临床症状，导致大多数患者在确诊时已处于中晚期阶段，从而错失根治性切除的最佳时机，严重制约了整体治疗效果，因此从新的角度和靶点考察中医药在肝癌治疗中的作用，已成为当前研究的迫切需求^［6］。研究表明，线粒体功能障碍在肝癌发展中发挥关键作用，线粒体呼吸链受损可导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，进而激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡^［7］。AMP活化的蛋白质激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路是能量代谢的核心调控机制，AMPK激活可抑制mTOR信号，从而抑制肿瘤生长^［8］。鳖甲煎丸是治疗肝癌的经典方剂，具有软坚散结、活血化瘀的功效。既往研究显示，该方剂可通过多靶点抑制肿瘤^［9-12］，但具体作用机制尚不明确。本研究旨在探讨鳖甲煎丸是否通过调控线粒体能量代谢激活AMPK/mTOR通路发挥抗肝癌作用，以期为该方剂的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

实验采用人肝癌细胞株Huh7，购自武汉塞维尔生物技术有限公司（货号：STCC00033），实验时传代至第4～5代。

1.1.2 实验动物

实验选用18只SPF级BALB/c-nu裸鼠，4～6周龄，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物质量合格证号：No.430727241102949976，实验动物生产许可证号：SYXK（湘）2021-0002，实验单位使用许可证编号：SYXK桂2024-0004。实验动物饲养于广西中医药大学SPF级动物房内，饲养环境温度为20～26 ℃，相对湿度为40%～70%，明暗节律为12 h/12 h，予以自由进食、饮水，适应性喂养7 d后进行相关实验。

1.1.3 实验用药

鳖甲煎丸（武汉中联药业集团股份有限公司，国药准字Z42020772，产品批号：211970，规格：3 g/袋），其组方按照《金匮要略》配制，共含23味药材：鳖甲12分（炙）、乌扇3分（炮）、黄芩3分、柴胡6分、鼠妇3分（熬）、干姜3分、大黄3分、芍药5分、桂枝3分、葶苈1分（熬）、石苇3分（去毛）、厚朴3分、牡丹5分（去心）、瞿麦2分、紫葳3分、半夏1分、人参1分、土鳖虫5分（熬）、阿胶3分（炙）、蜂窠4分（炙）、赤硝12分、蜣螂6分（熬）和桃仁2分。盐酸二甲双胍片（河北天成药业股份有限公司，国药准字H13021647，产品批号：H20240044，规格：0.25 g×120片）。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

Huh-7细胞专用培养基（货号：GA2409022，Servicebio）、组织ROS检测试剂盒（DHE荧光法）（货号G1746-100T，Servicebio）、RIPA裂解液（货号：R0020，Solarbio）、ECL发光试剂（货号：sc-2048，中杉金桥）、PMSF（货号：BL507A，Biosharp）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：ZJ102，雅酶）、细胞/动物组织/植物组织RNA提取试剂盒（货号：A077-3，Solarbio）、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（货号：G1076，Servicebio）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）含量检测试剂盒（货号：G4309）、AMPK抗体（货号：AB32047，ABCAM）、mTOR抗体（货号：AB134903，ABCAM）、p-AMPK抗体（货号：AB131357，ABCAM）、p-mTOR抗体（货号：AB109268，ABCAM）、ULK1抗体（货号：DF7588，Affinity）、p-ULK1抗体（货号：AF4387，Affinity）、山羊抗兔的二抗（货号：ZB2301，中杉金桥）、山羊抗鼠的二抗（货号：ZB2305，中杉金桥）、基质胶（货号：G4130，Servicebio^® Swe）、磷酸酶抑制剂（货号：BL636A，Biosharp）。

1.2.2 主要仪器

研磨仪（KZ-Ⅱ，Servicebio）、电泳仪（DYCZ-24DN，北京六一公司）、核酸蛋白定量仪（DS-11，美国丹诺尔Denovix）、超声波细胞破碎仪（TL-650Y，江苏天翎仪器有限公司）、紫外分光光度计（UV-2600，岛津仪器公司）、全波长酶标仪（Epoch，Biotek）、生物分析仪（Agilent 5400，Agilent Technologies Co Ltd）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（T100PCR，Bio-Rad）、凝胶成像系统（Tanon 5200，上海天能）、SHANDON石蜡切片机、ELX808多功能酶标仪（美国BIOTEK公司）、LightCycler 480 Ⅱ荧光定量PCR检测系统（瑞士Roche公司）、AB2-5S1型BSL-Ⅱ级生物安全柜（新加坡ESCO公司）、EXF40086V超低温冰箱（美国ThermoFishe公司）、5417R低温高速离心机（德国EPPENDORF公司）、Moticam1300数码显微图像分析系统、ELT-13V-85 ℃超低温冰箱（美国HARRIS公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

Huh7细胞采用专用培养基，于37 ℃、5% CO₂饱和湿度的恒温培养箱中常规培养，当细胞融合度达到80%～90%时，使用无酚红重组胰蛋白酶进行消化，并按1∶3～1∶4比例传代培养。

1.3.2 肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及干预

裸鼠适应性喂养1周后，取生长状态良好的对数生长期Huh7细胞，Huh7专用培养基和基质胶按照1∶1比例重悬配制成细胞浓度为5×10⁷个/mL的单细胞悬液，每只裸鼠使用一次性1 mL注射器于右侧腋窝皮下接种100 μL悬液，每日观察裸鼠状态及移植瘤生长情况，当瘤体体积达到50 mm³时视为造模成功^［13］，瘤体体积达到100 mm³时开始干预。

将18只裸鼠按照简单随机分组法分为3个组（每组6只）：模型组（MOD组）、鳖甲煎丸组（BJJW组）、二甲双胍组（MET组）（多项研究指出二甲双胍作为AMPK激动剂有显著的抗癌作用^［14-18］）。各实验组小鼠每日按0.2 mL/10 g体积灌胃给予相应药物，1次/d，连续干预14 d。MOD组予以相应体积饮用水灌胃，BJJW组灌胃给予2.2 g/kg剂量的药物（根据前期研究确定该浓度为最佳实验浓度^［19-20］），MET组灌胃给予250 mg/kg剂量的药物。每2 d测量各组裸鼠的体质量，用游标卡尺测量皮下移植瘤，并计算肿瘤体积。终点处理：末次给药后24 h手术剥离肿瘤，用吸水纸吸干瘤体组织表面多余的水分，利用精密电子天平称取瘤体质量。计算相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV）＝V_给药后/V_给药前，抑瘤率＝（MOD组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）/MOD组平均瘤质量×100%，脏器指数＝各脏器质量/体质量。

1.3.3 HE染色观察裸鼠肿瘤组织病理形态学变化

取各组裸鼠部分瘤体组织，于4%多聚甲醛中固定过夜，随后进行梯度乙醇脱水，二甲苯透明化处理，石蜡包埋。切片脱蜡后进行HE染色，脱水、封片，置于显微镜下观察瘤体组织形态特征。

1.3.4 肿瘤组织内ROS检测

肿瘤组织冰冻切片在室温下复温，控干水分，滴加自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min，滴加ROS染液，置于37 ℃避光恒温箱中孵育30 min，DAPI复染，避光室温孵育10 min后封片，采集图形，用Image J软件分析荧光强度。

1.3.5 肿瘤组织内ATP检测

肿瘤组织切片，准确称重，按质量（mg）∶体积（μL）＝1∶9的比例加入0.9%的生理盐水，于冰水浴条件下机械匀浆，制备成10%的匀浆液，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，使用ATP检测试剂盒测定其化学发光值。

1.3.6 免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤组织p-AMPK、p-mTOR蛋白的表达水平

肿瘤组织切片依次经脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭后，加入按一定比例稀释的一抗p-AMPK（1∶200）和p-mTOR（1∶2 000），于4 ℃湿盒内孵育过夜后，加入二抗（HRP山羊抗小鼠，1∶200），室温孵育50 min，待DAB显色后，苏木素复染细胞核3 min，脱水封片，置于白光显微镜下进行结果判读。

1.3.7 Western Blot检测AMPK/mTOR信号通路的蛋白表达水平

剪取约0.025 g肿瘤组织，用提前预冷的PBS缓冲液清洗肿瘤组织，随后加入300 μL RIPA裂解液，于组织研磨仪中反复研磨肿瘤组织至无组织块，置于冰上裂解10 min至组织完全裂解。将离心机提前预冷至4 ℃，以12 000 r/min离心15 min，取上清进行电泳分离后，将蛋白质转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，加入按一定比例稀释的一抗AMPK（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶800）、ULK1（1：1 100）、p-ULK1（1：1 100）和β-actin（1∶8 000），4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次，加入二抗（稀释比例均为1∶3 000），PBST洗涤3次。ECL化学发光后，依次加入显影液、定影液处理各1 min，胶片经扫描仪扫描后，用Image J软件分析灰度值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 9进行数据统计分析。分别采用Shapiro-Wilk检验与Levene检验对数据的正态性及方差齐性进行验证。满足正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，使用单因素方差分析进行多组间比较，进一步两两比较采用Tukey’s法检验；不满足正态分布的计量资料以M（P₂₅～P₇₅）表示，采用Kruskal-Wallis H检验进行多组间比较，进一步两两比较采用Dunn’s法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤体积及质量的影响

在药物干预期间，各组裸鼠均未出现死亡，每2天测量各组裸鼠体重并作比较，各组间差异均无统计学意义（P值均>0.05）。MOD组裸鼠的肿瘤体积持续快速增长，由初始的（106.17±4.19） mm³增长至第14天的（829.73±115.17） mm³。从干预第5天起，BJJW组与MET组的肿瘤体积均显著小于MOD组（P值均<0.01）；MET组的肿瘤体积均显著小于BJJW组（P值均<0.05）（表1）。

给药第14天，与MOD组比较，BJJW组和MET组的移植瘤RTV均显著减小（P值均<0.01）；给药结束后剖离移植瘤组织并称重，与MOD组比较，BJJW组和MET组的移植瘤质量均显著降低（P值均<0.01）；不同组间的肝脏指数、脾脏指数差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表2，图1）。BJJW组、MET组的抑瘤率分别为45.73%、62.17%。

2.2 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤组织病理学的影响

MOD组肿瘤细胞呈现显著增殖特征，表现为细胞密度明显增高，细胞异型性显著，大小不一、形态不规则且排列紧密。肿瘤细胞增殖活跃：所有样本均显示高核质比、核异型性明显以及核分裂象多见。肿瘤细胞坏死少见（仅少量核固缩/溶解），但普遍存在水样变性（细胞肿胀、胞质疏松淡染）。仅个别样本局部见少量淋巴细胞浸润，其余无显著炎性细胞浸润。与MOD组比较，BJJW组肿瘤细胞数量减少，坏死显著增加：所有样本均出现较多至大量坏死（核固缩/碎裂/溶解），个别出现大面积坏死（占1/3组织）。多数样本无显著炎性浸润，水样变性较MOD组减少。MET组的肿瘤细胞数量最少，肿瘤细胞坏死最显著：所有样本均表现为大量坏死，部分伴广泛核溶解，出血程度不一（轻度至大量），但水样变性更普遍，所有样本均无炎性细胞浸润，嗜酸性物质渗出少见（图2）。

2.3 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤组织ROS水平的影响

DHE荧光染色结果显示，与MOD组比较，BJJW组和MET组ROS的荧光强度均有不同程度的升高，且差异均有统计学意义（P值均<0.001），说明鳖甲煎丸能升高肝癌裸鼠移植瘤组织内的ROS水平，其中MET组移植瘤ROS荧光强度升高较BJJW组更显著（P<0.001）（图3）。

2.4 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤组织ATP水平的影响

与MOD组比较，BJJW组和MET组的ATP水平明显降低，差异均有统计学意义（P值均<0.001），且MET组移植瘤的ATP水平较BJJW组降低更显著（P<0.001）（图4）。

2.5 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤组织p-AMPK、p-mTOR蛋白表达水平的影响

与MOD组对比，BJJW组和MET组移植瘤的p-AMPK表达水平均升高，差异均有统计学意义（P值均<0.01），其中MET组移植瘤p-AMPK表达水平较BJJW组升高更显著（P<0.05）；与MOD组对比，BJJW组和MET组移植瘤的p-mTOR表达水平均降低，差异均有统计学意义（P值均<0.01），其中MET组移植瘤p-mTOR表达水平较BJJW组降低更显著（P<0.05）（图5，表3）。

2.6 鳖甲煎丸对Huh7裸鼠移植瘤组织AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达水平的影响

与MOD组对比，BJJW组和MET组移植瘤的p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值均有升高，差异均有统计学意义（P值均<0.01），其中MET组移植瘤的p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值较BJJW组升高更显著（P值均<0.05）；与MOD组对比，BJJW组和MET组移植瘤的p-mTOR/mTOR比值均降低，差异均有统计学意义（P值均<0.01），其中，MET组移植瘤的p-mTOR/mTOR比值较BJJW组降低更显著（P<0.05）（图6，表4）。

3 讨论

肝癌作为全球范围内的重大健康负担，其治疗面临巨大挑战。本研究通过动物实验证实，鳖甲煎丸可显著抑制肝癌生长，其机制与调控线粒体能量代谢和AMPK/mTOR通路密切相关。

中医认为，肝癌的发病机制是肝脾肾虚损，继而导致气滞、血瘀、痰凝和毒聚，最终形成“癥积”。《黄帝内经-灵枢》云：“积之始生，得寒乃生，厥乃成积也”，并指出“凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣。”《诸病源候论》中描述到：“积聚者，由阴阳不和，腑脏虚弱，受于风邪，搏于腑脏之气所为也。诸脏受邪，初未能为积聚，留滞不去，乃成积聚。”鳖甲煎丸作为抗癌经典方，出自东汉医家张仲景所著《金匮要略》，方中人参、阿胶、芍药和桂枝补益气血，调和营卫；大黄、紫葳、土鳖虫、蜣螂、鼠妇、牡丹皮、芍药、桃仁、鳖甲、半夏、乌扇和赤硝活血化瘀，软坚散结；蜂房、黄芩和柴胡清热解毒散结。全方攻补兼施、寒温并用、气血津液同治，诸法兼备，本方遵消癥化积之法，于肝癌诸证中疗效独到，深具临证应用价值^［21-23］。本课题组前期研究证实了鳖甲煎丸能促进肝癌细胞中miRNA-14的表达，抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制肝细胞癌进展^［24］。

本研究通过裸鼠皮下移植瘤模型证实，鳖甲煎丸能显著抑制肝癌Huh7细胞的生长。BJJW组的抑瘤率为45.73%，且病理学分析显示，与MOD组相比，BJJW组肿瘤细胞数量减少，伴随广泛坏死、核固缩及核碎裂。这些结果与前期临床研究一致，提示鳖甲煎丸可能通过多靶点作用抑制肝癌进展^［9-12］。值得注意的是，其抑瘤效果虽略低于MET组（62.17%），但鳖甲煎丸作为中药复方仍具有相当的抗肿瘤潜力。

进一步的机制研究发现，鳖甲煎丸可显著升高肿瘤组织内ROS水平，并降低ATP水平（P<0.01）。线粒体功能紊乱是肝癌的典型特征^［25-27］，ROS过量积累可诱导线粒体膜电位下降，通过线粒体通透性转换孔开放释放细胞色素C，进而激活Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡^［28-30］。同时，ATP耗竭直接反映线粒体能量代谢障碍，迫使细胞进入能量应激状态。这一发现与中医“癥积”病机中“毒聚”理论相契合，提示鳖甲煎丸可能通过“解毒”作用破坏肿瘤能量稳态。

Western Blot结果显示，鳖甲煎丸可显著提高p-AMPK/AMPK及p-ULK1/ULK1比值（P<0.01），并降低p-mTOR/mTOR比值（P<0.01）。p-AMPK/AMPK及p-ULK1/ULK1比值升高表明AMPK磷酸化激活增强，AMPK作为细胞能量感应器，可通过感知ATP/AMP比率变化，在能量不足时被肝激酶B1或钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β磷酸化激活^［31］，进而抑制合成代谢（如mTOR C1介导的蛋白质合成），并促进分解代谢（如脂肪酸氧化）^［32］。激活的AMPK通过磷酸化结节性硬化症复合体2或mTOR的调节相关蛋白，直接阻断mTORC1活性^［33］，从而抑制肝癌细胞周期进程（如下调细胞周期蛋白D1）和糖酵解（如抑制缺氧诱导因子-1α）^［34-36］。p-mTOR/mTOR比值降低则反映mTOR通路受到抑制，其意义包括：（1）阻断促增殖信号：mTORC1通过磷酸化核糖体S6激酶1和真核翻译起始因子4E结合蛋白1促进核糖体生成和蛋白翻译^［37］，其抑制可减少肿瘤生长所需的生物合成；（2）恢复自噬平衡：AMPK被激活时，在丝氨酸317、丝氨酸777等位点磷酸化ULK1，激活其激酶活性，并抑制mTORC1，解除其对ULK1的抑制，启动自噬，而mTORC1是自噬的关键负调控因子，其抑制可激活自噬性细胞死亡^［38-41］。

本研究揭示鳖甲煎丸通过“ROS/ATP→AMPK/mTOR/ULK1”轴发挥抗肝癌作用。其中，ROS积累和ATP耗竭是线粒体功能障碍的直接表现，而AMPK/mTOR通路激活则通过双重调控（抑制合成代谢/促进分解代谢）放大抗肿瘤效应。与阳性对照药二甲双胍相比，鳖甲煎丸的抑瘤率虽略低，但依然显示出较强的抑瘤效果及多靶点调控能力。二甲双胍作为经典的AMPK激动剂，其抗肿瘤机制明确，在本研究中表现出更显著的抑瘤效果，提示其作为单药抗肿瘤的优越性；而鳖甲煎丸作为传统中药复方，成分复杂、作用途径多样，不仅通过调节线粒体能量代谢和氧化应激发挥作用，还可能影响免疫微环境和细胞凋亡等路径，具备多层次、多靶点的综合抗癌潜力。在安全性方面，鳖甲煎丸展现出潜在优势。与部分化学药物相比，中药复方通常副作用较小，长期使用更为安全。二甲双胍虽具有良好的抗肿瘤效果，但长期大剂量使用可能伴随乳酸酸中毒、胃肠不适等风险。鳖甲煎丸基于传统中药配伍，临床安全性较高，副作用相对较少，具有更好的耐受性。这一机制与鳖甲煎丸“活血化瘀、解毒消癥”的中医功效相呼应，也为靶向能量代谢的肝癌治疗提供了新策略。本研究为鳖甲煎丸的抗肝癌作用提供了重要的实验依据，丰富了传统中医药在现代肿瘤治疗中的应用理论。但目前仍有不足：本研究仅聚焦于AMPK/mTOR通路，未来需结合转录组或代谢组学探索鳖甲煎丸对其他代谢节点（如糖酵解、脂质合成）的影响。此外，需在自发性肝癌模型中验证其疗效，以更贴近临床病理特征。未来工作应进一步明确鳖甲煎丸中的关键活性成分及其作用机制，探索其与现代抗肿瘤药物的联合应用效果，评估协同抗癌潜力和安全性，为其临床推广提供更坚实的基础。

伦理学声明

本研究方案于2024年6月3日经由广西中医药大学伦理委员会审批，批号：DW20240603165，符合实验室动物管理与使用准则。

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