胸腺素β4对四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型的影响及其作用机制

Effect of thymosin β4 on a mouse model of carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis and its mechanism

摘要

目的 本研究拟探讨胸腺素β4（Tβ4）通过调控血小板衍生生长因子（PDGF）表达及诱导肝星状细胞（HSC）凋亡，对四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化小鼠模型的干预作用与潜在机制，为临床抗肝纤维化治疗提供新的实验依据。 方法 选取30只雄性C57小鼠，随机分为正常对照组、模型组，以及Tβ4低（3 mg/kg）、中（6 mg/kg）和高（12 mg/kg）剂量治疗组，每组6只。正常对照组自由摄食普通饲料，其余各组腹腔注射50% CCl₄与橄榄油混合液建立肝纤维化模型，经超声及病理学验证造模成功后，对各治疗组小鼠连续皮下注射Tβ4干预4周。实验结束后取肝组织行苏木精-伊红及Masson染色观察组织病理变化，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测血PDGF mRNA表达，原位末端转移酶标记（TUNEL）法检测HSC凋亡情况。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与模型组比较，Tβ4中、高剂量治疗组小鼠肝纤维化程度均呈现不同程度的减轻。实时荧光定量聚合酶链反应结果显示，Tβ4可显著下调肝组织中PDGF mRNA表达，各剂量治疗组间差异有统计学意义（P<0.05）；Tβ4高剂量组与正常对照组PDGF mRNA表达差异无统计学意义（P<0.05）。TUNEL检测结果显示，Tβ4中、高剂量组HSC凋亡数量显著多于模型组。 结论 Tβ4可能通过抑制PDGF表达和促进HSC凋亡，从而改善CCl₄诱导的小鼠肝纤维化，提示其在肝纤维化治疗中具有潜在应用价值。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic effect and potential mechanism of thymosin β4 （Tβ4） on carbon tetrachloride （CCl₄）-induced hepatic fibrosis by regulating the expression of platelet-derived growth factor （PDGF） and inducing the apoptosis of hepatic stellate cell （HSC）， and to provide new experimental evidence for anti-hepatic fibrosis treatment in clinical practice. Methods A total of 30 male C57 mice were randomly divided into normal control group， model group， low-dose Tβ4 treatment group （3 mg/kg）， middle-dose Tβ4 treatment group （6 mg/kg）， and high-dose Tβ4 treatment group （12 mg/kg）， with 6 mice in each group. The mice in the normal control group were fed with a normal diet ad libitum， and those in the other groups were given intraperitoneal injection of 50% CCl₄ mixed with olive oil to establish a model of hepatic fibrosis. After successful modeling confirmed by ultrasound and histopathology， the mice in each treatment group were given subcutaneous injection of Tβ4 for 4 consecutive weeks. Liver tissue was collected at the end of the experiment， and HE staining and Masson staining were used to observe histopathological changes； quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression level of PDGF； TUNEL assay was used to assess the apoptosis of HSC. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the model group， the middle- and high-dose Tβ4 treatment groups had varying degrees of alleviation of hepatic fibrosis. Quantitative real-time PCR showed that Tβ4 could significantly downregulate the mRNA expression level of PDGF in liver tissue， with a significant difference between the treatment groups （P>0.05）， and there was no significant difference in the mRNA expression level of PDGF between the high-dose Tβ4 treatment group and the normal control group （P>0.05）. TUNEL assay showed that the middle- and high-dose Tβ4 treatment groups had a significantly higher number of apoptotic HSCs than the model group. Conclusion Tβ4 may improve CCl₄-induced hepatic fibrosis in mice by downregulating the expression of PDGF and promoting the apoptosis of HSC， suggesting that it has a potential application value in the treatment of hepatic fibrosis.

Graphical abstract

关键词

肝纤维化 / 胸腺素β4 / 小鼠， 近交C57BL

Key words

Hepatic Fibrosis / Thymosin Beta 4 / Mice， Inbred C57BL

肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理过程，其病理特征为细胞外基质（extracellular matrix， ECM）异常增生与过度沉积^［1-4］。在肝纤维化进程中，血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）被认为是肝星状细胞（hepatic stellate cell， HSC）活化和迁移的关键因子，可促进ECM合成，加快纤维化进展^［5］。近年研究发现，胸腺素β4（thymosin beta 4， Tβ4）在心肌和肾脏纤维化中具有良好的抑制作用，并可降低炎症反应水平^［6-10］。尽管Tβ4在其他组织中的抗纤维化效果已有报道^［11-15］，但其对肝纤维化是否具有改善作用尚未明确。为此，本研究通过构建四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化小鼠模型，观察Tβ4对PDGF表达和HSC凋亡的影响，旨在初步探讨其对肝纤维化的干预作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

主要仪器包括TGL20M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，中国），TG-16-W型高速离心机（湖南湘立科学仪器有限公司，中国），QuantStudio5实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）仪（ABI公司，德国），ProFlex PCR扩增仪（Life公司，美国），核酸提取仪TGuide S16［天根生化科技（北京）有限公司，中国］，BX53荧光显微镜及正置显微镜（Olympus公司，美国），微量分光光度计（Quawell公司，美国），以及AppendixⅢ型超声仪（西门子公司，德国）。

1.2 实验试剂

总RNA提取试剂盒［DP405，天根生化科技（北京）有限公司，中国］，逆转录试剂盒（#K1622，Thermo公司，美国），定量PCR预混液［FP207，天根生化科技（北京）有限公司，中国］，原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling， TUNEL）法检测试剂盒（KGA7051，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国），苏木精-伊红（hematoxylin and eosin， HE）染色试剂盒（G1120，北京索莱宝科技有限公司，中国）以及Masson染色试剂盒（PT003，上海博谷生物科技有限公司，中国）。

1.3 实验动物

30只无特定病原体（special pathogen free， SPF）级雄性C57小鼠饲养于SPF动物房，室温20～22 ℃，湿度50%±2%，12 h/12 h明暗周期，分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养。实验动物生产许可证编号为SCXK（湘）2024-0008，实验动物使用许可证编号为SYXK（贵）2024-0005。

1.4 分组与造模

采用随机数字表法将小鼠分为以下5组：正常对照组（阴性对照）、模型组、Tβ4高剂量（12 mg/kg）组、Tβ4中剂量（6 mg/kg）组及Tβ4低剂量（3 mg/kg）组，每组6只，均适应性喂养1周。模型组及Tβ4治疗组均以高脂饲料和10%酒精喂养，1周后腹腔注射50% CCl₄与橄榄油混合液10 μL/g^［16］，每3日1次，连续8周；正常对照组给予普通饲料及饮水。

1.5 超声检查

1.5.1 仪器参数设置

采用SC6-1凸阵探头，频率1～6 MHz，图像深度8 cm，图像放大至120%，弹性成像取样框为4 cm×3 cm，测量感兴趣区（region of interest， ROI）直径为20 mm，弹性测量SCALE为40 kPa。二维图像与弹性图像上下排列，弹性成像取样框置于图像中央。

1.5.2 检测方法

（1）二维超声：于小鼠右肋间选择右肝前叶或后叶下段切面，将图像显示清晰，避开肝内粗大管道结构，测量皮肤至肝包膜距离，保存图像并在图像上标记文字。（2）弹性成像：进入超声实时剪切波弹性成像模式，在二维超声图像的引导下，将弹性成像取样框上缘置于肝包膜下1 cm处，待弹性图像稳定后冻结图像，进行弹性模量测量，记录ROI内的均值（单位：kPa）。解冻后重新进行弹性图像及测量，共检测5次，分别保存图像并在每张图像上标记文字。

1.6 给药

参考文献［17］，造模8周后，小鼠呈现肝纤维化。按高（12 mg/kg）、中（6 mg/kg）、低（3 mg/kg）剂量分别予肝纤维化小鼠皮下注射Tβ4，每日1次，连续注射4周。

1.7 取材

最后1次给药3天后，使用1%戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠处死。随后取各组小鼠肝组织的一部分置于包埋盒后用多聚甲醛固定，再取部分肝组织分装放入无菌冻存管中，于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.8 组织病理染色

1.8.1 HE染色

滴加苏木精染液，染色2 min，浸入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）以去除染色液。随后滴加0.4%的稀盐酸分化10 s，观察到颜色略淡。用自来水（蒸馏水）终止分化。滴加伊红染液充分覆盖组织，染色45 s。PBS漂洗2次，每次5 min。

1.8.2 Masson染色

（1）将切片分别浸泡于二甲苯Ⅰ和Ⅱ溶液中，每种溶液持续20 min，然后再分别浸泡于无水乙醇Ⅰ和Ⅱ溶液中10 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、75%乙醇5 min，最后放入超纯水中，清洗约5 min。（2）使用Weigert铁苏木精染色5 min，然后将其浸泡在1%的氯化氢乙醇中，以分化切片，最后再以蒸馏水对其进行数分钟的清洗，以确保其质量。（3）使用丽春红酸性品红溶液染色切片，然后在5～10 min内用清水彻底冲洗。（4）对切片用磷钼酸溶液进行染色，5 min后用蒸馏水进行冲洗。（5）用苯胺蓝液复染5 min。（6）用1%的乙酸对切片进行1 min的分化处理。（7）对切片进行脱水并用中性树胶进行封片。

1.9 检测

1.9.1 RNA提取

（1）取肝组织30 mg，加入1 mL TRNzol，匀浆处理。（2）匀浆后置于室温5 min。（3）加入0.2 mL三氯甲烷，剧烈振荡20 s，置于室温5 min。（4）于4 ℃条件下12 000×g离心15 min，样品会分成3层：下沉黄色为有机相，上两层为没有颜色的水相，RNA分布在水相中，将水相（600 μL左右）再倒入离心管中。（5）加入250 μL无水乙醇后，振荡20 s，摇匀后放在室温下5 min；瞬时离心收集黏附在管壁和管盖的液体。（6）将离心管中的溶液和絮状沉淀转移到吸附柱CR2中，再将吸附柱放在收集管内，8 000×g离心1 min，弃废液后将吸附柱放回收集管。（7）加入500 μL洗涤缓冲液，12 000×g离心1 min，弃废液，加入600 μL洗脱缓冲液，室温静置2 min，12 000×g离心1 min，弃废液，将吸附柱放回收集管。（8）重复（7）步骤1次。将吸附柱放回收集管中，12 000×g离心2 min，使吸附膜完全变干后弃废液。（9）将吸附柱放入RNase-Free离心管中，置于室温2 min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μL RNase-Free ddH₂O，加盖，室温放置5 min。12 000×g离心2 min。

1.9.2 单链互补DNA（complementary DNA， cDNA）合成

根据Thermo逆转录试剂盒说明书将上述总RNA以2 µL（浓度2 µg/µL）为模板进行反应。反应条件：25 ℃ 10 min，48 ℃ 60 min，94 ℃ 5 min。

1.9.3 实时荧光定量PCR扩增

取各组肝组织提取总RNA，逆转录合成cDNA，并用特异性引物扩增PDGF和β-actin等各项指标基因片段。基因扩增引物设计：依照PCR引物设计原则和GenBank中检索的PDGF基因序列设计扩增引物，引物合成由上海生工公司完成。

β-actin基因：上游引物为5′-ACTGCTCTGGCTCCTA-GCAC-3′，下游引物为5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；PDGF基因：上游引物为5′-AAGCAGCCTCAGAGACC-AAC-3′，下游引物为5′-AACCACAGTTGCCACCACAG-3′。

1.9.4 基因扩增

以上述cDNA为模板克隆β-actin、PDGF基因，同时设置不加模板的阴性对照。PCR扩增条件：45 ℃ 10 min、95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 40 s采集荧光，40个循环。熔解条件：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。

1.10 肝组织切片TUNEL法检测HSC凋亡

（1）固定或前处理：取肝组织脱水、浸蜡、石蜡包埋、常规制片，4 μm切片。（2）通透：配制Proteinase K工作液，滴加工作液100 µL、37 ℃反应5 min，PBS洗涤3次。（3）封闭：配制3% H₂O₂封闭液，浸入封闭液10 min，PBS洗涤3次。（4）制阳性片：配制100 µL DNase Ⅰ反应液，滴加DNase Ⅰ反应液室温处理10～30 min，PBS洗涤3次。（5）连接异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）标记：配制末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase， TdT）反应液，滴加反应液避光显色60 min，PBS洗涤3次；配制streptavidin-FITC标记工作液，滴加工作液50 µL、37 ℃避光反应30 min，PBS洗涤3次，荧光显微镜检测。（6）3，3'-二氨基联苯胺（3，3'-diaminobenzidine， DAB）标记：配制POD-conjugated Anti-FITC工作液，滴加工作液50 µL，加上盖玻片后37 ℃避光反应30 min，PBS洗涤3次。（7）显色：配制DAB工作液，滴加工作液50 µL室温显色反应1～5 min，PBS洗涤3次。（8）复染：苏木精复染，在Olympus光学显微镜下观察。

1.11 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据分析。所有数据首先进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的计量资料以\overline{x}±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物观察

在未注射CCl₄诱导肝纤维化前，小鼠皮毛色泽光亮，毛发柔软，性情温和。注射CCl₄之后，小鼠皮毛色泽灰暗，毛发竖立，烦躁好斗。

2.2 超声检查

二维超声显示，正常对照组小鼠肝脏平均前后径为（0.57±0.05） cm，肝实质表现为均匀一致的弥漫细小点状中等回声；造模8周后小鼠肝脏平均前后径为（0.92±0.07） cm，肝脏体积增大，肝实质回声增粗、增强，呈不均匀密集点片状分布。弹性成像显示，正常对照组小鼠肝组织硬度小，成像近似黑色，其平均弹性模量值为（1.00±0.08） kPa；造模8周后小鼠肝脏硬度显著增高，成像为蓝绿色，其平均弹性模量值为（24.4±2.2） kPa。造模小鼠二维超声与弹性成像变化情况见图1。

2.3 病理HE染色结果

Tβ4治疗4周后，肝脏HE染色显示（图2）：正常对照组小鼠肝小叶结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞互相连接成条索状，形成肝细胞索，汇管区及肝组织内均无胶原纤维增生；模型组小鼠肝实质广泛破坏，小叶内肝细胞结构紊乱，汇管区弥漫性纤维增生，胶原纤维呈条索状向肝实质延伸形成纤维间隔，分割并破坏肝小叶，少部分小鼠甚至形成假小叶；Tβ4低剂量组纤维化程度较模型组无明显改变；Tβ4中、高剂量组肝小叶结构大部分保留，有桥接纤维化形成，恢复效果佳。

2.4 Masson染色结果

Tβ4治疗4周后，肝脏Masson染色显示（图3）：正常对照组小鼠肝脏有少量蓝色的胶原纤维；模型组小鼠肝组织胶原纤维明显增生、宽大，延伸分布于肝小叶内，肝小叶结构破坏，部分严重区域形成假小叶；Tβ4低剂量组胶原纤维表达较模型组无明显改变；Tβ4中、高剂量组小鼠增生的胶原纤维明显减少、变细，部分向肝小叶延伸。

2.5 小鼠肝组织PDGF mRNA相对表达量

实时荧光定量PCR检测结果显示，模型组小鼠PDGF mRNA表达明显高于正常对照组（P<0.05）；与模型组相比，Tβ4低、中、高剂量组PDGF mRNA表达均降低，差异均有统计学意义（P值均<0.05）。不同Tβ4剂量组之间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；随着Tβ4剂量升高，PDGF表达下降越明显，Tβ4高剂量组的抑制效果优于中、低剂量组。Tβ4高剂量组与正常对照组相比，PDGF mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。

2.6 细胞凋亡检测结果

2.6.1 荧光凋亡结果

各组小鼠肝组织荧光凋亡结果显示，正常对照组有部分细胞生理性凋亡；模型组由于细胞正常代谢，有少量细胞凋亡；Tβ4低、中、高剂量组与正常对照组和模型组相比，其凋亡细胞明显增加，中剂量组与高剂量组尤为明显（图5）。

2.6.2 化学凋亡结果

Tβ4治疗4周后肝脏染色显示，正常对照组小鼠肝脏有少量细胞凋亡；模型组小鼠肝组织有大量细胞凋亡；Tβ4中、高剂量组凋亡细胞较模型组无明显改变，Tβ4低剂量组凋亡细胞明显少于中、高剂量组（图6）。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的关键病理过程，其特征是ECM的过度沉积，而活化的HSC是产生ECM的主要细胞来源^［18-19］。HSC的活化和增殖被认为是肝纤维化形成的核心环节，其受到多种细胞因子的调控，其中PDGF是作用最强的促有丝分裂原^［20-21］。近年来，靶向HSC活化与增殖已成为抗纤维化治疗的重要策略。因此，探索能够抑制PDGF信号通路或诱导HSC凋亡的药物已成为抗纤维化研究的热点。

Tβ4作为一种多功能蛋白，已被证实可在心肌、肾脏和肺纤维化模型中，通过抗炎、抗凋亡和调节细胞骨架等机制发挥保护作用^{［6-10，13-14］}。然而，既往研究多集中于Tβ4在非肝脏纤维化中的作用，其在肝纤维化中的具体效应及机制尚不明确。本研究创新性地将Tβ4应用于CCl₄诱导的肝纤维化小鼠模型，评估了其整体的抗纤维化效果，同时从抑制活化关键因子和促进活化细胞凋亡两个相互关联的视角，探讨了其潜在作用机制，旨在为肝纤维化的治疗提供新的实验依据和候选策略。

本研究发现，Tβ4干预可明显减轻CCl₄诱导的小鼠肝纤维化。该研究结果与Zhu等^［15］研究发现部分一致，该研究报道Tβ4可通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路抑制HSC增殖并诱导其凋亡。本研究在其基础上进一步深化，不仅证实了Tβ4具有促HSC凋亡效应，还发现其能显著抑制上游关键促纤维化因子PDGF的表达。这表明Tβ4可能通过多靶点、多环节发挥协同抗纤维化作用：一方面可以切断HSC活化的“启动信号”（PDGF），另一方面可以清除已活化的“效应细胞”（HSC）。这种同时针对“信号源”和“终末细胞”的作用模式，可能是其表现出显著疗效的重要机制。

此外，TUNEL检测结果显示，Tβ4干预（尤其是中、高剂量组）可显著促进肝组织中细胞凋亡，且形态特征典型，提示其可能通过诱导活化HSC凋亡，减少其ECM合成能力，从而缓解肝纤维化进程。相关研究表明，Tβ4可通过调节细胞骨架重构、抑制炎症因子释放和氧化应激反应发挥抗纤维化作用^［22-24］。但其具体分子机制有待深入探讨，例如是否涉及蛋白激酶B、转化生长因子β/Smad等经典信号通路。本研究的实验结果为Tβ4的抗肝纤维化效应提供了初步的、提示性的表型证据。

综上所述，本研究证实了Tβ4对CCl₄诱导的小鼠肝纤维化具有明确的改善作用，并提出其作用机制可能与下调肝组织PDGF表达和诱导HSC凋亡密切相关。这一发现将Tβ4的抗纤维化应用从心、肾和肺等脏器拓展至肝脏，填补了Tβ4在肝纤维化研究中机制探索的空白，为其作为肝纤维化治疗候选药物的转化研究提供了新的实验依据。

然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，主要关注了上游因子PDGF，未来研究应检测α-平滑肌肌动蛋白、α-1型胶原蛋白等更直接的效应指标以全面验证疗效。其次，本研究主要基于mRNA水平，需在蛋白水平进一步证实。此外，在细胞凋亡检测部分，目前仅停留在荧光显微图片定性判断上，结果的精确性受到限制，未来将采用定量方法以获得更可靠的数据。最后，由于缺乏细胞水平的实验证据，目前难以明确Tβ4是直接还是间接作用于HSC，其精确的分子信号通路有待进一步阐明。

尽管存在上述局限性，本研究结果仍然具有重要的指示意义和科学价值，创新性地将Tβ4的抗纤维化效应拓展至肝脏领域，并提出了其潜在作用靶点（PDGF和HSC），为后续深入机制研究提供了明确的方向和坚实的实验基础。未来研究将围绕上述问题展开，并深入探究其是否调控蛋白激酶B、转化生长因子β/Smad等下游信号通路，以完整揭示Tβ4的作用网络，为临床抗肝纤维化治疗提供新靶点与新策略。

伦理学声明

本研究方案于2024年7月14日经由北京积水潭医院贵州医院实验动物伦理委员会审批，批号：KT2024071535，符合实验室动物管理与使用准则。

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