Wnt5a基因敲低的M1型骨髓源性巨噬细胞对肝硬化大鼠模型的影响及其作用机制

Effect and mechanism of Wnt5a knockdown on the efficacy of M1 bone marrow-derived macrophage in treatment of liver cirrhosis

摘要

目的 本研究通过观察Wnt5a基因敲低的M1型骨髓源性巨噬细胞（BMDM）对肝硬化大鼠模型肝纤维化与再生的影响，旨在揭示其相对于未修饰M1-BMDM的功能增益效应。 方法 分离大鼠原代BMDM并极化为M1表型，构建Wnt5a敲低的M1-BMDM。建立四氯化碳/二乙酰氨基芴（CCl₄/2-AAF）诱导的肝硬化大鼠模型，于第8周末随机分为模型组（n=6）、M1-BMDM组（n=6）、M1-BMDM Wnt5a基因敲减空载质粒组（M1-BMDM^KD-EV组）（n=6）、M1-BMDM Wnt5a基因敲减组（M1-BMDM^Wnt5a-KD组）（n=6）。第9周首日，各组大鼠予以相应的细胞经尾静脉一次性注射，同时腹腔注射C-C趋化因子受体2型抑制剂。此外，设立未经任何处理的正常对照组（n=6）。于12周末取材，检测肝组织病理、血清肝功能、活化肝星状细胞以及成熟肝细胞标志物的表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。 结果 与模型组大鼠比较，各细胞治疗组大鼠肝脏炎症反应明显减轻，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性均显著降低（P值均<0.01），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组血清AST水平显著低于M1-BMDM组（P<0.05）。免疫组织化学染色半定量分析显示，与模型组比较，各细胞治疗组CD68阳性面积百分比均明显减少（P值均<0.05）；与M1-BMDM^KD-EV相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD组CD68阳性面积百分比显著下降、CD163的阳性面积百分比显著升高（P值均<0.05）。与模型组比较，各细胞治疗组的CD68及肿瘤坏死因子α的mRNA表达显著降低（P值均<0.05），CD68的蛋白表达显著降低（P值均<0.01）；与M1-BMDM^KD-EV组比较，M1-BMDM^Wnt5a-KD组CD163蛋白及mRNA表达均显著升高（P值均<0.05），CD68蛋白及mRNA表达显著降低（P值均<0.05），肿瘤坏死因子α的蛋白表达显著降低（P<0.01）。天狼星红胶原染色和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的免疫组织化学染色结果显示，与模型组比较，各细胞治疗组肝脏胶原沉积和α-SMA阳性面积明显减轻，尤以M1-BMDM^Wnt5a-KD组最为显著；且M1-BMDM^Wnt5a-KD组天狼星红阳性面积、α-SMA阳性面积和肝组织羟脯氨酸（Hyp）含量亦显著低于M1-BMDM^KD-EV组（P值均<0.05）。与M1-BMDM^KD-EV组相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD组α-SMA蛋白和mRNA以及Ⅰ型胶原蛋白和转化生长因子β的mRNA表达水平显著降低（P值均<0.05）。与模型组比较，各细胞治疗组肝组织肝细胞核因子4α（HNF-4α）蛋白表达显著升高（P值均<0.05），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组HNF-4α和肝细胞特异性抗原的蛋白与mRNA的表达均显著高于M1-BMDM^KD-EV组（P值均<0.05）。M1-BMDM^Wnt5a-KD组血清白蛋白含量亦显著高于M1-BMDM^KD-EV组（P<0.01）。免疫荧光共染检测技术显示，与模型组相比，各细胞治疗组HNF-4α/Ki67共染细胞数量显著增多（P值均<0.01），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组HNF-4α/Ki67共染细胞数量显著高于M1-BMDM^KD-EV组（P<0.05）。 结论 抑制Wnt5a表达可提高M1-BMDM治疗CCl₄/2-AAF诱导肝硬化大鼠模型的效果，为基因修饰提高M1-BMDM抗肝硬化作用提供了新思路。

Abstract

Objective To observe the effect of M1 bone marrow-derived macrophages （M1-BMDM） with Wnt5a knockdown on liver fibrosis and regeneration in a rat model of liver cirrhosis， and to investigate its gain-of-function effect compared with unmodified M1-BMDM. Methods Primary bone marrow-derived macrophages were isolated from rats and were polarized to M1 phenotype to construct M1-BMDM^Wnt5a-KD cells. A rat model of liver cirrhosis induced by CCl₄/2-AAF was established， and at the end of week 8， rats were randomly divided into model group， M1-BMDM group， M1-BMDM Wnt5a-knockdown empty vector group （M1-BMDM^KD-EV group）， and M1-BMDM Wnt5a-knockdown group （M1-BMDM^Wnt5a-KD group）， with 6 rats in each group. On the first day of week 9， the rats in each group were given a single injection of the corresponding cells via the caudal vein， along with an intraperitoneal injection of a CCR2 inhibitor. Six rats without any treatment were used as normal control group. Samples were collected at the end of week 12 to assess liver histopathology， serum liver function parameters， hepatic stellate cell activation， and the expression levels of mature hepatocyte markers. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results Compared with the model group， all cell treatment groups had significant alleviation of liver inflammatory response and significant reductions in the activities of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase （AST） in serum （all P<0.01）， and the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had a significantly lower serum level of AST than the M1-BMDM group （P<0.05）. The semi-quantitative analysis based on immunohistochemical staining showed that compared with the model group， all cell treatment groups had a significant reduction in the percentage of CD68-positive area （all P<0.05）， and compared with the M1-BMDM^KD-EV group， the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had a significant reduction in the percentage of CD68-positive area and a significant increase in the percentage of CD163-positive area （both P<0.05）. Compared with the model group， all cell treatment groups had significant reductions in the mRNA expression levels of CD68 and tumor necrosis factor-α （all P<0.05） and the protein expression level of CD68 （all P<0.01）； compared with the M1-BMDM^KD-EV group， the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had significant increases in the protein and mRNA expression levels of CD163 （both P<0.05）， significant reductions in the protein and mRNA expression levels of CD68 （both P<0.05）， and a significant reduction in the protein expression level of tumor necrosis factor-α （P<0.01）. Sirius Red collagen staining and alpha-smooth muscle actin （α-SMA） immunohistochemical staining showed that compared with the model group， all cell treatment groups had significant alleviation of liver collagen deposition and α-SMA-positive area， with the most significant changes in the M1-BMDM^Wnt5a-KD group， and compared with the M1-BMDM^KD-EV group， the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had significantly smaller Sirius Red-positive area and α-SMA-positive area and a significantly lower content of hydroxyproline in liver tissue （all P<0.05）. Compared with the M1-BMDM^KD-EV group， the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had significant reductions in the protein and mRNA expression levels of α-SMA and the mRNA expression level of COL-I and TGF-β （all P<0.05）. Compared with the model group， all cell treatment groups had a significant increase in the protein expression level of HNF-4α in liver tissue （all P<0.05）， and the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had significantly higher protein and mRNA expression levels of HNF-4α and hepatocyte specific antigen than the M1-BMDM^KD-EV group （both P<0.05）. The M1-BMDM^Wnt5a-KD group had a significantly higher serum level of albumin than the M1-BMDM^KD-EV group （P<0.01）. Immunofluorescence co-staining showed that compared with the model group， all cell treatment groups had a significant increase in the number of cells stained positive for HNF and HNF-4α and Ki67 （all P<0.01）， and the M1-BMDM^Wnt5a-KD group had a significantly higher number of such cells than the M1-BMDM^KD-EV group （P<0.05）. Conclusion Inhibition of Wnt5a expression enhances the therapeutic effect of M1-BMDM on rats with liver cirrhosis induced by CCl₄/2-AAF， which provides new ideas for enhancing the anti-cirrhotic effect of M1-BMDM through genetic modification.

Graphical abstract

关键词

肝硬化 / 骨髓源性巨噬细胞 / Wnt5a蛋白 / 肝星状细胞 / 肝再生 / 大鼠， Wistar

Key words

Liver Cirrhosis / Bone Marrow-Derived Macrophage / Wnt-5a Protein / Hepatic Stellate Cells / Liver Regeneration / Rats， Wistar

肝硬化是多种慢性肝病发展的晚期阶段^［1］。在其发展过程中，肝细胞持续受损并发生坏死，同时伴随纤维组织过度增生和假小叶形成，导致肝脏正常结构破坏和功能丧失^［2］。巨噬细胞是肝纤维化发生和消退过程中的关键免疫细胞，目前已有多种蛋白被开发用于靶向内源性巨噬细胞（又称为库普弗细胞）的功能^［3］。此外，外源性巨噬细胞移植也是调节肝脏微环境的一种替代疗法。已有研究表明，骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）经尾静脉注射，能够减轻四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化小鼠的肝脏胶原沉积、抑制肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化、改善肝功能，从而缓解肝纤维化进展^［4］。值得注意的是，经典极化的巨噬细胞可能提供更优的疗效或安全性，这可能与极化的细胞群体在表型上更稳定均匀相关^［5］。

本课题组前期研究表明，在CCl₄/二乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene，2-AAF）诱导的肝硬化大鼠模型中，Wnt5a/Fzd2信号通路可能发挥重要作用^［6］。Wnt5a是非经典Wnt信号通路中的配体之一，可调节造血、间充质和神经干细胞的功能^［7-9］。研究表明，巨噬细胞是分泌Wnt的主要效应细胞，其中M1-BMDM可分泌肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等炎症因子激活非典型Wnt信号通路^［10］。但本课题组前期研究结果表明，M1-BMDM注射后具有良好的抗肝纤维化作用^［11］，这与文献报道一致^［5］。但Wnt5a基因表达水平是否会影响M1-BMDM的抗肝纤维化作用，目前尚不明确。基于此，本研究拟通过尾静脉注射Wnt5a基因敲减的M1-BMDM至大鼠模型体内，探究其对肝硬化进展的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RPMI 1640细胞培养基（货号：118775085）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（货号：0412265）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（货号：ST1470）购于赛默飞世尔科技公司（美国）；Wnt5a慢病毒（lentivirus，LV）转染试剂由上海吉凯基因科技有限公司（中国）合成；2-AAF（货号：A-1075）购于西格玛-奥德里奇有限公司（美国）；C-C趋化因子受体2（CC chemokine receptor 2，CCR2）抑制剂（货号：RS-102895）购于CSNpharm公司（美国）；α-平滑肌肌动蛋白抗体（α-smooth muscle actin，α-SMA）（货号：ab124964）、CD68抗体（货号：a125212）、TNF-α抗体（货号：ab205587）、Ki67抗体（货号：ab279653）和肝细胞核因子4α抗体（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF-4α）（货号：ab201460）均购于Abcam公司（英国）；小鼠抗肝细胞特异性抗原（hepatocyte specific antigen，Hep）（货号：GTX73779）单克隆抗体购于GeneTex公司（美国）；Wnt5a（货号：sc-365370）购于Santa Cruz公司（美国）；CD163（货号：16646-1-AP）、GAPDH（货号：10494-1-AP）购于武汉三鹰生物技术有限公司。Think color-3色Rab多标试剂盒（货号：20240516）购于南京弗瑞思生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。携带增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein，EGFP）标记的慢病毒载体LV-Wnt5a-RNAi（编号：92640-1，滴度：1×10⁹ TU/mL）及空载体对照慢病毒（编号：CON313，滴度：8×10⁸ TU/mL）均由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。LV-Wnt5a-RNAi的靶序列为5′-TGCCATGTCTTCCAAGTTCTT-3′。

1.2 实验动物

选用30只无特定病原体级雄性Wistar大鼠（160 ~ 180 g），购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证编号：SCXK（沪）2022-0004，实验动物使用许可证编号：SYXK（沪）2017-0005，于上海中医药大学实验动物中心进行饲养造模。

1.3 BMDM的处理

参考Haag等^［12］的研究方法分离大鼠原代BMDM，分为不经LPS处理的BMDM（未处理组）和经100 ng/mL LPS极化的M1表型BMDM（处理组），并进行鉴定。根据预实验结果，选择适宜的感染复数对M1表型BMDM进行转染，分为敲减空载质粒组和Wnt5a敲减组。转染4 h后更换为正常培养液；转染48 h后，于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及EGFP荧光表达情况；转染72 h后，分别提取细胞总RNA和总蛋白，用于检测慢病毒转染后目标基因及蛋白的表达水平。

1.4 大鼠模型制备与分组干预

所有大鼠适应性饲养1周后，随机分为正常对照组（N组）（n=6）和肝硬化造模组（n=24）。正常对照组正常喂养，不作任何处理。造模组大鼠经皮下注射50% CCl₄-橄榄油溶液（2 mL/kg），2次/周；第8周末，按大鼠体重随机分为模型组（M组）、M1-BMDM组、M1-BMDM Wnt5a基因敲减空载质粒组（M1-BMDM^KD-EV组）、M1-BMDM Wnt5a基因敲减组（M1-BMDM^Wnt5a-KD组），每组6只。在第9周第1天，分别将M1-BMDM、M1-BMDM^KD-EV、M1-BMDM^Wnt5a-KD细胞经尾静脉单次注射至相应组别的大鼠体内，注射剂量为1×10⁶ cells/只；M组大鼠正常喂养，不作处理。第9~12周予以M组、M1-BMDM组、M1-BMDM^KD-EV组、M1-BMDM^Wnt5a-KD组大鼠肝毒性致癌物2-AAF（10 mg·kg^-1·d^-1）灌胃用以抑制肝细胞再生，腹腔注射CCR2抑制剂（5 mg·kg⁻¹·d⁻¹）以阻断外周巨噬细胞向肝脏募集，于第12周末取材。N组不作任何处理。

1.5 血清生化指标检测

天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine amino-transferase， ALT）和白蛋白（albumin，Alb）等在上海中医药大学附属曙光医院临床医学检验中心检测。

1.6 肝组织Hyp含量测定

根据试剂盒说明书，采用碱水解法测定肝组织Hyp含量^［13］。

1.7 肝组织病理和免疫组织化学分析

肝组织石蜡切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，分别进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、天狼星红染色或免疫组织化学分析。天狼星红及HE染色切片利用数字病理分析系统采集图像［数字病理切片扫描仪（江丰生物信息技术有限公司）］，Image Scope软件定量分析胶原阳性区域占比；免疫组织化学切片经一抗α-SMA（1∶400）、CD68（1∶800）、CD163（1∶200）、HNF-4α（1∶1 000）、Hep（1∶100）4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）孵育30 min，二氨基联苯胺显色，封片，如上扫描，ImageJ 1.8.0软件进行阳性表达面积的半定量分析。

1.8 肝组织免疫荧光染色

根据Think color-3色Rab多标试剂盒说明书进行染色，细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（1∶1 000）染色。封片后，使用激光扫描共聚焦显微镜（FV10i，日本Olympus公司）采集图像。

1.9 细胞免疫荧光

4%多聚甲醛固定细胞，10%山羊血清封闭，抗CD68（1∶1 000）进行孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000）孵育，室温孵育1 h，细胞核采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（1∶1 000）染色，激光扫描共聚焦显微镜采集图像。

1.10 实时荧光定量聚合酶链反应

采用RNA纯化试剂盒（货号：Lot.360502，Toyobo公司）提取总RNA，按标准流程操作。使用SYBR Green PCR Master Mix预混体系，包含1 μL cDNA，于384孔板中加样，ViiA™ 7 real-time PCR System检测目标mRNA表达水平。检测指标为CD86、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、TNF-α、白细胞介素（interleukin， IL）12β、Wnt5a、CD11b、CD11c、CD163、CD68、α-SMA、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β、Ⅰ型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，COL-Ⅰ）、HNF-4α和Hep。

1.11 免疫印迹

取肝组织50 mg经RIPA裂解后于4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，收集蛋白上清。以BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白经10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜。用快速封闭液室温封闭30 min，4 ℃孵育一抗过夜、室温孵育二抗1 h。采用ECL化学发光显影，目标蛋白条带灰度值通过ImageJ分析，并以GAPDH作为内参校正。一抗稀释比例为：Wnt5a（1∶1 000）、α-SMA（1∶5 000）、CD68（1∶1 000）、TNF-α（1∶500）、CD163（1∶500）、HNF-4α（1∶1 000）、Hep（1∶200）和GAPDH（1∶10 000）。

1.12 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据分析。计量资料以\overline{x}±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代BMDM分离、M1极化及鉴定

细胞形态学观察显示，处理组细胞呈现活化状态：贴壁生长特性良好，胞体伸展形成多极伪足（图1a）。免疫荧光显示，未处理组细胞高表达CD68（图1b）。与未处理组比较，处理组细胞标志物CD86、iNOS、IL-12β和TNF-α的mRNA表达均显著上升（P值均<0.05）（图1c），表明M1-BMDM达到实验要求。

进一步采用EGFP标记的LV转染M1-BMDM以敲减Wnt5a基因。当感染复数为30时，慢病毒成功转染至M1-BMDM（图1d）。与未处理组比较，处理组细胞Wnt5a蛋白和mRNA表达水平均显著升高（P值均<0.01）；与敲减空载质粒组细胞比，Wnt5a敲减组细胞Wnt5a的表达水平均显著降低（P值均<0.01）（图1d），提示M1-BMDM中Wnt5a基因敲减成功。

2.2 Wnt5a敲低提高M1-BMDM抑制肝脏炎症反应的作用

HE染色结果显示，M组大鼠肝组织呈现大面积损伤坏死，汇管区伴有密集炎症浸润。相较于M组，各细胞干预组均能显著减轻肝脏炎症反应并缩小纤维间隔宽度，其中M1-BMDM^Wnt5a-KD组的改善效果最为显著（图2a）。免疫组织化学染色分析表明，与M组比较，各细胞治疗组CD68阳性面积百分比明显减少（P值均<0.05）；与M1-BMDM^KD-EV相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD组CD68阳性面积百分比显著下降、CD163的阳性面积百分比显著升高（P值均<0.05）（图2b～d）。血清学分析显示，各干预组血清ALT和AST水平均显著低于M组（P值均<0.01），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组在降低AST水平方面显著优于M1-BMDM组（P<0.05）（图2e）。

免疫印迹结果进一步证实，相较于M组，各细胞治疗组CD68蛋白表达均显著降低（P均值<0.01）；与M1-BMDM^EV-KD组相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD组CD68和TNF-α蛋白表达显著降低（P值均<0.05），CD163蛋白表达显著升高（P<0.05）（图3a）。M1-BMDM^Wnt5a-KD组CD68的mRNA表达显著低于M1-BMDM^EV-KD组（P<0.05），CD163的mRNA表达显著高于M1-BMDM^EV-KD组（P<0.05），CD11b和CD11c的mRNA表达水平均显著低于M1-BMDM^EV-KD组（P值均<0.01）（图3b）。

2.3 Wnt5a敲低提高M1-BMDM的抗肝纤维化作用

天狼星红染色结果显示，M组肝组织存在广泛胶原纤维增生及完整假小叶结构；各细胞干预组胶原沉积较M组明显减少，其中M1-BMDM^Wnt5a-KD组最为明显（图4a）。半定量分析结果亦显示，各细胞治疗组天狼星红阳性面积均显著低于M组（P值均<0.05），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组显著低于M1-BMDM^KD-EV组（P<0.05）（图4c）。免疫组织化学结果显示，与M组相比，各细胞治疗组的肝组织中HSC活化标志物α-SMA的表达均明显减少，尤以M1-BMDM^Wnt5a-KD组最为显著（P<0.05）（图4b、d）。M1-BMDM组Hyp含量较M组显著降低（P<0.01），而M1-BMDM^Wnt5a-KD组Hyp含量进一步低于M1-BMDM^KD-EV组（P<0.05）（图4e）。

免疫印迹和实时荧光定量聚合酶链反应结果显示，与N组比较，M组α-SMA的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P值均<0.01）；与M组比较，各细胞治疗组α-SMA的mRNA表达水平均显著降低（P值均<0.05），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组α-SMA的蛋白和mRNA的表达水平显著低于M1-BMDM^KD-EV组（P值均<0.05）（图5a、b）。与M1-BMDM^KD-EV组相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD组肝组织中细胞外基质的主要成分COL-Ⅰ和促纤维化细胞因子TGF-β的mRNA表达水平均显著下降（P值均<0.05）（图5c）。

2.4 Wnt5a敲低提高M1-BMDM促肝细胞再生的作用

免疫组织化学结果显示，与N组比较，M组肝细胞特异性标志物HNF-4α与Hep的阳性表达明显减少；与M组相比，各细胞治疗组HNF-4α与Hep阳性表达明显增加，尤以M1-BMDM^Wnt5a-KD组增加最为显著（图6a、b）。免疫印迹结果显示，与N组比较，M组HNF-4α与Hep蛋白表达水平均显著降低（P值均<0.05）；与M组比较，各细胞治疗组HNF-4α蛋白表达均显著增加（P值均<0.05），且M1-BMDM^Wnt5a-KD组HNF-4α和Hep蛋白及mRNA表达水平均显著高于M1-BMDM^KD-EV组（P值均<0.05）（图6c、d）。

为评估肝细胞增殖情况，采用免疫荧光共染技术检测HNF-4α与细胞增殖标志物Ki67的表达情况。结果显示，与M组相比，各细胞治疗组HNF-4α/Ki67共染细胞数量显著增多（P值均<0.01），与M1-BMDM^KD-EV组比较，M1-BMDM^Wnt5a-KD组HNF-4α/Ki67共染细胞数量进一步显著增加（P<0.05）（图7a、b）。与N组比较，M组Alb含量显著下降（P<0.01）；且M1-BMDM^Wnt5a-KD组Alb含量显著高于M1-BMDM^KD-EV组（P<0.01）（图7c）。

3 讨论

肝脏中的巨噬细胞主要由肝巨噬细胞和髓系单核细胞来源的巨噬细胞组成^［14］。在肝损伤期间，巨噬细胞向损伤部位方向迁移，并启动组织修复反应^［15］。与肝巨噬细胞相比，外源性巨噬细胞（特别是在经典极化后）表现出更稳定的表型和作用^［16-17］。经体外基因修饰后的巨噬细胞可能获得特定的活性，从而发挥更佳的治疗作用。本课题组前期研究发现，在CCl₄/2-AAF诱导的大鼠肝硬化模型中，非经典Wnt信号通路相关分子Wnt5a的表达水平显著增加^［6］。因此，本研究首次关注了Wnt5a基因水平对M1-BMDM抗肝纤维化作用的影响及其机制，并采用CCR2抑制剂以抑制内源性单核细胞募集，从而在排除其干扰的前提下，更准确地评估外源性回补巨噬细胞的治疗潜能。

在慢性肝炎和肝硬化患者中，肝脏Wnt5a的表达水平异常升高，与疾病的不良预后密切相关^［18］。巨噬细胞来源的Wnt5a不仅作为一种可溶性蛋白分泌，还通过巨噬细胞来源的外泌体和微囊泡传递到受体细胞，从而发挥广泛的治疗作用^［19］。研究表明，Wnt5a可以作为促炎因子激活非经典Wnt信号通路及核因子-κB等信号通路，促进IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子的释放，从而触发炎症反应^［18］。此外，Wnt5a还可诱导CC亚族趋化因子配体2的表达，使其具有招募巨噬细胞和中性粒细胞的潜力，从而放大炎症反应^［20］。本研究结果表明，与M1-BMDM相比，M1-BMDM^Wnt5a-KD显著降低了促炎因子CD68和TNF-α的蛋白表达水平以及CD11b和CD11c的mRNA表达，并显著增加了抗炎因子CD163的蛋白和mRNA表达水平。此外，M1-BMDM^Wnt5a-KD能进一步缓解肝纤维化，减轻受损肝组织中的胶原沉积，这一现象可能与M1-BMDM^Wnt5a-KD进一步抑制了炎症因子的表达从而减少HSC的活化相关。

肝再生是一个复杂的生物学过程，涉及多种细胞类型和信号通路的协同作用^［21］。HNF-4α是肝细胞分化和功能维持的关键转录因子，其表达增加通常与肝细胞再生能力的增强相关^［22］。Hep被广泛用作监测肝细胞分化和功能的生物标志物，在肝再生研究中，其表达水平常用于评估肝细胞的增殖和功能恢复情况^［23］。Ki67是细胞增殖的标志物，其表达增加表明细胞进入增殖周期^［24］。本研究中，M1-BMDM^Wnt5a-KD经外周血注射后显著提高了HNF-4α和Hep的表达水平，其作用显著优于M1-BMDM；且M1-BMDM^Wnt5a-KD组肝组织HNF-4α/Ki67共染细胞数量显著高于M1-BMDM和M1-BMDM^KD-EV组，提示M1-BMDM^Wnt5a-KD抗肝纤维化的效应机制与促进肝再生有关，但其具体机制仍有待进一步研究。尽管本研究聚焦于Wnt5a基因敲减后M1-BMDM的治疗与再生效应，但其整体疗效可能依赖于M1/M2表型转换的动态网络。Wnt5a敲低的M1型巨噬细胞可能通过改变微环境，间接促进了具有抗炎、促再生作用的M2型巨噬细胞活化^［25］，从而协同增强疗效。为验证此假说并厘清M1型巨噬细胞在疾病进程中的动态角色，构建包含多时间点的纵向研究图谱是阐明核心机制并优化策略的必然方向。

综上所述，尽管巨噬细胞疗法在肝硬化治疗领域已取得显著进展^［26-27］，但通过基因修饰技术优化M1-BMDM的治疗效应尚未见报道。本研究首次证实，通过LV介导的Wnt5a基因敲低后的M1-BMDM经外周血注射后能够显著增强其治疗肝硬化的效果，其潜在机制与抑制肝脏炎症反应、减少HSC活化以及促进肝细胞增殖等密切相关。这一发现为基于基因编辑技术优化M1-BMDM的肝硬化治疗策略提供了新思路。

伦理学声明

本研究方案于2021年6月11日经由上海中医药大学动物研究委员会批准，批号为PZSHUTCM200807008，符合实验室动物管理与使用准则。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(81874390)

上海市科委自然科学基金面上项目(21ZR1464100)

上海市科委2022年度“科技创新行动计划”生物医药科技支撑专项(22S11901700)

上海市临床重点专科建设项目(shslczdzk01201)