克老素衍生肽7对慢性胰腺炎小鼠模型胰腺纤维化的影响及其机制

Effect of Klotho-derived peptide 7 on pancreatic fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis and its mechanism

摘要

目的 通过观察克老素衍生肽7（KL7）对雨蛙素诱导的慢性胰腺炎（CP）小鼠模型的影响，了解该药物抗胰腺纤维化的作用机制，进而为临床用药提供依据。 方法 将40只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、KL7低剂量组（2 mg/kg）和KL7高剂量组（4 mg/kg），每组10只。除对照组外，其余各组小鼠腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），每天注射6次，每次间隔1 h，每周注射3 d，连续注射4周，进行CP造模。KL7低剂量、KL7高剂量组分别给予不同剂量的KL7治疗，每天给药1次，连续4周。活体成像观察KL7在胰腺中的富集情况；分子对接检测KL7与转化生长因子β Ⅱ型受体（TβRⅡ）的结合情况；称量小鼠体重及胰腺湿重；苏木素-伊红染色观察胰腺组织的病理变化；马松染色观察胰腺组织纤维化程度；免疫组化染色检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原α1链（COL1A1）的表达情况；蛋白质印迹法检测胰腺组织中α-SMA、TβRⅡ、磷酸化的母系抗十五表态蛋白同源物2/3（p-Smad2/3）蛋白的表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t和Dunnett’s-T3检验。 结果 KL7能够显著富集在CP小鼠胰腺组织，与TβRⅡ蛋白存在强结合活性。与对照组相比，模型组小鼠胰腺湿量和相对胰腺质量均显著降低（P<0.000 1），胰腺组织结构紊乱、炎细胞浸润增加，纤维化程度显著增加，α-SMA和COL1A1阳性面积均显著增加（P值均<0.000 1），α-SMA、TβRⅡ和p-Smad2/3蛋白表达水平显著升高（P值均<0.05）。与模型组相比，KL7高剂量组小鼠胰腺湿量和相对胰腺质量均显著升高（P值均<0.01），胰腺组织结构损伤和炎细胞浸润得到缓解，纤维化程度显著降低，α-SMA和COL1A1阳性面积均显著降低（P值均<0.001），α-SMA、TβRⅡ和p-Smad2/3蛋白表达水平均显著降低（P值均<0.01）。 结论 KL7对CP小鼠胰腺纤维化具有显著的靶向治疗效果，其作用机制涉及KL7与TβRⅡ特异性结合，从而抑制TGF-β/Smad信号通路的激活。

Abstract

Objective To investigate the anti‑pancreatic fibrosis mechanism of Klotho‑derived peptide 7 （KL7） by observing its effect on a mouse model of chronic pancreatitis （CP） induced by cerulean， and to provide a basis for clinical medication. Methods A total of 40 male BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， low-dose KL7 group （2 mg/kg）， and high-dose KL7 group （4 mg/kg）， with 10 mice in each group. All mice except those in the control group were given intraperitoneal injection of cerulean （50 μg/kg） 6 times a day at an interval of 1 hour， twice a week for 4 consecutive weeks to establish a model of CP. The mice in the low-dose KL7 group and the high-dose KL7 group were treated with different doses of KL7 once a day for 4 consecutive weeks. In vivo imaging was used to observe the accumulation of KL7 in the pancreas； molecular docking was used to detect the binding of KL7 to transforming growth factor-β type Ⅱ receptor （TβRⅡ）； the mice were measured in terms of body weight and pancreatic weight； HE staining was used to observe the pathological changes of pancreatic tissue； Masson staining was used to observe the degree of pancreatic fibrosis； immunohistochemical staining was used to measure the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and type Ⅰ collagen （COL1A1）； Western blotting was used to measure the protein expression levels of α-SMA， TβRII， and phosphorylated small mothers against decapentaplegic homolog 2/3 （p-Smad2/3） in pancreatic tissue. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test and the Dunnett’s-T3 test were used for further comparison between two groups. Results KL7 was significantly enriched in the pancreatic tissue of CP mice， and there was a strong binding activity between KL7 and TβRⅡ. Compared with the control group， the model group had significant reductions in pancreatic mass and relative pancreatic mass （P<0.000 1）， with disordered structure of pancreatic tissue， an increase in inflammatory cell infiltration， and significant increases in fibrosis degree， the positive areas of α-SMA and COL1A1 （P<0.000 1）， and the protein expression levels of α-SMA， TβRⅡ， and p-Smad2/3 （P<0.05）. Compared with the model group， the high-dose KL7 group had significant increases in pancreatic mass and relative pancreatic mass （P<0.01）， with alleviation of structural damage of pancreatic tissue and inflammatory cell infiltration， a significant reduction in fibrosis degree， and significant reductions in the positive areas of α-SMA and COL1A1 （P<0.001） and the protein expression levels of α-SMA， TβRⅡ， and p-Smad2/3 （P<0.01）. Conclusion KL7 has a significant targeted therapeutic effect on pancreatic fibrosis in CP mice through specific binding of KL7 to TβRⅡ， thereby inhibiting the activation of the TGF-β/Smad signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

胰腺炎， 慢性 / 纤维化 / 克老素衍生肽7

Key words

Pancreatitis， Chronic / Fibrosis / Klotho-Derived Peptide

慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）的病理表现为胰腺实质的萎缩与破坏，其中胰腺纤维化是其主要病理特征，导致胰腺组织不可逆损伤，并显著增加胰腺癌的发生风险^［1］。近年来，CP的发病率与患病率呈现逐年上升趋势^［2-3］，且目前尚无有效的根治方法^［4］。因此，开发可用于治疗CP胰腺纤维化的药物尤为迫切。

克老素是一种抗衰老的单边膜蛋白，在肾脏和脑中大量表达，同时存在于包括胰腺在内的各种内、外分泌组织中^［5］。克老素缺陷易导致肾脏、心脏和肺等多个器官纤维化^［6-7］。有研究表明，克老素衍生肽（Klotho-derived peptide， KL）1可通过靶向转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/母系抗十五表态蛋白同源物（mothers against decapentaplegic homolog， Smad）信号传导抑制肾纤维化进程^［8］；KL6可通过靶向Wnt/β-联蛋白（β-catenin）信号传导改善肾小球硬化和间质纤维化病变^［9］。本课题组前期研究筛选获得了一段具有胰腺靶向性的KL7，通过分子对接发现KL7与TGF-β Ⅱ型受体（transforming growth factor-β type Ⅱ receptor，TβRⅡ）存在强结合活性。因此，本研究通过建立CP模型小鼠，评估KL7对CP纤维化的影响，并探讨其潜在的作用机制，以期为KL7作为CP治疗新策略的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物

KL7（序列：YQTEGGW）由上海强耀生物科技有限公司合成，将其溶解于二甲基亚砜溶剂中，初始浓度为40 mg/mL，使用生理盐水稀释至0.4 mg/mL，用于纤维化治疗。KL7-花青素7（CY7）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，粉末溶解于二甲基亚砜中，初始浓度为20 mg/mL，使用生理盐水稀释至0.2 mg/mL，用于活体成像分析。

1.2 实验动物

选用无特定病原体级BALB/c雄性小鼠40只，4周龄，购自广东省医学实验动物中心［动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0002］。所有小鼠饲养于广州医科大学附属清远医院实验动物中心［实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2024-02-06］，饲养环境条件为：室温20～26 ℃，相对湿度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，自由进食和饮水。

1.3 实验试剂

雨蛙素（美国MCE公司，货号：HY-A0190B21327）；马松三色染色液（武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G1006）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（英国Abcam公司，货号：ab124964）；Ⅰ型胶原α1链（collagen type Ⅰ，COL1A1）抗体（美国CST公司，货号：72026T）；p-Smad2、p-Smad3抗体（上海碧云天生物技术股份有限公司，货号：AF2545、AF1759）；Smad2/3抗体（武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：GB111844）；TβRⅡ抗体（武汉Proteitech公司，货号：66636-1-Ig）；GAPDH抗体（江苏Affinity公司，货号：AF7021）；3，3′-二氨基联苯胺染色试剂盒（苏州百道医疗，货号：PK001）；12%预制胶（南京艾思易生物科技有限公司，货号：ET15012LGel）；超敏发光液（北京普利莱基因技术有限公司，货号：P1050）；蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制剂（苏州新赛美生物科技有限公司，货号：P002）。

1.4 实验仪器

全自动脱水仪（德国Hettich公司，型号：320R）；石蜡切片机（德国Leica公司，型号：RM2235）；全自动封片机（日本SAKURA公司，型号：Film-JC2）；正置荧光显微镜（日本Olympus，型号：BX53）；冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司，型号：JXFSTPRP-CLN）；电泳系统（美国Bio-Rad公司，型号：PowerPac HC）；动物活体成像系统（上海天能生命科学有限公司，型号：ABL X6）。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与造模

40只BALB/c小鼠适应性饲养1周后，采用完全随机法分为对照组、模型组、KL7低剂量组（2 mg/kg）和KL7高剂量组（4 mg/kg），每组10只。除对照组外，其余3组小鼠腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），每天注射6次，每次间隔1 h，每周注射3 d，连续注射4周，制备CP模型^［9］；给药组小鼠在造模同时尾静脉注射相应剂量的KL7，注射体积10 mL/kg，每天给药1次，连续给药4周；对照组和模型组小鼠给予等体积的溶剂。

1.5.2 胰腺质量及相对胰腺质量的测定

末次给药2 h后，麻醉小鼠，分离小鼠胰腺，随后颈椎脱臼处死小鼠，称量小鼠体重和胰腺湿重并计算相对胰腺质量。相对胰腺质量=胰腺湿重（mg）/体重（g）。

1.5.3 活体成像观察KL7组织分布情况

尾静脉注射30 min后，麻醉小鼠，分离小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和胰腺组织，摆放在无菌培养皿上，置于小动物活体成像系统内对各脏器进行荧光成像观察和拍照。

1.5.4 苏木精-伊红（hematoxylin and eosin staining，HE）染色观察小鼠胰腺组织病理变化

将新鲜分离的小鼠胰腺组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，随后进行常规脱水、石蜡包埋，切片厚度3 μm；脱蜡后，进行HE染色，全自动封片机封片，于显微镜下观察和拍照。

1.5.5 马松染色检测胰腺组织纤维化程度

将切片置于60 °C恒温箱2 h，常规脱蜡、水化；按说明书进行马松染色，随后全自动封片机封片，于显微镜下观察和拍照；随机选取3个视野，用Image J软件进行图像的数据分析。

1.5.6 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色检测胰腺组织中α-SMA、COL1A1表达

将切片置于60 °C恒温箱中2 h，常规脱蜡、水化；在柠檬酸缓冲液中高压修复抗原；在3%过氧化氢中灭活内源性过氧化物酶；在0.5% Triton X-100溶液中渗透打孔；用10%山羊血清封闭后，滴加一抗ɑ-SMA（1∶250）、COL1A1（1∶100），在湿盒内4 °C孵育过夜；滴加鼠/兔二抗室温孵育1 h，磷酸盐缓冲液漂洗3次；滴加3，3’-二氨基联苯胺显色，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明，全自动封片机封片，于显微镜下观察和拍照；随机选取3个视野，用Image J软件进行图像数据分析。

1.5.7 分子对接

使用Discover studio软件构建衍生多肽结构，并通过Chem 3D对所构建的多肽结构进行能量最小化，转化为pdb格式后导入AutoDock Tools-1.5.6软件，并添加原子电荷、分配原子类型，保存为pdbqt文件；从PDB数据库下载TβRⅡ蛋白晶体结构，采用AutoDock Tools-1.5.6软件对TβRⅡ进行加氢、平衡电荷修饰，将TβRⅡ转化为pdbqt格式；应用AutoDock Vina 1.1.2对蛋白与七肽进行分子对接，获取结合能值。

1.5.8 蛋白质印迹法（Western blotting，WB）检测α-SMA、TβRⅡ、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达

将小鼠胰腺组织放入含有蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的裂解液中，冷冻研磨仪研磨，冰浴裂解，离心收集上清，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度；上样缓冲液煮沸变性后的蛋白样品进行电泳、转膜和封闭；一抗GAPDH（1∶3 000）、α-SMA（1∶10 000）、TβRⅡ（1∶5 000）、p-Smad2（1∶1 000）、p-Smad3（1∶1 000）和Smad2/3（1∶500）4 ℃孵育过夜；洗涤后，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h；化学发光显色，凝胶成像系统中进行显色；用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.6 统计学方法

使用SPSS 27.0、Image J和Graphpad Prism 8.0.2软件进行数据分析与图像处理。符合正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t（方差齐时）和Dunnett’s-T3（方差不齐时）检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KL7在CP小鼠各脏器中的富集情况

活体成像结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的胰腺组织中KL7-CY7荧光强度显著增强（图1），表明KL7能够靶向富集在CP小鼠病变的胰腺组织。

2.2 分子对接验证KL7与TβRⅡ结合

分子对接结果显示，KL7可以稳定地结合在TβRⅡ蛋白由ARG-254、ALA-257、ASP-379、ASP-397、GLY-399、LEU-305、LEU-386、LEU-400、LYS-252、LYS-277、LYS-381、PHE-255、PHE-327、SER-383和VAL-258氨基酸组成的配体结合口袋中，KL7与口袋周围的氨基酸间形成了疏水作用和氢键作用，使小分子与蛋白稳定结合（图2）。根据Autodock软件的预测，KL7与TβRⅡ蛋白的最优结合能为-8.3 kcal/mol，表明两者之间具有较强的结合活性。

2.3 KL7对CP小鼠体重及胰腺重量的影响

与对照组相比，各组小鼠体重均无显著差异（P值均>0.05），模型组小鼠的胰腺湿重和相对胰腺质量显著降低（P值均<0.000 1）；与模型组相比，KL7高剂量组小鼠的胰腺湿重和相对胰腺质量均显著升高（P值均<0.01）（图3）。

2.4 KL7对CP小鼠胰腺组织大体形态和病理改变的影响

光镜观察发现，对照组小鼠胰腺组织呈黄色脂肪样，表面光滑平整，体积较大；与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织呈灰白色条索状，表面凹凸不平，体积明显缩小；与模型组相比，KL7低剂量组和高剂量组小鼠的胰腺组织接近正常状态。HE染色结果显示，对照组小鼠腺泡细胞排列整齐、边界清晰；与对照组相比，模型组小鼠腺泡细胞排列杂乱、边界模糊、萎缩、数量减少和体积变小，甚至出现空泡化和异常增生，并伴有以淋巴细胞、浆细胞为主的炎细胞浸润，经核验确定胰腺纤维化模型构建成功；与模型组相比，KL7低剂量组和高剂量组小鼠胰腺腺泡细胞排列相对整齐，边界清晰，仅存在少量空泡变性和炎症细胞浸润现象，仅有少量空泡化和异常增生细胞（图4）。

2.5 KL7对CP小鼠胰腺组织马松染色及α-SMA、COL1A1 IHC染色阳性面积的影响

与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织马松阳性面积显著升高（P<0.001）；与模型组相比，KL7高剂量组小鼠胰腺组织马松阳性面积显著降低（P<0.01）。与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织中α-SMA阳性面积显著升高（P<0.000 1）；与模型组相比，KL7低剂量组和高剂量组小鼠胰腺组织中α-SMA阳性面积均显著降低（P值均<0.001）。与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织中COL1A1阳性面积显著升高（P<0.000 1）；与模型组相比，KL7低剂量组和高剂量组小鼠胰腺组织中COL1A1阳性面积均显著降低（P值均<0.001）（图5）。

2.6 KL7对CP小鼠胰腺组织α-SMA、TβRⅡ、p-Smad2/3和Smad2/3蛋白表达的影响

WB结果显示，与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织中α-SMA和TβRⅡ蛋白表达水平均显著升高（P值均<0.001）；与模型组相比，KL7低剂量和高剂量组小鼠胰腺组织中α-SMA表达水平均显著降低（P值均<0.05），KL7高剂量组小鼠胰腺组织中TβRⅡ表达显著降低（P<0.001）。与对照组相比，模型组小鼠胰腺组织中p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平均显著升高（P值均<0.05）；与模型组相比，KL7高剂量组小鼠胰腺组织中p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平均显著降低（P值均<0.01）（图6）。

3 讨论

克老素是一种具有抗衰老特性的跨膜蛋白，参与多种生理过程的调控，具有抗炎、抗纤维化和抗氧化应激等生物活性，对多系统疾病及其纤维化病变，如心肌纤维化、肾纤维化和肺纤维化具有临床治疗潜能^［10-11］。在胰腺疾病的治疗方面，已有研究表明，克老素治疗能够显著提升小鼠胰岛β细胞的质量，并减轻胰岛的炎症反应，提示其在1型糖尿病治疗中展现出潜在的应用价值^［12］。此外克老素治疗还可显著抑制胰腺癌肿瘤的增殖，延长小鼠的生存期，为胰腺癌的治疗提供了新的思路^［13］。然而，目前尚未有研究报道克老素在胰腺纤维化中的作用。本课题组在前期研究中筛选得到了一段能够显著富集在CP小鼠胰腺组织中的KL7。分子对接实验证实，KL7与TβRⅡ之间存在较强的结合能力，这一结果提示，KL7可能对胰腺纤维化具有治疗潜力。基于此，本研究通过腹腔注射雨蛙素成功建立了CP小鼠模型，进一步观察KL7对CP小鼠胰腺纤维化的治疗效果。结果显示，与模型组相比，KL7治疗组小鼠的胰腺湿重显著增加，胰腺损伤程度明显减轻，仅出现部分腺泡细胞萎缩和少量炎细胞浸润，胶原纤维沉积显著减少，且胰腺组织中COL1A1的表达水平显著降低。以上结果表明，KL7对CP引起的胰腺纤维化具有显著的治疗作用。

胰腺星形细胞（pancreatic stellate cell，PSC）是胰腺纤维化形成的主要效应细胞，活化的PSC以旁分泌和自分泌途径保持激活状态是纤维化发生的主要事件^［14-15］。在正常的胰腺组织中，PSC以静息表型存在于腺泡细胞的基底外侧，细胞质中富含脂滴，负责合成细胞外基质蛋白及降解细胞外基质的酶，以维持正常的组织结构^［16］。在外界因素作用下，PSC由静止表型转化为肌成纤维样细胞活化表型，脂滴消失，α-SMA表达增加，导致大量的细胞外基质合成和沉积，最终形成胰腺纤维化^［17］。IHC染色和WB结果显示，模型组小鼠胰腺组织中α-SMA、COL1A1表达显著升高，而KL7治疗组中α-SMA、COL1A1表达显著降低。以上结果表明，KL7治疗胰腺纤维化的作用与抑制PSC的活化有关。

TGF-β是PSC活化的主要促纤维化细胞因子，通过与TβR结合，激活TGF-β/Smad信号通路，进而调控PSC的活化过程^［18］。TβR根据结构和功能可分为TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ。在经典的TGF-β信号通路中，TGF-β首先与细胞表面的TβRⅡ结合，TβRⅡ发生自身磷酸化，招募并磷酸化TβRⅠ，形成配体-受体复合物，进一步磷酸化下游的Smad2/3蛋白，随后与Smad4结合并易位到细胞核中，转录调控靶基因表达^［19］。TβRⅡ是TGF-β直接作用的受体，在下游信号的激活过程中起着“开关”的作用，是抗纤维化治疗的关键靶点。因此，本研究通过分子对接证实KL7可以稳定地结合在TβRⅡ蛋白中由ARG-254等15个氨基酸构成的口袋中，最优结合能为-8.3 kcal/mol，表明两者之间具有很强的结合活性。WB结果显示，模型组小鼠胰腺组织中TβRⅡ、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平显著升高，而KL7治疗组中TβRⅡ、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平显著下降，提示KL7可能通过与TβRⅡ特异性结合，竞争性抑制了TGFβ与TβRⅡ受体的结合，抑制了下游Smad2和Smad3蛋白的磷酸化，从而发挥抗纤维化作用。

综上所述，本研究发现KL7对CP小鼠胰腺纤维化具有显著的靶向治疗效果，其作用机制涉及KL7与TβRⅡ特异性结合抑制TGF-β/Smad信号通路的激活。然而，KL7对PSC活化的调控作用尚未阐明，仍有待深入研究。

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基金资助

广东省医学科学技术研究基金(A2022163)

广东省医学科学技术研究基金(A2024690)

广东省中医药局科研项目(20231412)

广东省中医药局科研项目(20251478)

吴阶平医学基金会科研专项资助基金(320.6750.2024-03-49)

广东省基础与应用基础研究基金(2025A1515010072)