2型糖尿病自发胰腺癌KPC小鼠新型共病模型的构建及评价

Construction and evaluation of a novel KPC mouse model of type 2 diabetes mellitus comorbid with spontaneous pancreatic cancer

摘要

目的 通过基因编辑-代谢干预双驱动策略构建KPC小鼠新型2型糖尿病（T2DM）自发胰腺癌共病模型，并结合传统模型进行对比和评价。 方法 将14只雄性KPC小鼠随机分为新型模型组（T2DM-KPC组，n=7）和对照组（KPC组，n=7）；另将14只雄性BALB-c/nu裸鼠随机分为传统模型组（T2DM-胰腺癌组，n=7）和对照组（单纯胰腺癌组，n=7）。KPC组及单纯胰腺癌组采用普通饲料喂养，T2DM-KPC组和T2DM-胰腺癌组采用高脂饲料喂养。4周后，T2DM-KPC组和T2DM-胰腺癌组腹腔注射链脲佐菌素。随后，T2DM-KPC组和KPC组随着时间的推移自发形成胰腺原发肿瘤；T2DM-胰腺癌组和单纯胰腺癌组待血糖稳定2周后皮下接种肿瘤，形成传统皮下移植瘤。观察4组小鼠成瘤率、成瘤时间、体重及血糖变化；对KPC组和T2DM-KPC组进行测序并分析分子分型；利用苏木精-伊红染色、Masson染色和免疫组织化学染色评价T2DM-KPC组胰腺肿瘤组织病理学和病理学微环境特征，并与T2DM-胰腺癌组进行比较。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料多组间比较采用Fisher确切概率法。 结果 T2DM-KPC组成瘤率为85.71%，成瘤时间为（104.40±2.87）d；T2DM-胰腺癌组成瘤率为71.43%，成瘤时间为（95.20±9.47）d，2组成瘤率、成瘤时间、体重和血糖水平比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。分子分型提示，KPC组模型与人类胰腺导管腺癌的胰祖细胞型高度相似，T2DM-KPC组模型与人类胰腺导管腺癌的免疫原性型高度相似。苏木精-伊红染色显示，T2DM-KPC组肿瘤细胞排列成形状各异的腺管样结构，细胞异型性明显，能真实反映原发胰腺癌的病理学特征，且肿瘤较KPC组侵袭性更强。免疫组织化学和Masson染色结果显示，T2DM-KPC组肿瘤增殖（Ki-67为评价指标）程度和纤维化（α-平滑肌肌动蛋白和Masson为评价指标）程度均较T2DM-胰腺癌组明显升高（P值均<0.05），说明T2DM-KPC组小鼠模型可以更好地复现胰腺癌的高增殖和高纤维化特征。 结论 本研究成功构建了T2DM自发胰腺癌KPC小鼠新型共病模型。该模型能准确模拟T2DM合并胰腺癌的组织病理学形态和特有的基质环境，实现T2DM背景下胰腺组织从上皮内瘤变到浸润癌再到转移的全过程模拟，还可支持免疫治疗转化研究，为T2DM自发胰腺癌的体内研究提供了新的实验载体。

Abstract

Objective To construct a novel KPC mouse model of type 2 diabetes mellitus （T2DM） comorbid with spontaneous pancreatic cancer based on the gene editing-metabolic intervention dual-driven strategy， and to compare it with traditional models. Methods A total of 14 male KPC mice were randomly divided into novel model group （T2DM-KPC group with 7 mice） and control group （KPC group with 7 mice）， and 14 male BALB/c-nu nude mice were randomly divided into traditional model group （T2DM-pancreatic cancer group with 7 mice） and control group （pancreatic cancer group with 7 mice）. The mice in the KPC group and the pancreatic cancer group were fed with normal diet， and those in the T2DM-KPC group and the T2DM-pancreatic cancer group were fed with a high-fat diet. After 4 weeks， the mice in the T2DM-KPC group and the T2DM-pancreatic cancer group were given intraperitoneal injection of streptozotocin. Subsequently， the mice in the KPC group and the T2DM-KPC group developed primary pancreatic tumor spontaneously over time， while those in the T2DM-pancreatic cancer group and the pancreatic cancer group were inoculated with tumor cells to form subcutaneous tumor xenograft at 2 weeks after stabilization of blood glucose. The 4 groups were observed in terms of tumor formation rate， tumor formation time， body weight， and the change in blood glucose； RNA sequencing was performed for tumors from the KPC group and the T2DM-KPC group， and then molecular subtyping was performed； HE staining， Masson staining， and immunohistochemical staining were used to assess the histopathological features and tumor microenvironment of pancreatic tumor from the T2DM-KPC group， which were compared with those of the T2DM-pancreatic cancer group. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups， and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups； the Fisher’s exact test was used for comparison of categorical data between multiple groups. Results The T2DM-KPC group had a tumor formation rate of 85.71% and a tumor formation time of 104.40±2.87 days， while the T2DM-pancreatic cancer group had a tumor formation rate of 71.43% and a tumor formation time of 95.20±9.47 days， and there were no significant differences between the two groups in tumor formation rate， tumor formation time， body weight， and blood glucose （all P>0.05）. Molecular subtyping showed that the model in the KPC group highly resembled the pancreatic progenitor subtype of human pancreatic ductal adenocarcinoma （PDAC）， and the model in the T2DM-KPC group highly resembled the immunogenic subtype of PDAC. HE staining showed that tumor cells in the T2DM-KPC group were arranged into glandular tubular structures of varying shapes， exhibiting significant cellular atypia， and this model faithfully recapitulated the pathological features of primary pancreatic cancer and showed greater invasiveness than the KPC group. Immunohistochemical staining and Masson staining showed that compared with the T2DM-pancreatic cancer group， the T2DM-KPC group had significantly higher degrees of tumor proliferation （assessed by Ki-67 expression） and fibrosis （assessed by α-SMA and Masson） （all P<0.05）， suggesting that the mouse model in the T2DM-KPC group could better recapitulate the features of hyperproliferation and pronounced desmoplasia in human pancreatic cancer. Conclusion A novel KPC mouse model of T2DM comorbid with spontaneous pancreatic cancer is successfully constructed in this study. This model can accurately mimic the histopathological architecture and stromal microenvironment of T2DM comorbid with pancreatic cancer， realize the longitudinal simulation of the progression of pancreatic tissue from intraepithelial neoplasia to invasive carcinoma and metastasis in the presence of T2DM， and support the translational research on immunotherapy， thereby providing a novel experimental carrier for in vivo studies on spontaneous pancreatic cancer in T2DM.

Graphical abstract

关键词

胰腺肿瘤 / 糖尿病， 2型 / 共病现象 / 疾病模型， 动物 / KPC小鼠

Key words

Pancreatic Neoplasms / Diabetes Mellitus， Type 2 / Comorbidity / Disease Models， Animal / KPC Mice

胰腺癌是最具侵袭性和致命性的消化系统恶性肿瘤之一^［1］。2020年中国癌症死亡统计数据显示，胰腺癌以12万例的死亡人数位居第六^［2］。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常见的胰腺癌类型，PDAC患者的5年生存率<10%^［3］。糖尿病是一种慢性代谢性疾病，多项大型队列研究和Meta分析显示，2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是胰腺癌的危险因素，其总体危险系数为1.4～2.1^［4］。有研究表明，高血糖不仅是糖尿病的特征性表现，且高糖环境还可能通过多种机制促进胰腺癌的发生发展，包括促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，并影响肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的免疫状态^［5］。长期高血糖状态可能会导致氧化应激和DNA损伤，进而促进胰腺细胞癌变；同时，T2DM患者常伴有胰岛素抵抗，可能导致血液中胰岛素水平升高，而高浓度的胰岛素可能促进胰腺癌细胞的生长和增殖^［6］。随着糖尿病合并胰腺癌病例的日益增多，深入开展该共病机制研究的需求日益迫切，而建立一种适合体内研究的动物模型尤为重要。目前，T2DM的动物建模方法已较为成熟，如何构建适合的T2DM和胰腺癌共病模型成为研究的关键。传统的移植瘤模型通过外源性细胞注射或瘤块移植启动肿瘤，无法模拟人类肿瘤从内源性组织逐步癌变的自然演进过程。且此类模型因使用裸鼠，通常无法对TME中代谢物（如乳酸、缺氧）与免疫细胞的相互作用进行系统评估，导致其在模拟肿瘤免疫逃逸和治疗响应方面存在结构性缺陷。KPC［C57BL/6Smoc-Trp53^{em4（R172H）}Kras^{em4（LSL-G12D）} Tg（Pdx1-cre）Smoc］小鼠是具有完整免疫功能的自发胰腺癌小鼠模型。基于此，本研究提出一种基因编辑-代谢干预双驱动策略，构建新型T2MD自发胰腺癌共病模型。该模型以KPC小鼠为遗传学基础，其携带的Kras^G12D 突变、Trp53^R172H 失活和Pdx1-cre胰腺特异性表达，可模拟人类胰腺癌的关键基因特征；代谢诱导采用高脂饲料喂养（60%脂肪比例）+链脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射，通过诱导胰岛素抵抗和选择性破坏胰岛β细胞构建T2DM表型（空腹血糖≥11.1 mmol/L）。此模型将为T2DM并发胰腺癌发生发展的体内研究提供新的实验载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和饲料

选取14只无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级4周龄雄性KPC小鼠，体重15～20 g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司［实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2024-0007，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2023-0005］；另外选取14只SPF级3周龄雄性BALB-c/nu裸鼠，体重9～10 g，购自广西医科大学实验动物中心［实验动物生产许可证号：SCXK（桂）2025-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2025-0005］。所有小鼠均饲养于该中心SPF级屏障区环境内，环境温度24～26 ℃，相对湿度55%～65%，严格控制12 h光照和12 h黑暗。高脂饲料（60%脂肪比）购自北京博爱港公司，饮水为灭菌蒸馏水。实验动物适应喂养1周后开始实验。

1.1.2 细胞系及试剂

人胰腺癌导管细胞PANC-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM细胞培养基、青链霉素购自赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；胎牛血清、STZ购自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；无菌柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5）、山羊血清、10%中性福尔马林固定液购自北京索莱宝科技有限公司；抗体稀释液购自福州迈新公司；即用型三溴乙醇溶液购自南京爱贝生物科技有限公司；血糖仪、血糖试纸均购自德国罗氏血糖健康医护公司；Ki-67购自美国Cell Signaling Technology公司（货号：12202T）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（货号：ab150301）购自英国abcam公司；Masson三色染色液（货号：BA4079A）购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM自发胰腺癌小鼠新型共病模型的构建

取14只4周龄雄性KPC小鼠，剪取0.5 cm小鼠鼠尾，加入75 μL、50 mmol/L NaOH溶液，95 ℃金属浴10 min后，加入10 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），以12 000 r/min离心1 min得到上清液即为DNA，以其作为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带大小鉴定Kras、Pdx1-cre基因型。使用FAM、HEX荧光双通道检测点突变p53基因型。鉴定基因型后，通过随机数字表法将小鼠分为对照组（KPC组）与新型模型组（T2DM-KPC组），每组7只。KPC组使用普通饲料喂养，T2DM-KPC组使用60%高脂饲料喂养。4周后，对T2DM-KPC组小鼠禁食12 h，按60 mg/kg剂量腹腔注射无菌柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5）新鲜配制的1% STZ溶液，以构建T2DM模型；同时，KPC组腹腔注射等剂量的柠檬酸钠缓冲液。注射7 d后，通过剪尾采血的方式测定空腹7 h血糖值，连续3次血糖值≥11.1 mmol/L即认为T2DM模型构建成功。此后，T2DM-KPC组继续给予高脂饲料喂养，KPC组继续给予普通饲料喂养，直至自发形成胰腺肿瘤。

1.2.2 传统T2DM-胰腺癌皮下移植瘤裸鼠共病模型的构建

取14只3周龄雄性BALB/c-nu 裸鼠，通过随机数字表法将小鼠分为对照组（单纯胰腺癌组）与传统模型组（T2DM-胰腺癌组），每组7只。单纯胰腺癌组使用繁殖饲料喂养，T2DM-胰腺癌组使用60%高脂饲料喂养。4周后，对T2DM-胰腺癌组裸鼠禁食12 h，并按150 mg/kg剂量腹腔注射1% STZ溶液；同时，单纯胰腺癌组腹腔注射等剂量的柠檬酸钠缓冲液。注射7 d后，通过剪尾采血的方式测定禁食7 h血糖值，连续3次血糖值≥11.1 mmol/L即认为T2DM裸鼠模型构建成功。血糖稳定2周后接种肿瘤，设置单只裸鼠细胞接种量为1×10⁷个，于右侧背部皮下注射PANC-1细胞悬液100 μL，接种后观察肿瘤生长情况。

1.2.3 肿瘤组织获取并包埋制片

对于T2DM-KPC组和KPC组，当KPC小鼠出现行动迟缓、精神萎靡或者腹部异常肿大且体重下降超过20%时即达到仁慈终点，临近仁慈终点时进行安乐死，取出胰腺原发肿瘤，固定后对肿瘤组织进行石蜡包埋、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin， HE）染色制片；对于单纯胰腺癌组和T2DM-胰腺癌组，皮下荷瘤稳定后处死各组裸鼠，取出皮下移植瘤观察，固定后对皮下移植瘤组织进行石蜡包埋、HE染色制片。

1.2.4 Illumina MiSeq测序

每个样本取200 mg肿瘤组织，通过琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况，检测合格后由生工生物工程（上海）股份有限公司采用Illumina MiSeq二代测序平台进行高通量测序（合同编号：MRNA2513091NN-1）。测序数据的分子分型参照Bailey等^［7］的方法进行分析。

1.2.5 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡水化后，使用乙二胺四乙酸溶液（pH=9.0，稀释比例1∶50）水浴修复18 min。3%过氧化氢阻断15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS缓冲液洗涤3次后，用Tween-PBS浸泡3 min。滴加10%山羊血清封闭30 min，PBS缓冲液洗涤3次后，Tween-PBS浸泡3 min。倾倒血清封闭液，加入一抗，室温孵育70 min，PBS缓冲液洗涤3次后，Tween-PBS浸泡3 min。增强反应液室温孵育20 min，PBS缓冲液洗涤3次后，Tween-PBS浸泡3 min；二抗室温孵育20 min，PBS缓冲液洗涤3次后，Tween-PBS浸泡3 min。苏木精衬染细胞核1 min，分化液分化数秒，流水返蓝6 min。经梯度乙醇脱水（75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇2次，各2 min）、二甲苯透明（3次，各2 min）后，中性树脂封片，于显微镜下观察并拍照。其中，一抗工作液稀释比分别为Ki-67（1∶1 400）、α-SMA（1∶300）。免疫组织化学结果判定标准：×200视野下每张切片随机选取5个视野，利用ImageJ软件分别计数阳性细胞个数/面积、总细胞个数/面积，计算5个视野下的平均阳性指数。

1.2.6 Masson染色

石蜡切片脱蜡水化后，使用Weigert铁苏木素液（A液及B液按1∶1比例配制）染色10 min。倾倒染液，流水冲洗后分化液分化数秒，流水返蓝6 min。依次滴加丽春红酸性品红染液染色5 min，磷钼酸溶液染色2 min，苯胺蓝染液染色2 min。倾倒苯胺蓝染液，1%乙酸溶液分化数秒（必要时显微镜下控制）。经梯度乙醇脱水（75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇2次，各2 min）、二甲苯透明（3次，各2 min）后，中性树脂封片，于显微镜下观察并拍照，测定肿瘤组织纤维化程度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 27.0软件进行数据分析，Graphpad Prism 10制作统计图。符合正态分布的计量资料以\overline{x}±s表示，在满足方差齐性前提下，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。计数资料多组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KPC小鼠的基因鉴定

取小鼠鼠尾DNA进行PCR扩增，扩增后将产物进行琼脂糖凝胶电泳。鉴定结果如下：（1）琼脂糖凝胶电泳结果同时扩增出100 bp和250 bp条带则为Kras^{em4（LSL-G12D）} 杂合小鼠；（2）出现650 bp条带则为Pdx1-cre阳性小鼠；（3）p53为点突变，R172H位置从G碱基突变为A碱基。使用FAM、HEX荧光双通道检测，根据终点分析法判断结果，位点出现在杂合子分区内则为p53点突变小鼠。同时满足以上3个条件则为KPC小鼠，实验所用14只小鼠经基因鉴定皆为KPC小鼠（图1、2）。

2.2 T2DM自发胰腺癌小鼠新型共病模型的建立

T2DM-KPC组通过随机数字表法挑选5只小鼠的肿瘤组织进行后续实验，KPC组取最终成瘤的5只小鼠肿瘤组织进行后续实验（图3）。

2.3 传统T2DM-胰腺癌皮下移植瘤裸鼠共病模型的建立

用单纯胰腺癌组和T2DM-胰腺癌组中最终成瘤的各5只裸鼠肿瘤组织进行后续实验（图4）。

2.4 KPC小鼠的分子分型

PDAC有鳞状型、胰祖细胞型、免疫原性型和异常分化的内分泌-外分泌型4个亚型分类，提取各亚型的核心上调基因列表（每个亚型10个基因），并将上述人类核心基因转换为小鼠直系同源基因。分别计算每个分型所有样本特征基因表达量的平均值，得到最终参考向量，最高向量对应的分型即为该分组的分子分型。通过分析上文1.2.4节测序数据（KPC组和T2DM-KPC组），计算特征基因表达量得到最终参考向量，发现KPC组模型与人类PDAC的胰祖细胞型高度相似，特征性高表达Muc1、Hes1和Hnf4a等基因；T2DM-KPC组模型与人类PDAC的免疫原性型高度相似，特征性高表达Cd74、H2-Ab1和H2-Aa等基因（图5）。

2.5 组间比较与模型评价

2.5.1 各组成瘤率和成瘤时间比较

单纯胰腺癌组1只未出现皮下肿瘤，1只意外死亡，最终成瘤5只；T2DM-胰腺癌组2只意外死亡，最终成瘤5只；KPC组2只意外死亡，最终成瘤5只；T2DM-KPC组1只意外死亡，最终成瘤6只。单纯胰腺癌组、T2DM-胰腺癌组和KPC组成瘤率均为71.43%，T2DM-KPC组成瘤率为85.71%，各组成瘤率差异无统计学意义（P>0.05）。KPC组的成瘤时间为（143.20±29.95）d，T2DM-KPC组成瘤时间为（104.40±2.87）d，单纯胰腺癌组成瘤时间为（94.00±6.33）d，T2DM-胰腺癌组成瘤时间为（95.20±9.47）d，T2DM-KPC组与T2DM-胰腺癌组成瘤时间差异无统计学意义（P>0.05），即新型模型组和传统模型组成瘤时间差异无统计学意义。

2.5.2 各组血糖和体重比较

T2DM的特征为多饮多食多尿、体重下降以及血糖升高。血糖水平是评价T2DM模型构建成功的重要指标。与KPC组相比，T2DM-KPC组末周空腹血糖水平显著升高［（23.50±2.62）mmol/L vs （7.48±0.94）mmol/L，P<0.05］，而末周体重比较差异无统计学意义［（22.70±5.21）g vs （25.00±4.12）g，P>0.05］。与单纯胰腺癌组相比，T2DM-胰腺癌组末周空腹血糖水平显著升高［（22.76±0.63）mmol/L vs （7.58±0.82）mmol/L，P<0.05］；而末周体重比较差异无统计学意义［（20.00±2.64）g vs （19.70±0.99）g，P>0.05］。T2DM-KPC组和T2DM-胰腺癌组均在注射STZ后血糖上升，且连续3次以上空腹血糖≥11.1 mmol/L，成功复现T2DM代谢特征，且两组体重和血糖比较，差异均无统计学意义（P值均>0.05）（图6）。

2.5.3 各组病理学特征比较

2.5.3.1 T2DM-KPC组和KPC组比较

（1）肿瘤组织肉眼观：两组肿瘤组织均呈不规则形态、颜色灰白，质地稍硬脆（图7）。（2）肿瘤组织镜下观：肿瘤组织与正常组织边界不清，肿瘤细胞排列成形状各异的腺管样结构，细胞异型性明显、核深染、核浆比增高，存在大量的纤维间质。其中KPC组仍可观察到较多正常的胰腺组织，T2DM-KPC组大部分胰腺组织已被肿瘤组织取代，仅残留少许非肿瘤性导管及腺泡（图8），说明T2DM-KPC组肿瘤较KPC组侵袭性更强。

2.5.3.2 T2DM-胰腺癌组和单纯胰腺癌组比较

（1）肿瘤组织肉眼观：两组肿瘤组织均呈类圆形，灰白灰红色，质地稍硬脆（图9）。（2）肿瘤组织镜下观：大部分肿瘤呈低分化，缺乏腺管结构，癌细胞排列成条索状或实性细胞巢，与周围组织分界不清，肿瘤细胞异型性明显，核分裂象多见（图10）。

2.5.4 各组病理学微环境特征相似性评价

胰腺癌具有复杂的微环境，高增殖和高纤维化是其特征性表现。采用免疫组织化学和Masson染色分析各组的微环境特征，其中Ki-67作为评价肿瘤增殖情况的指标，α-SMA和Masson作为评价肿瘤纤维化的指标（图11）。

Ki-67阳性率分析：KPC组为38.59%±1.34%，T2DM-KPC组为50.63%±5.66%，单纯胰腺癌组为17.95%± 7.48%，T2DM-胰腺癌组为39.35%±3.27%，T2DM-KPC组明显高于KPC组，T2DM-胰腺癌组明显高于单纯胰腺癌组，T2DM-KPC组明显高于T2DM-胰腺癌组（P值均<0.05）。

α-SMA平均光密度值分析：KPC组为639 121±112 851，T2DM-KPC组为1 247 402±132 546，单纯胰腺癌组为283 864±37 453，T2DM-胰腺癌组为619 412±112 851，T2DM-KPC组明显高于KPC组，T2DM-胰腺癌组明显高于单纯胰腺癌组，T2DM-KPC组明显高于T2DM-胰腺癌组（P值均<0.05）。

Masson染色阳性率分析：KPC组为54.96%±3.92%，T2DM-KPC组为72.17%±7.79%，单纯胰腺癌组为23.73%±5.31%，T2DM-胰腺癌组为48.07%±10.22%，T2DM-KPC组明显高于KPC组，T2DM-胰腺癌组明显高于单纯胰腺癌组，T2DM-KPC组明显高于T2DM-胰腺癌组（P值均<0.05）。

3 讨论

T2DM合并胰腺癌的共病模型研究可为糖尿病合并胰腺癌的体内研究提供实验载体，具有重要研究价值。研究表明，只有雄性小鼠诱导后可出现空腹高血糖、空腹高胰岛素血症和胰岛素抵抗等T2DM症状；而雌性小鼠“高脂饮食+STZ”诱导后仍常维持相对正常的空腹血糖和胰岛素水平（即“代谢健康型肥胖”表型），难以复现人类T2DM的典型病理进程^［8］。因此，本研究均采用雄性小鼠进行建模。模型的第一阶段通过“高脂饮食+STZ”诱导T2DM模型，较好地模拟了T2DM患者从胰岛素抵抗到胰岛β细胞损伤的自然病程。第二阶段则采用两种不同策略实现成瘤。传统成瘤方法为外源性细胞注射或瘤块移植启动肿瘤，但这种人为干预肿瘤，不能从机制上模拟T2DM患者自发胰腺癌的过程^［9］，且模型采用的裸鼠具有T细胞免疫缺陷，因此无法进行TME代谢-免疫交互评估。本研究中的传统模型采用T2DM裸鼠皮下注射人胰腺癌导管细胞PANC-1的细胞悬液，直到形成皮下移植瘤；新型模型则利用基因编辑技术构建KPC小鼠，选择PDAC中最常见的两个突变基因：Kras原癌基因和Trp53抑癌基因^［7，10］，编辑后特异性地纳入小鼠胰腺，使小鼠体内自发性生成胰腺肿瘤，构建自发胰腺癌小鼠，以高保真度模拟人类胰腺癌的发生发展。相比传统模型，KPC小鼠能更精准地复现人类PDAC的基因突变谱；还具有纤维增生和免疫系统完整的特点，是研究胰腺癌免疫逃避机制和评价免疫联合疗法的最优选择^［11］。本研究对采用基因编辑产生的KPC小鼠进行代谢干预（即T2DM的诱导），从而构建新型T2DM自发胰腺癌小鼠共病模型。

本研究从成瘤特征、代谢表型、分子分型、组织病理学特征和病理学微环境特征5个方面对模型进行了有效性验证。在成瘤特征方面，有研究认为KPC模型存在成瘤时间长和成瘤率低的缺陷^［12］。但本研究中T2DM-KPC组和T2DM-胰腺癌组在成瘤率和成瘤时间上的差异均无统计学意义。在代谢表型方面，T2DM-KPC组和T2DM-胰腺癌组均在注射STZ后呈现血糖上升趋势，且连续3次以上空腹血糖≥11.1 mmol/L，成功复现T2DM代谢特征，且两模型组的体重和血糖水平差异无统计学意义。值得注意的是，两组模型在代谢干预的过程中存在细微差别：T2DM-胰腺癌组在注射STZ后1周内血糖急速上升，而T2DM-KPC组由于Kras、Trp53和Pdx-1 3个基因的相互作用，使其对STZ敏感性降低，导致血糖升高反应时间比T2DM-胰腺癌组长；T2DM-KPC组小鼠在病变后期出现胸腹水，导致某些个体的体重出现反增长趋势。在分子分型方面，通过测序证实，KPC组模型与人类PDAC的胰祖细胞型高度相似，特征性高表达Muc1、Hes1和Hnf4a等基因；T2DM-KPC组模型与人类PDAC的免疫原性型高度相似，特征性高表达Cd74、H2-Ab1和H2-Aa等基因。在组织病理学特征方面，T2DM-KPC组镜下可见：肿瘤组织与正常组织边界不清，肿瘤细胞排列成形状各异的腺管样结构，细胞异型性明显、核深染、核浆比增高，存在大量的纤维间质。与KPC组仍可观察到较多正常的胰腺组织相比，T2DM-KPC组大部分胰腺组织已被肿瘤组织取代，仅残留少许非肿瘤性导管及腺泡，说明T2DM-KPC组肿瘤较KPC组侵袭性更强，这与文献报道高糖环境可促进胰腺癌的发生发展相符^［9］。与T2DM-胰腺癌组镜下观大部分肿瘤呈低分化、缺乏腺管结构、癌细胞排列成条索状或实性细胞巢相比，T2DM-KPC组镜下观肿瘤细胞排列成形状各异的腺管样结构，与人类PDAC的形态高度相似，即新型模型组能更真实地反映人类原发PDAC的组织病理学特征。在病理学微环境特征方面，肿瘤增殖指标Ki-67阳性率、纤维化指标α-SMA平均光密度值、纤维化指标Masson染色阳性率分析均显示，T2DM-KPC组明显高于T2DM-胰腺癌组（P值均<0.05）。上述结果表明，T2DM-KPC组肿瘤增殖和纤维化程度相较于T2DM-胰腺癌组均明显升高，从病理学微环境特征角度印证了新型T2DM自发胰腺癌小鼠共病模型可以更好地复现人类PDAC的高增殖和高纤维化特征。

与传统模型相比，新型T2DM-KPC模型在以下方面具有显著优势。（1）免疫微环境模拟完整：T2DM自发胰腺癌小鼠新型共病模型保留完整免疫系统，支持免疫治疗研究。免疫抑制是胰腺癌研究的重要方向，在肿瘤免疫监视逃逸中发挥关键作用，免疫抑制环境也是临床耐药的主要因素，是影响免疫治疗效果的重要障碍^［13-14］。Minaei等^［15］通过对KPC小鼠局部化疗发现，肿瘤内浸润的细胞毒性CD8⁺ T细胞数量显著增加，同时免疫抑制性的调节T细胞显著减少，创造了有利于攻击肿瘤的免疫环境。Ma等^［16］研究表明，程序性死亡受体-1抑制剂和肿瘤坏死因子受体超家族成员4激动剂结合可降低KPC小鼠胰腺肿瘤中调节T细胞与耗竭T细胞的比例，并增加记忆CD4⁺和CD8⁺ T细胞的数量，能清除所有可检测到的肿瘤。另外，Li等^［17］研究发现，程序性死亡受体-1和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4抗体与全身性干扰素基因刺激蛋白激动剂结合，可以延长KPC小鼠的生存时间。而传统T2DM-胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型缺乏成熟T细胞，无法重建T细胞介导的免疫反应，只能单一地研究代谢紊乱对肿瘤细胞自身行为（如增殖、凋亡、糖代谢和糖酵解）的直接效应，也无法重现胰腺癌标志性的高纤维增生。且皮下环境无法模拟T2DM如何通过影响成纤维细胞和免疫细胞间接促进胰腺癌的发生发展^［18］。因此，传统模型在精准医学中的应用价值受到根本性限制^［19］。（2）转移潜能差异：高度侵袭和早期转移是胰腺癌的致命特征。Fernandez等^［20］通过对比胰腺癌原位移植瘤和皮下移植瘤模型的转移率发现，原位移植瘤模型可转移至胰腺附近的多个器官；而皮下移植瘤模型几乎不发生转移，只浸润到邻近肌肉组织。原因可能是皮下肿瘤被包裹在纤维囊中，限制了癌细胞进入血液循环和淋巴系统^［21］。同时，皮下空间缺乏特有的基质细胞、细胞因子和细胞外基质，而这些因素对于肿瘤细胞的侵袭和转移至关重要。新型模型属于原位成瘤，易自发转移，更贴近临床实际。（3）时序机制研究：传统模型“先糖尿病后种瘤”是人为干预时序，而新型模型可探讨代谢紊乱如何促进癌变启动。

但本研究仍存在一定的不足之处：（1）T2DM-KPC小鼠等待自发成瘤时间不定，且干预时机模糊，糖尿病诱导与肿瘤发生的先后时机难以控制；（2）KPC小鼠属于基因工程小鼠，其自发肿瘤形成需4～6个月，实验周期长容易导致动物意外死亡风险升高（本研究中死亡率达14.29%～28.57%）；（3）存活的KPC小鼠自发肿瘤模型成瘤率约85.71%，存在天然损耗；（4）共病模型对小鼠造成双重疾病打击，可能进一步降低其存活率。因此，未来研究需进一步优化建模流程，提高模型的可控性与稳定性，以推动该共病模型的深化应用。

综上所述，本研究构建并评价两种T2DM胰腺癌动物模型，通过“T2DM自发胰腺癌”和“先诱导T2DM后皮下移植瘤”两种策略，均能成功建立T2DM胰腺癌共病模型，但两者在模拟人类PDAC的病理、TME复杂性及转化医学价值上存在显著差异。新型模型能够模拟并且遗传PDAC的组织病理形态，具有高增殖和高纤维化的特征，与人类PDAC有高度相似的遗传演进和免疫抑制微环境，适用于探索糖尿病在肿瘤启动和早期进程阶段的作用机制，对于模拟基因-代谢-免疫的多层次复杂互作具有重要的意义。

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基金资助

国家自然科学基金(81860508)