腺相关病毒载体在肝纤维化中的应用前景

The application prospects of adeno-associated virus vectors in liver fibrosis

摘要

肝纤维化是多种慢性肝病进展为肝硬化和肝癌的关键病理环节，其特征为肝星状细胞活化和细胞外基质过度沉积。目前临床治疗手段有限，而基因治疗作为一种新兴干预策略，正日益受到关注。腺相关病毒（AAV）凭借其低免疫原性、良好的组织靶向性和长期稳定的基因表达能力，已成为理想的基因治疗载体。本文系统综述了AAV载体的结构与功能特点、不同血清型的组织靶向性以及重组AAV的制备与纯化方法，重点阐述了AAV介导的基因过表达、基因沉默、基因编辑和细胞重编程在肝纤维化机制研究与干预中的应用进展，并探讨了其在临床转化中面临的挑战与应对策略。AAV介导的基因治疗技术有望为肝纤维化的精准治疗和机制研究提供新工具和新思路。

Abstract

Liver fibrosis is a critical pathological stage in the progression of various chronic liver diseases to liver cirrhosis and liver cancer， and it is characterized by the activation of hepatic stellate cells and excessive deposition of extracellular matrix. There are currently limited clinical treatment methods for liver fibrosis， and gene therapy has attracted increasing attention as a promising intervention strategy. Owing to its advantages of low immunogenicity， strong tissue tropism， and long-term gene expression， adeno-associated virus （AAV） has become an ideal vector for gene therapy. This article systematically reviews the structural and functional features of AAV， the tissue-targeting properties of different serotypes， and the methods for preparation and purification of recombinant AAV and focuses on the advances in the application of AAV-mediated gene overexpression， gene silencing， gene editing， and cellular reprogramming in mechanism research and intervention of liver fibrosis， as well as the challenges in clinical translation and corresponding strategies. AAV-mediated gene therapy is expected to provide novel tools and strategies for the precise treatment and mechanism study of liver fibrosis.

Graphical abstract

关键词

肝纤维化 / 依赖病毒 / 基因治疗

Key words

Hepatic Fibrosis / Dependovirus / Genetic Therapy

近年来，全球慢性肝病患者逐年增加，每年约有200万人死于相关并发症，且发病率呈持续上升趋势^［1］。肝纤维化是慢性肝病进展至肝硬化、肝癌等终末期肝病的关键环节，其本质是肝脏在长期损伤（如病毒、寄生虫感染、代谢异常或毒性刺激）后修复过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积的病理结果。肝纤维化的核心病理机制是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）异常活化并大量合成ECM，形成“炎症-纤维化”恶性循环^［2］。当前临床治疗（如病因控制、介入手术等）及传统基因治疗载体（如慢病毒、腺病毒等）存在疗效局限或安全性不足等问题。尽管肝纤维化是肝病恶化过程中可逆转的阶段之一，但目前的治疗方法（如药物治疗、介入治疗、细胞治疗和外科手术）均存在局限性和风险^［3］。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的基因治疗凭借其安全性高、基因传递效率高、免疫原性低等优点，已广泛应用于基因治疗领域^［4］。相较于慢病毒（易整合至基因组存在插入突变风险）、腺病毒（免疫原性高、基因表达持续时间短），AAV以非整合的附加体形式存在，且免疫原性低，在肝脏中可实现长达数年的稳定基因表达，显著降低了长期治疗的安全风险与给药频率^［5-6］。AAV能够将遗传物质（DNA、RNA）高效递送到靶器官的细胞中，克服传统载体难以实现稳定高水平基因表达的障碍，从而实现靶向干预疾病进程。近年来，AAV介导的基因治疗已在肺、肾和心脏等多种器官纤维化模型中显示出显著疗效，通过高效递送抗纤维化基因或调控纤维化相关信号的基因，能够有效减轻组织损伤和胶原沉积，为肝纤维化的基因干预提供了可借鉴的策略与技术基础^［7-9］。

通过AAV介导的基因治疗，可将抗纤维化基因或促进纤维降解的基因递送到肝细胞，从而干预肝纤维化进程。该技术已在动物模型和临床试验中展现出一定潜力，但仍需进一步研究和验证^［4］。本文旨在总结AAV载体在肝纤维化研究与治疗中的最新进展，重点探讨其在基因治疗中的应用潜力、当前挑战及未来发展方向，以期为该领域的进一步研究提供参考。

1 AAV的特性与基因治疗应用

AAV是一种非包膜的单链DNA病毒，基因组约4.7 kb，由复制相关蛋白基因（replication-associated protein gene，Rep）和衣壳蛋白基因（capsid protein gene，Cap）组成，两端为145 bp的反向末端重复序列，在病毒复制和包装中发挥关键作用，也是构建重组AAV（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体时保留的唯一病毒元件^［10］。AAV基因表达由3个启动子（p5、p19、p40）调控，通过选择性剪接生成多种Rep蛋白（Rep78、68、52、40）和3种结构蛋白（VP1、VP2、VP3）（图1a）。这些结构蛋白以1∶1∶10的比例组装成60个亚单位的病毒衣壳，在装配激活蛋白的帮助下构成完整病毒粒子。基于该结构，rAAV载体的设计仅保留反向末端重复序列，将中间的Rep和Cap基因替换为调控元件和目的基因（图1b）。AAV为复制缺陷型病毒，其生命周期依赖于腺病毒等辅助病毒，缺乏时可整合潜伏，存在时可完成复制与释放^［11］。

AAV的衣壳蛋白决定其血清型和组织靶向性。目前已鉴定的血清型包括AAV1～13及多种变体，不同血清型的组织亲和力存在显著差异。例如，AAV2适用于神经、肝脏和眼部转导，AAV8肝脏亲和性高，AAV9可穿越血脑屏障^［12］。为进一步提升特异性和效率，研究者利用衣壳工程技术和定向进化策略，开发出具有嗜神经性与逆行性等的新型变体，实现脑、脊髓等组织的高效递送^［13］。

作为基因递送载体，AAV的核心优势在于其低免疫原性、可感染非分裂细胞，并能介导长期稳定基因表达的能力^［14］。其感染机制包括：AAV衣壳与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体结合，通过内吞作用进入早期内涵体，经运输至细胞核解体释放单链DNA，再转化为转录活性双链DNA，从而启动基因表达（图2）。目前已有多种AAV基因治疗产品获批上市，使其成为遗传病及慢性疾病治疗的核心工具^［15］。此外，rAAV的构建通常采用人胚肾293细胞三质粒瞬时转染法，将转移载体、Rep/Cap质粒及辅助质粒共转染表达，工业化生产常结合亲和与离子交换层析等纯化步骤，以去除杂质和空壳，提升载体质量^［16］。

2 AAV在肝纤维化基因治疗中的应用

AAV载体因其免疫原性低、长期表达等独特优势，已成为肝纤维化基因治疗研究的重要工具。其应用策略主要包括基因过表达、基因沉默与干扰、基因编辑以及靶向治疗进阶4个类别。

2.1 AAV介导的基因过表达策略：增强肝脏保护与代谢重编程

基因过表达策略是一种主动“做加法”的干预理念，通过AAV递送内源性保护基因，从代谢失衡、氧化应激和信号转导等环节重构肝脏微环境，以中断纤维化的级联反应。早期研究多集中于补充关键代谢酶以纠正肝脏代谢紊乱。例如，利用AAV8血清型和肝细胞特异性启动子［甲状腺素结合球蛋白启动子（thyroxine-binding globulin，TBG）］驱动甘氨酸N-甲基转移酶过表达，可有效调节肝脏单碳代谢，减少促纤维化因子S-腺苷甲硫氨酸的堆积；在四氯化碳诱导模型中，该干预使血清丙氨酸氨基转移酶（alanine amino-transferase，ALT）与天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transferase，AST）水平下降约60%与55%，肝脏胶原沉积面积减少约50%^［17］。随着对疾病机制理解的加深，过表达策略逐渐转向更精细的分子事件。在代谢相关脂肪性肝炎（metabolic associated steatohepatitis，MASH）相关研究中，AAV8-TBG-scFv-E06载体通过表达靶向氧化磷脂酰胆碱的单链可变区抗体片段E06，有效清除该促炎信号，阻止了单纯脂肪肝向肝纤维化的进展^［4］。

最新研究趋势是利用代谢物本身激活保护通路。例如，AAV9血清型载体过表达酮体代谢限速酶β-羟丁酸脱氢酶1，通过恢复酮体代谢以提升其内源性激活剂富马酸的水平，从而激活核因子E2相关因子2通路，促进其核转位并增强抗氧化应答。在db/db糖尿病小鼠MASH模型中，该治疗可显著降低血清中转氨酶水平，马松染色显示肝纤维化程度明显减轻，且未改变血清中总胆固醇/甘油三酯水平，验证了该策略的精准性与安全性^［18］。

除代谢干预外，AAV过表达策略还广泛用于调控信号通路与免疫微环境。例如，AAV8-TBG-Cre在双特异性蛋白磷酸酶22基因敲入小鼠中特异性过表达该磷酸酶，通过抑制黏着斑激酶和丝裂原激活的蛋白激酶信号，显著缓解高脂高胆固醇饮食诱导的肝脏炎症和纤维化^［19］。在免疫调控方面，AAV9-HuR过表达系统通过稳定成纤维生长因子19 mRNA，抑制库普弗细胞M1型极化，从而使天狼星红染色的总胶原面积与Ⅰ型胶原表达显著下降，其浸润明显减少^［20］。

上述研究表明，AAV介导的基因过表达不仅能从代谢和氧化应激层面改善肝功能，还能通过重塑肝脏微环境阻断HSC活化与胶原沉积，为肝纤维化的代谢性干预提供了重要思路。

2.2 AAV介导的基因沉默与干扰策略：精准关闭致病基因

基因沉默策略是一种“做减法”的精准干预方式，利用AAV递送短发夹RNA或微小RNA，在转录后水平高效敲低促纤维化基因。该策略的发展趋势是从广泛的肝细胞靶向，逐步转向对核心效应细胞（如HSC）和肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）的特异性干预。

在肝细胞层面，基因沉默导致线粒体功能障碍、细胞衰老或信号通路异常的关键基因，显示出强大的抗肝纤维化潜力。例如，AAV8-TBG-shATAD3通过抑制线粒体ATP酶家族蛋白3恢复线粒体功能，缓解p53（抑癌蛋白）异常激活导致的细胞衰老，使p21（促进衰老基因）和衰老相关细胞数减少70%以上，肝脏羟脯氨酸含量下降约40%^［21］。另一方面，针对促纤维化信号轴的干预则体现了系统性的治疗思路。AAV-shFGF9可阻断成纤维细胞生长因子9/转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）促纤维化轴，显著减少肝纤维化及肝细胞癌发生^［22］；此外，调节细胞自身的“清洁”系统——自噬，也成为新的突破口。例如，AAV介导的肝特异性应激蛋白TRIB3沉默通过恢复肝细胞自噬流，减少富含促活素A的促纤维化外泌体分泌，从而显著减轻胆管结扎及硫代乙酰胺诱导的肝纤维化进展^［23］。

针对核心效应细胞HSC的靶向干预也取得进展。AAV8-GFAP-miR-214系统利用HSC特异性胶质纤维酸性蛋白启动子驱动miR-214表达，实现HSC精准靶向，抑制其增殖与ECM生成，且不影响脂质代谢或炎症状态^［24］。前沿研究进一步探索LSEC靶向，例如在血管内皮钙黏附蛋白启动子调控下，si-ATG5 AAV与si-RAB27a AAV载体可分别敲低LSEC中的自噬相关基因5和RAS相关蛋白RAB27a，抑制自噬并促进外泌体积累，从而增强对HSC的抑制。这揭示了通过调控非实质细胞间接缓解肝纤维化的新思路，为抗纤维化治疗提供了全新的细胞靶点^［25］。

因此，AAV介导的基因沉默通过多层次抑制HSC活化、恢复肝细胞自噬与改善肝窦功能，从根本上阻断肝纤维化的形成与进展。

2.3 AAV介导的基因编辑策略：从调控到根治的飞跃

与可逆的基因沉默不同，基因编辑策略追求基因组的永久修正。AAV与CRISPR/Cas9系统的结合，为实现“一劳永逸”的治疗提供了可能，使抗纤维化治疗从调控迈向根治。早期研究集中于促纤维化基因的敲除与信号阻断。例如，AAV8-CRISPR/金黄色葡萄球菌Cas9系统直接敲除TGF-β1与结缔组织生长因子基因，使肝组织胶原区域减少约65%^［26］。针对MASH根源，AAV8-sgMCU通过敲低线粒体钙单向转运体的表达，改善线粒体功能并抑制MASH小鼠HSC活化及胶原沉积^［27］。

安全性与特异性是基因编辑临床转化的关键。为突破AAV单载体容量限制，研究者建立了基于AAV8的双载体系统，分别递送Cas9与单链向导RNA，在体内重建完整的CRISPR编辑装置。该策略将Cas9表达与编辑活性严格限定于肝脏，在新生小鼠中实现约40%的编辑效率，且未检测到脱靶整合事件。通过设计Cas9短暂表达，有效降低了免疫原性和长期脱靶风险，为临床应用奠定了安全基础^［28］。

目前，基因编辑的应用已从基因敲除转向更精细的转录调控和精准修复阶段，最新研究正将AAV-CRISPR拓展至更精细的转录调控与遗传修复。例如，通过AAV递送失活Cas9与转录抑制/激活结构域融合，研究者开发出了CRISPR转录抑制和CRISPR转录激活系统。前者可特异性抑制如前蛋白转化酶枯草溶菌素9等致病基因的转录，后者则能上调如肝核因子4α等保护性基因的表达，实现了对基因功能的多维调控^［29］。突破性进展在于碱基编辑技术的应用，AAV载体能够在不造成DNA双链断裂的情况下实现单碱基的精准转换。研究者采用AAV8-eNme2.C-TadA9e系统（一种高效、紧凑的碱基编辑器），成功在动物模型中纠正了导致α1-抗胰蛋白酶缺乏症的丝氨酸蛋白酶抑制因子家族A成员1 Z等位基因PiZ突变，从根源上消除了致病性的Z型α1-抗胰蛋白酶聚合物积聚，使血清α1-抗胰蛋白酶水平恢复至生理保护范围^［30］。这表明AAV介导的基因编辑已具备根治某些单基因遗传因素所致肝纤维化的能力，为未来临床转化奠定了坚实的基础。

上述研究展示了AAV-CRISPR平台在直接修复或永久阻断促纤维化基因方面的潜力，为实现肝纤维化的基因根治提供了重要技术支撑。

2.4 AAV与靶向治疗进阶：衣壳重编程、细胞命运调控与联合治疗

AAV在肝纤维化领域的进展聚焦于载体优化与细胞重编程两大方向。

在载体优化方面，AAV衣壳工程通过调控组织趋向性以显著降低脱靶风险。例如，AAV9-GA/GAST衣壳p3位点第266位氨基酸G/A突变实现肝脏脱靶，可使肝脏中AAV DNA水平大幅下降，同时保留其他组织转导效率。另一种思路是利用化学生物学方法，将AAV与靶向肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的N-乙酰半乳糖胺分子偶联，共同递送CRISPR系统组件。这种策略不仅提高了肝脏靶向性，也增强了引导RNA的稳定性，并通过分次给药验证了其可重复递送的潜力，为需要多次给药的临床场景提供了解决方案^［31］。

在细胞重编程方向，早期研究表明，AAV通过递送肝细胞特异性转录因子（肝核因子4α、叉头盒A1和叉头盒A3等），可将肝纤维化过程中的主要效应细胞——肝肌成纤维细胞直接转化为功能性肝细胞，实现了“消除致病细胞”与“补充功能细胞”的双重目标，不仅抑制了纤维化的根源，更主动促进了肝组织的再生与修复，在动物模型中表现出逆转肝纤维化的巨大潜力^［32］。近期研究则结合AAV-短发夹RNA沉默细胞间质上皮转换因子重塑肝脏微环境，以提高肝源性干细胞移植效率。该策略通过阻断肝细胞生长因子/细胞间质上皮转换因子信号，为干细胞提供适宜的生存空间，仅需移植5×10⁴个细胞（远少于常规用量）即可取得相当疗效，并显著降低胶原沉积与血栓风险^［33］。

综上所述，AAV在载体设计与细胞重编程方向的创新，为实现更高靶向性、更低毒性和更强再生能力的肝纤维化综合治疗提供了新的技术途径（表1）。

3 AAV介导基因治疗的安全性与挑战

AAV凭借其低致病性、低免疫原性以及广泛的细胞感染能力，已成为基因治疗中最具应用前景的载体之一。然而，其免疫原性仍是主要应用障碍，可能削弱疗效并引发潜在安全问题。部分患者体内可能已经存在针对AAV衣壳的中和抗体，即使在较低滴度下，这些中和抗体仍可以中和AAV载体，削弱病毒的转导效率，导致基因表达失败^［34］。此外，高剂量给药可激活T细胞和B细胞，攻击转导细胞或产生抗体，引发炎症并降低疗效^［35］。在肝纤维化背景下，由于库普弗细胞活化和慢性炎症环境持续存在，可能进一步加剧免疫反应，可能加速AAV清除并削弱治疗稳定性^［36］。为克服这一问题，研究者已开发免疫逃逸策略，例如将AAV9衣壳中免疫显性T细胞表位关键氨基酸替换为AAV5同源序列，以保持高转导效率并降低外周血单核细胞免疫反应^［35］。此外，衣壳工程改造、新型血清型设计及免疫抑制剂联合使用等方法，也显示出在纤维化肝脏中改善免疫耐受性的潜力^［37］。

AAV的遗传毒性和组织嗜性同样需要关注。虽然AAV通常以游离的附加体形式存在，但已有研究报道，在小鼠模型中可观察到低频率的基因组整合事件，尤其倾向于发生在活跃转录基因区、核糖体DNA区域或胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸岛附近，并偶有引发肿瘤^［38］。尽管在大型动物和人类长期研究中尚未发现明确基因整合导致的致癌案例，但在肝纤维化状态下，肝细胞再生活跃、DNA修复频繁，理论上可能增加随机整合风险，因此应加强长期安全性监测。

不同AAV血清型表现出鲜明的组织嗜性，例如，AAV6和AAV8对肝脏具有高亲和力，而AAV5则在中枢神经系统中转导效率较高。这种特异性为靶向治疗提供了便利，但同时也可能带来肝毒性或非靶组织中的脱靶表达与副作用等潜在风险^［12］。因此，在推进AAV载体临床转化的过程中，必须全面评估其体内分布、表达特异性及潜在毒性，以确保基因治疗兼具高效性与安全性。

4 总结与展望

AAV介导的基因治疗已成为肝纤维化研究的重要工具，其在基因过表达、RNA干扰和CRISPR/Cas9编辑等领域的应用，不仅深化了对HSC活化及ECM失衡机制的理解，也推动了多种基因靶向治疗策略的开发。AAV8、AAV9等血清型凭借高效的肝脏靶向性和持久表达特性，为精准递送治疗基因提供了独特优势。

然而，该技术的临床转化仍面临多重挑战。宿主预存的中和抗体和载体引发的免疫应答限制了转导效率及表达持久性；尽管AAV基因组主要以游离的附加体形式存在，但在小鼠模型中观察到的低频整合事件提示其潜在的遗传风险；此外，纤维化肝脏中异常沉积的基质蛋白、紊乱的血窦结构和增加的基质刚度，也从物理和生物学层面阻碍了病毒的有效扩散与感染。

未来研究可重点优化AAV血清型选择与衣壳工程，提升其在病理状态下的传递能力，并结合CRISPR/Cas系统、RNA干扰或纳米递送平台等新技术，实现更高效、更安全的基因干预手段，为肝纤维化的精准治疗提供坚实支撑。

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基金资助

国家自然科学基金项目(82260407)

广西自然科学基金项目(2023GXNSFAA026072)