尼罗红染色聚苯乙烯微塑料新方法开发

Development of a New Method for Dyeing Polystyrene Microplastics with Nile Red

摘要

对微塑料的分析研究需从量化方法开始。目前，针对微塑料常使用的染色方法都存在荧光强度较低和染色分布不均匀的缺点。文章采用了旋转蒸发法（旋蒸法）和尼罗红（NR）染料对聚苯乙烯微塑料（PS）进行染色。采用扫描电镜（SEM）和红外光谱法（FTIR）对比染色前后PS的微观结构和表面基团的变化，利用流式细胞仪对荧光PS（FPS）的数量进行统计并与荧光法测定结果对照。结果表明：旋蒸法对PS的染色效果符合预期，定量分析小尺寸FPS的相对标准偏差在10%以内，且FPS的荧光信号强，易于检测。在FPS的稳定性测试中发现，该方法的染色效果较稳定，适用于对不同尺寸的PS和在模拟环境中的样品进行染色。

关键词

聚苯乙烯微塑料 / 荧光分析 / 旋转蒸发 / 流式细胞仪 / 定量分析

Key words

Polystyrene microplastics / Fluorescence analysis / Rotary evaporation / Flow cytometry / Quantitative analysis

过去几十年塑料制品的生产量和使用量持续上升^[1]，塑料在自然环境下难以降解，容易引起环境污染问题^[2-3]。2004年Thompson等提出“微塑料”概念，相关环境问题也随之得到科研人员的广泛关注^[1]。通常将尺寸介于0.1~5 000 μm的塑料碎片或颗粒称为微塑料^[4]。微塑料的主要来源一般为工业制造、个人护理产品等生产过程中产生的微米级塑料颗粒，由农用地膜、塑料制品等大块塑料垃圾经物理、化学和生物过程不断破碎而产生的塑料颗粒^[5-6]。塑料颗粒的持续排放和低降解性使其积聚在水体^[7]、沉积物^[8]、土壤^[9]和大气^[10]等环境基质。研究表明，微塑料会通过食物链运输进入生物体内^[11-12]，可能危害人体健康并且破坏生态系统的稳定性^[13]。此前，针对微塑料的检测已经开发出多种方法，例如傅里叶变换红外光谱^[14]、拉曼光谱^[15]、气相色谱-质谱^[16]、扫描电子显微镜^[17]等，但这些方法成本较高，也不利于微塑料的定量分析。显微镜手动计数是量化微塑料应用广泛的方法之一，该方法简单方便，但在操作过程中存在人为因素导致样本标准差过大^[18]。近年来，开发了用荧光染料染色微塑料再检测荧光信号的便捷有效的量化微塑料的方法^[19]。MAES等^[19]比较了多种染料，如油溶红EG、伊红B、孟加拉玫瑰红、克莱恩荧光黄、3G染料和尼罗红(NR)对微塑料的染色效果，对比发现NR染色微塑料的效果最好。TAMMINGA等^[20]发现，经NR染色的微塑料存在染色均匀性较差、荧光信号较弱的问题，尺寸大于1 mm的微塑料约95%可以被检测，而尺寸小于1 mm的微塑料只能检测71.7%。LÜ等^[21]通过改进微塑料的染色方法提高检测定量微塑料的准确性，基于塑料的热胀冷缩特性，使塑料颗粒分散在V（超纯水）∶V（二甲基亚砜）=1∶1的混合溶液，通过加热使染料分子进入微塑料内部，从而使微塑料被染色，但在微米级的小尺寸微塑料颗粒的染色量化实验中仍存在准确度不高和精密度不好的情况。旋蒸法是一种快速挥发分离溶剂的技术，常用于有机合成过程中反应产物的分离纯化，可以使溶剂快速脱除并回收，实现溶剂的二次利用，减少环境污染^[22-23]。在前人研究的启示下，本实验采用旋转蒸发技术，利用NR对微塑料进行染色研究，优化染色条件，并运用流式细胞仪和荧光分光光度计对不同质量浓度和不同尺寸的荧光聚苯乙烯微塑料(FPS)的个数和荧光强度进行分析，验证该方法在检测和定量FPS方面的有效可靠性。

1 实验部分

1.1 主要原料

乙腈、甲醇、二氯甲烷、黄腐酸(FA)、碳酸氢钠(NaHCO₃)、氯化钙(CaCl₂)、尼罗红(NR)染料，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；聚苯乙烯(PS)塑料，6.5、13、50和100 μm，丰泰高分子材料有限公司；聚四氟乙烯膜(PTFE，0.22 μm)，50 mm，佐克生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪，N-1100，上海爱朗公司；荧光分光光度计，F4600，日本日立公司；流式细胞仪，FACS Verse，美国BD公司；全自动倒置荧光显微镜，DMi8，德国Leica公司；扫描电子显微镜(SEM)，JSM-7500F，日本电子株式会社；傅里叶红外光谱仪(FTIR)，Fourier Transform，美国PE公司；循环水真空泵，SHZ-D(Ⅲ)，巩义市予华仪器有限责任公司；紫外灯(38 W)，EC-TL01B，佛山益辰电子科技有限公司。

1.3 样品制备

使PS样品(0.500 0±0.000 4) g均匀分散在溶剂中并加入NR染料，反应体积为50 mL，混合均匀后通过旋转蒸发仪对PS进行染色，水浴锅温度设定为40 ℃。将PS分散在FA、NaHCO₃和CaCl₂水溶液中恒温振荡24 h获得模拟水样中的PS样品。待反应结束后，用溶剂少量多次地转移蒸馏瓶内壁的FPS至抽滤瓶过滤，并反复洗涤，将FPS置于培养皿，自然风干。为验证FPS的长期稳定性，将FPS样品置于紫外灯(38 W，25 ℃)下连续照射5 d老化^[24]，再与未老化FPS的荧光强度进行对比；将含有FPS的悬浮液置于恒温摇床振荡24 h进行脱色实验，每隔6 h取样，通过0.45 μm的滤膜，收集滤液进行荧光强度测试检测其脱色情况。

1.4 性能测试与表征

荧光强度测试：称取一定质量的FPS于蒸馏水中，超声10 min使其均匀分散后定容；用荧光分光光度计测定FPS的荧光强度，激发波长543 nm，发射波长620 nm，入射狭缝和出射狭缝均为20 nm，电压650 V。通过比较相同质量浓度(200 mg/L)FPS的荧光强度评判微塑料的染色效果，通过测定不同质量浓度(10、25、50、80、100、125、200、250 mg/L)FPS的荧光强度，确定质量浓度和荧光强度之间的函数关系。

数量测试：使用流式细胞仪对荧光强度测试样品进行测定，确定浓度与个数之间的函数关系。

SEM测试：通过扫描电子显微镜在1 kV的加速电压下观察塑料的表面结构。

FTIR测试：使用DTGS检测器，光谱范围为400~4 000 cm^-1，光谱分辨率为4 cm^-1。

荧光显微镜测试：通过全自动倒置荧光显微镜在细胞计数器上观察FPS颗粒并拍摄图片，荧光曝光时间为20 ms~5 s。

2 结果与讨论

2.1 旋转蒸发法的筛选

本实验以小尺寸PS(6.5 μm)为染色对象，对比浸泡^[25]、直接旋转蒸发和浸泡后再旋转蒸发等染色方法的差异性。图1为不同染色方法比较及FPS的荧光稳定性测试。从图1a可以看出，直接旋蒸法染色可以使PS的染色效果较浸泡法显著提高，FPS的荧光强度从1 169.50增加到3 718.30。而预先浸泡30 min后再旋转蒸发可使荧光强度增加到4 196.50。由此表明，浸泡后旋蒸染色法对小尺寸的PS染色能力突出，进一步提升对PS的识别效率。

旋转蒸发仪在染色过程中会受到转速、冷凝水流速、水浴锅温度等因素影响^[26]。这些因素影响溶剂蒸发速率，可能导致PS的染色效果存在差异，该方法的染色稳定性至关重要。在稳定性实验中，采用浸泡后再旋蒸方法进行10组平行的染色实验。从图1b可以看出，在95%的置信度下，FPS在最大发射波长620 nm处荧光强度的置信区间为4 313.73±217.06，且在600~700 nm之间只有一个波峰，与NR染料的波峰吻合，即检测过程中仅存在染料本身的荧光信号，而不受PS基底影响。

2.2 染料浓度和体积变化对染色效果的影响

染料浓度是微塑料染色的重要影响因素之一^[27]。本实验固定PS投加量为0.500 0 g，探究了NR浓度变化对FPS的影响。图2为染料浓度和反应体积变化对PS染色的影响。从图2a可以看出，在1~10 mg/L染料浓度范围内FPS荧光强度与NR浓度之间呈现良好的线性关系，浓度继续增加，FPS荧光强度检测出现较大误差，说明过高的染料浓度会影响对FPS的染色效果。原因在于荧光微塑料的荧光强度随NR染料浓度的升高而降低^[21]。将NR染料的质量浓度控制在10 mg/L范围内，既不影响检测又可以降低染料聚集的影响^{[20, 26]}。

实验过程中，发现PS的染色效果受到反应总体积的影响。从图2b可以看出，在95%的置信度下，荧光强度的置信区间分别为1 985±425.7、4 313.73±217.06、5 556.33±914.02、6 649.67±1 058.99。FPS的荧光信号随着染色反应体积的增大而提高。实验结果表明，PS在染色过程中所受影响因素较多，应该严格统一标准，确保后续实验的精准性。

2.3 正交试验设计

NR染料是一种疏水性染料^[28]，需要将其溶解在有机溶剂中使用，且NR在不同溶剂中存在变色效应。NR结构的芳环上含有极性基团羧基(—COOH)，使其荧光光谱对溶剂极性有依赖^[29]。本实验中所选用的甲醇、乙腈和二氯甲烷是实验室常用的极性溶剂，PS可在其中均匀分散，且兼具沸点低、价格低的特点。在正交试验设计中，基于前期染料浓度的实验探究，初步将染料初始质量浓度选定为1、5、10 mg/L三个水平进行分析；而PS初始质量浓度结合文献调研选择1、5、10 g/L三个水平^[21]。确定溶剂种类、PS初始质量浓度和NR染料初始质量浓度这三个因素作为正交试验的影响因素，每个因素取三个水平。表1为L₉(3⁴)正交试验因素水平设计。正交试验中反应体积设定为100 mL，以便于减小实验过程中低浓度取样产生的称量误差。表2为L₉(3⁴)正交试验结果。

实验中发现二氯甲烷会溶解PS，破坏了其原始形态，因此无法用二氯甲烷为染色溶剂。图3为FPS的正交试验荧光强度。从表2可以看出，荧光强度极差R的大小排序为：R _A＞R _C＞R _B，即PS染色过程中受影响因素的主次顺序：溶剂种类＞NR染料初始质量浓度＞PS初始质量浓度。正交试验优化筛选出PS染色的最优染色条件为A₁B₃C₃，即乙腈作溶剂，PS初始质量浓度为10 g/L，NR初始质量浓度为10 mg/L。该结果与图3中荧光强度图所示的最佳染色条件一致，这说明该条件下染色的PS荧光强度最利于量化检测分析。

2.4 FPS的定量分析

流式细胞仪作为一种功能强大的有荧光特性的细胞绝对计数工具，可对与活体细胞(5~200 μm)尺寸大小相近且具有荧光特性的FPS进行数量统计。图4为FPS的流式细胞检测结果及标准曲线。

在FPS定量分析中，选择质量浓度为10、80、250 mg/L的FPS，流式细胞仪检测结果（FSC-SSC散点图）作部分展示，分别对应图4a~图4c。图中红点突出部分代表荧光颗粒的大小和丰度情况，红色区域面积随FPS悬浮液浓度的增大而增大，且荧光颗粒的数量占检测到的总颗粒数的98%以上，表明FPS染色效果良好。从图4d可以看出，不同质量浓度的FPS与其检出数量之间存在良好的线性关系(R ²=0.995 0)。该批样品的浓度和荧光强度之间同样具有良好的相关性(R ²=0.997 9)。由此说明，两种计量方法的分析检测效果保持一致，使用荧光分光光度计进行定量分析是可行的。

2.5 染料对微塑料的微观影响

在微塑料染色的相关研究中，对微塑料的结构成分进行分析也是非常重要的一项环节。为了确认NR染料对染色后的微塑料是否有影响，通过SEM对6.5 μm PS的微观结构进行观察。图5为PS染色前后的相关表征。从图5a和图5b可以看出，与未经染色处理的PS相比较，FPS表面形貌并没有发生显著变化，与未经染色处理的PS形貌相似，均为规则的球体结构。从图5c可以看出，NR染色后的PS具有荧光特性。从图5d可以看出，FPS的FTIR谱图与未处理的PS谱图结构一致，没有新的吸收峰。并且，该分析结果与文献[21]报道的研究结果一致，即染料对微塑料的成分并没有显著影响。由此表明，PS在乙腈作溶剂的条件下，加热处理的染色过程中可以保持形貌结构稳定。

2.6 旋转蒸发法的普遍适用性验证

塑料颗粒的物化性质是影响染色的重要原因^[30]。实际环境中微塑料组分复杂，旋蒸法对实际样品及不同尺寸PS的染色效果的检测的准确性也需要着重考察。对不同尺寸大小PS进行染色实验，图6为不同粒径FPS的定量分析结果。从图6a、图6d和图6g可以看出，13、50、100 μm等尺寸的PS经染色处理后，在荧光测试中均检测出唯一的波峰，说明不同尺寸的微塑料均能被成功染色。在95%的置信度下，荧光强度的置信区间分别为2 278.13±196.77、8 102.08±915.18和1 875.00±266.98；相对标准偏差分别为6.95%、11.29%和14.24%。从图6b、图6e、图6h和图6c、图6f、图6i可以看出，对于不同尺寸的FPS，质量浓度与荧光强度和检测数量之间也存在良好的线性相关性(R ²＞0.99)。但是，100 μm PS的相关性较差，其原因主要是PS尺寸越大，越容易发生沉降，导致仪器在检测量化大尺寸FPS过程的误差增大。由此说明旋蒸法在不同尺寸PS能够有效染色，相应的检测误差随尺寸增大而增大。同时，利用质量浓度与荧光强度的线性关系进行定量分析的方法更适用于能够形成稳定悬浮液的小尺寸的微塑料。

为了模拟PS在实际环境中染色过程，在PS-乙腈-NR体系中分别添加FA、CaCl₂和NaHCO₃溶液处理后的PS。图7为模拟实际样品中FPS的定量分析结果。

从图7a、图7d、图7g可以看出，经前处理实验后附着FA、CaCl₂和NaHCO₃的PS均能被成功染色。经数据分析，在95%的置信水平下，荧光强度的置信区间分别为4 575.33±201.78、4 410.33±427.48和4 811.50±330.49；各样品的相对标准偏差分别为4.41%、9.69%和6.87%。且上述FPS的荧光强度，与未经处理的PS的染色效果无明显差异。从图7b、图7e、图7h和图7c、图7f、图7i可以看出，对于吸附了不同组分的FPS，其质量浓度与荧光强度和检测数量之间也存在良好的线性相关性(R ²＞0.99)。这说明该染色法也可以对模拟实际水样中的PS进行染色和量化分析。

2.7 FPS稳定性实验

为了测试FPS的荧光稳定性，分别进行FPS的老化和脱色实验。图8为FPS的稳定性实验结果。从图8a可以看出，老化5 d的FPS仍能保持较强的荧光信号。从图8b可以看出，经连续振荡后取样测试的FPS滤液中也无明显的荧光信号变化，与空白样（蒸馏水）的荧光强度差异甚小，说明FPS可以在长时间内保持荧光稳定。该结论说明这种染色方法可产生稳定的荧光信号，确保了其广泛应用于实验条件和实际环境下的微塑料研究的可能性。

3 结论

针对微塑料的染色方法和量化分析进行研究，选择了NR为染料，在乙腈、甲醇等溶剂中采用浸泡后旋蒸法对不同尺寸的PS进行荧光染色实验。荧光实验测试及表征分析表明，该染色方法所制备的FPS荧光信号较强，微塑料的质量浓度与染色后的荧光强度存在良好的线性相关性，且与流式细胞仪对计数分析结果吻合。对染色后的FPS进行老化和脱色实验表明，该方法的染色效果稳定性好，荧光强度在24 h内不发生变化。因此，利用旋转蒸发法染色微塑料是一种有潜力且可靠可行的方法，该方法适用于利用荧光分光光度计或流式细胞仪对微塑料的检测和量化分析。

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基金资助

国家自然科学基金(31472293)