绿茶黄酮提取物/PVA薄膜的制备及性能研究

Preparation and Property Study of Green Tea Flavonoid Extract/PVA Film

摘要

以聚乙烯醇（PVA）为主要原料，从绿茶中提取黄酮类化合物，作为抗菌剂，制备抗菌性能良好的绿茶黄酮提取物/PVA薄膜。采用复合酶解法提取绿茶中总黄酮，测定绿茶中总黄酮的抗氧化活性以及抑菌能力。将绿茶提取液与PVA按比例混合，用流延涂板法制成复合保鲜膜。结果表明：绿茶提取液与PVA的体积比为4∶6最为合适，具有较好的力学性能和光学性能。绿茶中总黄酮的还原力与吸光度呈正相关，DPPH自由基清除率在85%~90%之间，OH自由基清除率在25%~50%之间。绿茶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单增李斯特菌均有明显的抑菌效果。绿茶/PVA复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.60 mm，其抑菌效果更为显著。研究为新型食品包装材料提供新思路，同时实现了绿茶的综合利用。

关键词

绿茶 / 总黄酮 / 抗氧化保鲜膜

Key words

Green tea / Total flavonoids / Antioxidant preservation film

包装是商品流通的必需品。软包装材料主要包括纸和塑料薄膜。塑料薄膜因其具有质量轻便、防水、易于携带、拉伸强度高等优良的特性，在包装领域占有很大的比重^[1]。传统塑料主要以乙烯母料为原材料，根据乙烯母料的不同种类，分为聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)^[2]、聚氯乙烯(PVC)等。这些高分子聚合物性质稳定^[3-4]，但存在不易降解、污染环境、危害人体健康等不利因素。聚乙烯醇(PVA)是由聚醋酸乙烯酯醇解得到，其分子内和分子间含有大量氢键，在细菌和酶的作用下^[5-7]，PVA在46 d内可降解75%，属于一种可生物降解的高分子材料^[8-9]。PVA薄膜具有良好的力学性能^[10]、耐化学性和气体阻隔性，可完全生物降解^[11-13]，广泛用于各种产品包装，符合绿色环保发展的需要。因此，用环保的PVA薄膜材料替代不可降解的PE和聚丙烯(PP)材料是未来的趋势^[14]。

活性包装材料是食品保鲜技术发展的重要方向，包装材料的抗菌性以及抗氧化性的优化将是包装后续研究的重点。抗菌型活性包装利用抗菌剂能够从基材中缓慢释放的原理，抑制或者杀死包装内部及食品中的微生物，即将抗菌剂等添加剂加入食品包装材料中，使薄膜具有抗菌性能和抗氧化性能，从而保证食品质量与安全^[15-17]。

绿茶属于不发酵茶，较多地保留了鲜叶内的天然物质，其中茶多酚含量较高，而茶多酚主要由黄酮类、酚酸类、花青素类、儿茶素类化合物组成^[18]。黄酮类化合物由于含有酚羟基结构而具有较强的抗氧化抑菌作用^[19-20]。本实验以提取绿茶中的黄酮类物质作为天然抗氧化剂，添加到PVA中，以提升薄膜的抑菌性能，扩大PVA薄膜的应用范围，为进一步研究绿色环保型食品包装材料提供新的思路。

1 实验部分

1.1 主要原料

绿茶，湖北麻城；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、芦丁标准品、乙二胺四乙酸二钠、三氯乙酸、溴甲酚绿指示剂、甲基红指示剂、氧化镁、硼酸、丙二醛乙缩醛、硫代巴比妥酸、焦性没食子酸、水杨酸、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯化铁、醋酸铅，分析纯，天津科密欧试剂有限公司；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌，河南牧业经济学院微生物实验室。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱，AE224，无锡玛瑞特科技有限公司；医用离心机，JW-2018H，郑州华锋仪器有限公司；紫外可见分光光度计，UV-1500，上海美普达仪器有限公司；（标准型）双人双面垂直工作台，SW-CJ-2F，洛阳弗莱仕金属制品有限公司；生化培养箱，SPX-250L，上海丙林电子科技有限公司；电热式压力蒸汽灭菌器，XFH-75CA，河南省三强医疗器械有限公司；恒温培养振荡器，ZWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司；测厚仪，CHY-C2A，济南兰光机电技术有限公司；智能电子拉力试验机，XLW，济南兰光机电技术有限公司；超声波清洗机，UVF，湖北汉朝机电设备有限公司；透光率/雾度测定仪，WGT-S，上海申光仪器仪表有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，DF-101S，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；自动凯氏定氮仪，K9840，海能未来技术集团股份有限公司。

1.3 样品制备

1.3.1 原料处理

将绿茶叶平铺在牛皮纸上，经40 ℃烘箱烘制8 h，取出，用研钵将其磨成粉末，过40目筛后装入密封袋，放入干燥器内。

1.3.2 绿茶抗氧化物质的提取

称取0.2 g绿茶粉末于烧杯中，加入0.001 0 g纤维素酶-绿色木霉，按1∶100的料液比加入85%乙醇，60 ℃水浴浸提70 min，取出后5 000 r/min离心10 min，过滤得到滤液^[21]。

1.3.3 绿茶提取液复合膜的制备

将10%的PVA溶液和绿茶抗氧化物质的提取液按不同体积比混合，得到绿茶提取液/PVA复合膜溶液，将所得混合溶液在电热真空干燥箱内进行超声脱气，在70 ℃、-0.09 MPa条件下抽真空。将脱气后的复合膜溶液倒在40 cm×50 cm玻璃板上，用两端缠有10圈透明胶带的玻璃棒擀制成膜。室温25~30 ℃，湿度30%~50%，静置24 h得到复合膜。表1为绿茶提取液/PVA混合溶液的组成。

1.4 芦丁标准曲线的绘制及绿茶中总黄酮含量测定

准确称取0.008 0 g芦丁标准品于小烧杯中，用60%乙醇溶液将其溶解，转移至50 mL的容量瓶中，稀释至刻度，将芦丁标准品配置成0.16 g/L的芦丁标准溶液，摇匀后，备用。随后用移液枪准确移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL的芦丁标准溶液于10 mL的容量瓶中，补充60%乙醇至5 mL。再依次加入亚硝酸钠溶液(0.3 mL，5%)和硝酸铝溶液(0.3 mL，10%)。每次加完试剂后应静置6 min，紧接着加入氢氧化钠溶液(4 mL，10%)，最后用蒸馏水定容，摇匀。静置15 min后，试剂空白作为参比液，在510 nm处测定标准溶液的吸光度。

准确移取1.5 mL绿茶提取液至10 mL容量瓶中，在相同实验条件下测定其吸光度。将测得的吸光度代入标准曲线方程计算绿茶中总黄酮的质量及绿茶中总黄酮的提取率，计算公式为：

\mathrm{绿茶} \mathrm{中总} \mathrm{黄酮} \mathrm{提取} \mathrm{率} = \frac{\mathrm{绿茶}\mathrm{中黄}\mathrm{酮质}\mathrm{量}}{\mathrm{绿茶}\mathrm{质量}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%} （1）

1.5 绿茶中总黄酮抗氧化能力的测定

1.5.1 总还原力测定

采用普鲁士兰法^[22]，取1.0 mL不同浓度的样品稀释液，依次加入pH值为6.6的磷酸盐缓冲溶液、1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀后于50 ℃水浴20 min。加入2.5 mL 10%的三氯醋酸溶液，取混合液2.5 mL，加蒸馏水至5.0 mL，再加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，混匀。静置10 min后在波长为700 nm处测定吸光度。

1.5.2 DPPH自由基清除性能测定

实验参照张晓艳^[23]的方法，图1为具体操作步骤。

DPPH自由基清除率计算公式为：

\mathrm{D} \mathrm{P} \mathrm{P} \mathrm{H} \mathrm{自由} \mathrm{基清} \mathrm{除率} = \frac{A_{\mathrm{c}}-(A_i-A_{\mathrm{i}\mathrm{o}})}{A_{\mathrm{c}}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%} (2)

式(2)中：A_c为空白对照液的吸光度；A_i 为加入样品溶液后的吸光度；A_io为水解液的本底吸光度。

1.5.3 OH自由基清除性能测定

实验参照张晓艳等^[23]的方法，其原理是Fe²⁺与H₂O₂混合产生OH自由基，加入水杨酸可捕捉OH自由基，并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收值，图2为具体操作步骤。

OH自由基清除率计算公式为：

\mathrm{O} \mathrm{H} \mathrm{自由} \mathrm{基清} \mathrm{除率} = \frac{A_{\mathrm{0}}-(A_x-A_{\mathrm{x}\mathrm{o}})}{A_{\mathrm{0}}} \times \mathrm{100} \mathrm{\%} (3)

式(3)中：A₀为空白对照液的吸光度；A_x 为加入样品溶液后的吸光度；A_xo为水解液的本底吸光度。

1.6 绿茶提取液的抑菌实验

1.6.1 菌悬液的制备

称取5.0 g蛋白胨、1.5 g牛肉膏、2.5 g氯化钠于搪瓷缸内，加入500 mL蒸馏水，在电磁炉上加热，充分搅拌，完全溶解后平均分装在3个250 mL锥形瓶内，于121 ℃下高温灭菌20 min。在超净工作台下，用接种环分别挑取培养在试管斜面上的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌，并分别接种在准备好的3瓶液体培养基内，于37 ℃的恒温振荡培养箱内振荡培养24 h，制成菌悬液。

1.6.2 培养基的制备

称取33.0 g营养琼脂于搪瓷缸中，加入1 000 mL蒸馏水，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高压灭菌20 min。

1.6.3 抑菌操作

在超净工作台下，先将灭菌后的营养琼脂倒入无菌平皿内，每平皿约20 mL；待培养基凝固后，用移液枪移取1 mL制备好的菌悬液接种在培养基上，并使用涂布器涂布，使菌悬液均匀分布在培养基表面；随后用镊子夹取灭菌过的牛津杯轻轻放在培养基上，并用移液枪移取50 μL绿茶提取液于牛津杯中；放入37 ℃生化培养箱内培养24 h，观察抑菌效果。同时应做空白组与对照组。

1.7 复合膜性能测试

1.7.1 复合膜力学性能

每张保鲜膜需要准备3个平行样条，裁剪成80 mm×15 mm的条状。采样完成后首先进行厚度测试，测量膜的厚度时需要在每个样条上随机取3个点进行测量，最后取其平均值进行记录。按照GB/T 1040.1—2018，使用智能电子拉力机对厚度进行参数设置，然后测定拉力、拉伸强度以及断裂伸长率，并计算3个样条的平均值，进行数据处理和分析。

1.7.2 复合膜光学性能

按照GB/T 2410—2018，使用透光率-雾度测定仪进行测试。每个实验组需要准备3个平行样条，记录该试样透光率与雾度数据，并计算出平均值，进行数据处理与分析。

1.7.3 复合膜抑菌性能

从制成的保鲜膜上选取表面平滑均匀的部分，剪成直径为18 mm的小圆形保鲜膜备用。做好准备工作后进行抑菌操作：在超净工作台下，先将灭菌后的营养琼脂倒入无菌平皿内，每平皿约20 mL；待培养基凝固后，用移液枪移取1 mL制备好的菌悬液接种在培养基上，并使用涂布器涂布，使菌悬液均匀分布在培养基表面，待菌悬液稍干时放入剪好的圆形保鲜膜于平皿中央。随后放入37 ℃的生化培养箱内培养24 h，观察抑菌效果。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线的绘制

图3为以芦丁质量浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标得到的标准曲线。从图3可以看出，芦丁质量浓度与吸光度呈线性相关，线性回归方程为：Y=12.138x-0.001，其中R ²=0.999 8，说明用此法测定准确度较高。测定用复合酶解法提取出的黄酮提取液的吸光度，代入线性方程计算绿茶中总黄酮的含量，然后计算出绿茶中总黄酮的提取率为0.7%。

2.2 绿茶中总黄酮抗氧化能力的测定结果

图4为绿茶中总黄酮抗氧化能力的测定结果。

从图4a可以看出，吸光度与总还原力呈正相关，增加绿茶提取液的稀释液质量浓度，吸光度随之增大，说明黄酮浓度越大还原力则越强。从图4b可以看出，绿茶提取液的稀释液质量浓度与绿茶中总黄酮对DPPH自由基的清除率成正比，即DPPH自由基清除能力随着绿茶提取液的稀释液质量浓度的增大而增强，DPPH自由基清除率在85%~90%之间。从图4c可以看出，随着绿茶提取液的稀释液质量浓度逐渐增加，清除OH自由基的能力逐渐增强，清除率越高，OH自由基清除率在25%~50%之间。因此可得出结论：绿茶提取液中的总黄酮抗氧化活性强，对DPPH自由基和OH自由基有很好的清除率。

2.3 绿茶提取液的抑菌效果

图5为绿茶提取液抑菌效果图。其中Y代表绿茶提取液，O代表85%乙醇作为对照，S代表无菌生理盐水作为空白。从图5可以看出，绿茶提取液与对照组和空白组有显著差别。

在相同实验条件下平行测定3次，测定其抑菌圈直径，RSD为0.06%，表2为绿茶黄酮提取液的抑菌活性。从表2可以看出，绿茶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单增李斯特菌这3种菌均有明显的抑菌效果，有绿茶提取液的区域附近无菌落生长，而有85%乙醇和无菌生理盐水的区域内有菌落生长。其中绿茶黄酮提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.90 mm，其抑菌效果比马齿苋提取液的抑菌效果更为显著^[15]。

2.4 复合膜性能

2.4.1 复合膜力学性能

力学性能中拉伸强度这一指标在评价复合膜性能中最具参考性。表3为不同体积比复合膜的力学性能。从表3可以看出，绿茶提取液/PVA的体积比为2∶8时，拉伸强度为28.52 MPa，当绿茶提取液/PVA的体积比增加至4∶6时，拉伸强度为36.30 MPa，达到最大值。绿茶提取液/PVA复合膜的拉伸强度随绿茶提取液的体积比的增加呈现出先增加后减小趋势。原因是PVA分子的羟基与黄酮类物质的羰基发生了缩合反应，增加黄酮类物质量，使复合薄膜拉伸强度上升；当黄酮类含量达到一定程度时，再随着黄酮类物质的增加，由于两物质间混合不均匀，多余的黄酮类物质仅起填充作用，因此使PVA复合膜的拉伸强度下降^[24]。

2.4.2 复合膜光学性能

表4为不同体积比复合膜厚度值和光学性能。从表4可以看出，绿茶提取液/PVA的体积比为2∶8时，复合膜的厚度是23.4 μm，透光率达到91.8%，雾度达到0.46%。这是因为提取液本身为黄褐色，占总体积比最小，PVA溶液体积占比大，所以复合膜的厚度最大，透光率也是最大。而光学性能中的透光率达到90%以上即可，雾度则是越小越好，此时绿茶提取液/PVA溶液体积比为4∶6，透光率为91.2%，与透光率91.8%差距不大。在保证复合膜各项性能符合标准的情况下，使提取液的体积占比尽可能大，经过综合比较各项性能数据后，认为绿茶提取液与PVA的比例为4∶6最合适，有较好的力学性能和光学性能。

2.4.3 复合膜抑菌性能

在绿茶提取液抑菌实验条件下平行测定3次，测定其抑菌圈直径，RSD为0.05%，表5为绿茶复合膜的抑菌活性。

从表5可以看出，绿茶复合膜对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌这两种菌均有明显的抑菌效果，添加绿茶提取液的复合膜区域附近无菌落生长，而有85%乙醇和无菌生理盐水的区域内有菌落生长。原因是PVA分子的羟基与黄酮类物质的羰基进行脱水缩合，反应过后，PVA分子中羟基有所减少，降低其亲水性。又因为黄酮类物质具有抗菌性，所以绿茶复合膜具有良好的抗菌性能，尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果更为显著。

3 结论

绿茶中总黄酮的还原力与吸光度呈正相关，DPPH自由基清除率在85%~90%之间，OH自由基清除率在25%~50%之间。

绿茶提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单增李斯特菌有良好的抑菌效果，绿茶/PVA复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为8.60 mm，其抑菌效果更为显著。

绿茶提取液与PVA的最优混合比例为4∶6，有较好的力学性能和光学性能，可扩大PVA薄膜的应用范围，为进一步研究新型绿色包装材料提供思路。

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基金资助

河南省高等学校重点科研项目(23A550021)

河南应用技术职业学院2020年度首席技师项目(2020-SXJS-HG01)