N，N’-双（丙烯酰）胱胺交联聚（N-异丙基丙烯酰胺）的合成、表征及其降解性能研究

Synthesis, Characterization and Degradable Property Study of PNIPAM Microgels Crosslinked by N,N'-Bisacrylylcystamine

摘要

以N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）为单体、过硫酸铵（APS）为氧化剂、四甲基乙二胺（TEMED）为还原剂、含有在还原性条件下可降解的二硫键的N，N’-双（丙烯酰）胱胺（BAC）为交联剂、二甲基甲酰胺（DMF）为溶解BAC的溶剂，利用无皂乳液聚合法，通过APS与TEMED的氧化还原引发体系，成功制备BAC交联的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）微凝胶。傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）测试显示，微凝胶中含有二硫键；透射电子显微镜（TEM）结果显示，产物微凝胶为亚微米尺寸的规整球形；动态光散射（DLS）结果显示，微凝胶具有明显的温度敏感性，体积相转变温度（VPTT）在29.1 ℃左右。BAC交联的PNIPAM微凝胶在还原剂二硫苏糖醇（DTT）水溶液中表现出明显的降解性能，且DTT浓度越大，微凝胶的降解速度越快，降解程度越大。

关键词

无皂乳液聚合 / 聚（N-异丙基丙烯酰胺） / 温度敏感性 / 二硫键 / 可降解微凝胶

Key words

Soap-free emulsion polymerization / Poly(N-isopropyl acrylamide) / Temperature sensitivity / Disulfide bonds / Degradable microgel

微凝胶是一种具有亚微米或微米尺寸的三维网状结构的交联粒子。温度敏感性微凝胶能够随环境温度的变化发生体积的膨胀和收缩，同时伴随电荷、折射率、流变性和胶体稳定性等其他性质的改变。聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)是一种典型的温度敏感性聚合物。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)内部同时存在亲水基团酰胺基和疏水基团异丙基^[1]。当体系温度低于PNIPAM微凝胶的体积相转变温度(VPTT)时，聚合物粒子中的酰胺基和水分子形成氢键，使PNIPAM微凝胶处于亲水的溶胀状态；而当温度超过其VPTT时，粒子内部的氢键发生断裂，使微凝胶处于疏水的收缩状态^[2-3]。

PNIPAM微凝胶的合成与应用一直是科学家们的热门研究课题^[4-5]。1986年，PELTON等^[6]以NIPAM为单体，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，在70 ℃条件下利用无皂乳液聚合的方法制备PNIPAM微凝胶。许多研究在聚合过程中通过引入可影响亲疏水性的第二单体来调节所合成的微凝胶的VPTT^[7-8]。例如，KISHI等^[9]将NIPAM和丙烯酸(AA)作为共聚单体，通过辐射引发合成P(NIPAM-co-AA)微凝胶。随着研究的深入，THOME等^[10]和ZHA等^[11]发现，含有可降解基团的微凝胶在工业、医药^[12-13]、酶的控制释放等方面有很大的应用前景^[14-16]。作为一种典型的可降解基团，二硫键^[17-19]是连接生物体肽链间或肽链内两个不同半胱氨酸残基的巯基的共价键。二硫键在还原剂的作用下很容易发生裂解，形成两个巯基，因此二硫键交联的微凝胶常被用于药物载体和基因载体等领域^[20-22]。

本研究以NIPAM为单体，含有二硫键的N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BAC)为交联剂，利用氧化还原引发体系，通过无皂乳液聚合法制备BAC交联的PNIPAM微凝胶，并对所得微凝胶的温度敏感性和可降解性能进行测试与表征。

1 实验部分

1.1 主要原料

N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)，分析纯，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；四甲基乙二胺(TEMED)、N,N’-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、二硫苏糖醇(DTT)，分析纯，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；过硫酸铵(APS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、N,N’二甲基甲酰胺(DMF)，分析纯，中国医药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，CAV214C，奥豪斯仪器(上海)有限公司；悬臂搅拌器，EUROSTAR digital，艾卡(广州)仪器设备有限公司；磁力搅拌器，C-MAG HS7 digital，艾卡(广州)仪器设备有限公司；玻璃恒温水浴锅，SYP，巩义裕华仪器有限责任公司；冷冻干燥机，FD-1C-50，北京博医康实验仪器有限公司；高速冷冻离心机，HC-3018R，安徽中科中佳仪器有限公司；数控超声波清洗器，KQ-300DE，昆山市超声波仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)，Nicolet iS10，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；动态光散射(DLS)，ZetaPlus，美国布鲁克海文仪器公司；透射电子显微镜(TEM)，JEM-2100，日本电子株式会社；紫外可见分光光度计(UV-vis)，U-3100，日本HITACHI公司。

1.3 样品制备

称量一定质量的精制NIPAM(3.96 g)，将其溶解于一定量的二次蒸馏水中，用规格为G3的砂芯漏斗进行抽滤，加入500 mL四口烧瓶中，向体系中通入N₂排氧，并一直保持整个反应体系在N₂保护下进行，调节水浴温度为35 ℃，开动搅拌反应1 h。将SDS(在临界胶束浓度以下)(0.432 g)、TEMED(0.058 g)、APS(0.285 g)和预先溶解于12 mL DMF中的BAC(0.225 g)依次加入体系。不断搅拌，反应6 h，制得BAC交联PNIPAM微凝胶。反应结束后，将所得微凝胶进行透析，时间为3 d，每天早晚换水。

1.4 性能测试与表征

FTIR测试：将透析后的产物放入冷冻干燥机进行处理，得到干样，用溴化钾(KBr)压片制样，放入FTIR中进行测试。波数范围400~4 000 cm^-1。

¹H-NMR测试：核磁共振氢谱测试所得的图谱为氢谱，通过分析不同化学环境下的氢原子的种类和数量来推断分子结构。取干样PNIPAM固体6~8 mg，溶于1 mL的重水(D₂O)，经超声分散至完全溶解，使用移液枪将分散后的液体加入核磁管中，表征微凝胶的分子结构。

TEM测试：为防止微凝胶在观察时出现聚集或堆叠的情况，将微凝胶进行稀释。取50 mL血清瓶，加入40 mL蒸馏水，使用注射器向蒸馏水中滴微量PNIPAM微凝胶和PNIPAM-Au杂化微凝胶，用超声波清洗机中振荡血清瓶，用针头的注射器取分散后的液体分别滴于铜网上，充分干燥后对微凝胶进行观察。

DLS测试：用胶头滴管取PNIPAM微凝胶1滴，分散于带有二次蒸馏水的比色皿中，放入粒度仪中，在20 ℃条件下进行测试。设置粒度仪参数，升温至60 ℃。在此过程中，每升温2 ℃保持10 min。进行3次粒度测试，取平均值。

UV-Vis测试：用胶头滴管取PNIPAM微凝胶1滴，分散于带有二次蒸馏水的比色皿中，放入仪器中，在20 ℃和40 ℃的条件下进行透过率测试。

2 结果与讨论

2.1 BAC交联PNIPAM微凝胶的FTIR谱图

图1为BAC交联PNIPAM微凝胶的FTIR谱图。从图1可以看出，1 652 cm^-1和1 544 cm^-1处的吸收峰分别源自酰胺I带(C=O伸缩振动)和酰胺Ⅱ带(N—H弯曲和C—N伸缩振动)吸收峰；3 436 cm^-1 和1 172 cm^-1处的吸收峰来自酰胺基团上N—H的伸缩振动；2 973、2 933、2 875 cm^-1处的3个连续的吸收峰对应的是饱和C—H的伸缩振动吸收峰；1 386 cm^-1和1 367 cm^-1处的吸收峰是由于微凝胶中异丙基—C(CH₃)₂上双甲基的变形，所以两峰宽度几乎相同。516 cm^-1处的吸收峰是二硫键S—S的吸收峰，证明二硫键交联的微凝胶成功合成。

2.2 BAC交联PNIPAM微凝胶的¹H-NMR谱图

图2为BAC交联PNIPAM微凝胶的¹H-NMR谱图。从图2可以看出，在化学位移1.02附近的特征峰对应甲基的6个H，化学位移1.42附近的特征峰对应主链上亚甲基的2个H，化学位移1.93附近的特征峰对应主链上次甲基的1个H，化学位移3.75附近的特征峰侧链次甲基的1个H。结果表明，PNIPAM微凝胶被成功合成。

2.3 BAC交联PNIPAM微凝胶的TEM照片

图3为BAC交联PNIPAM微凝胶的TEM照片。从图3可以看出，PNIPAM微凝胶是尺寸为亚微米级的粒径分布较窄的粒子，形状为均匀的且边缘较规整的球形。

2.4 BAC交联PNIPAM微凝胶的温度敏感性

取微量PNIPAM微凝胶分散于二次蒸馏水中，利用DLS对微凝胶的流体粒径在10~64 ℃的温度范围内进行测试，并使用Boltzmann函数对所得数据点进行非线性曲线拟合，图4为拟合结果，内插图为微凝胶分散液在10 ℃和64 ℃时的宏观照片。从图4可以看出，BAC交联PNIPAM微凝胶在温度低于20 ℃时粒径变化较小，但在20~40 ℃的温度范围内粒径随着温度的升高而急剧变小，40 ℃后粒径变化再次趋于稳定。这符合温度敏感性微凝胶尺寸随温度的典型变化规律。数据点拟合后，经计算，本研究所得PNIPAM微凝胶的VPTT为29.1 ℃，接近PNIPAM的低临界溶解温度(LCST)。从图4的内插图可以看出，微凝胶的水分散液在10 ℃时呈现半透明状态，而64 ℃时的颜色已经完全变为白色不透明，说明当环境温度升高后，PNIPAM微凝胶从吸水膨胀状态转化为疏水收缩状态，并且这种体积相转变行为是可逆的。

图5为BAC交联PNIPAM微凝胶在20 ℃和60 ℃时的粒径分布。从图5可以看出，20 ℃时PNIPAM微凝胶的平均粒径约为330 nm，60 ℃时平均粒径约为260 nm，进一步验证了PNIPAM微凝胶的温度敏感性。PNIPAM微凝胶在20 ℃和60℃时均表现出良好的单分散性，说明本研究制备的BAC交联PNIPAM微凝胶即使在超过其VPTT的温度转变为疏水状态时，也没有发生粒子间的相互团聚行为，保持了微凝胶的分散稳定性。

2.5 BAC交联PNIPAM微凝胶的降解性能

取等量BAC交联PNIPAM微凝胶，分别分散于5、10、15、20 mmol/L的DTT水溶液中，并于UV-Vis中在不同的时间间隔下进行波长扫描，图6为透过率测试结果。从图6可以看出，BAC交联PNIPAM微凝胶分散液在不同浓度的DTT溶液中测试范围内的几乎所有波长下，透过率均呈现随时间增加而下降的趋势，而这种趋势在降解实验初始阶段尤为明显。这说明PNIPAM微凝胶中的二硫键在还原性环境中发生一定程度的断裂，导致微凝胶的交联密度降低，微凝胶体积变大，从而使微凝胶分散液的透过率降低。

为了更直观地显示PNIPAM微凝胶在DTT溶液中的降解情况，根据图6选定1个固定波长(600 nm)，读取不同DTT浓度溶液中不同降解时间下的透过率，以降解时间为横坐标，透过率为纵坐标作图得到图7a。从图7a可以看出，BAC交联的PNIPAM微凝胶在4种DTT浓度的水溶液中均发生降解。当DTT浓度为5 mmol/L时，在120 min的降解时间内微凝胶分散液的透过率一直呈现下降趋势，说明微凝胶的降解行为一直持续。而当DTT浓度为10、15、20 mmol/L时，微凝胶的降解分别在第8、6、4 min后基本完成。由此可见，在微凝胶含量一定时，DTT浓度越大，降解反应进行得越快。

从图7a中读取降解时间分别为0和120 min时的透过率值并以其为纵坐标，DTT浓度为横坐标作图，得到图7b。从图7b可以看出，当DTT浓度由5 mmol/L升高至20 mmol/L时，降解时间为0 min的微凝胶分散液的透过率由约77%逐步下降至约65%。这说明BAC交联的PNIPAM微凝胶在DTT溶液中的初始降解非常快，并且在UV-Vis的波长扫描过程中就已经表现出明显的DTT浓度相关性。在降解反应120 min后，在4种浓度的DTT溶液中，微凝胶分散液的透过率分别降低为48%、44%、42%和41%。同样，DTT浓度越高，透过率越低，但在15 mmol/L和20 mmol/L的DTT溶液中的透过率差异较小。以上结果说明，本实验中BAC交联的PNIPAM微凝胶在浓度越高的DTT溶液中降解越彻底，当DTT浓度为20 mmol/L时，已经能够满足PNIPAM微凝胶的降解。

室温下，取微量BAC交联的PNIPAM微凝胶分散于20 mmol/L的DTT水溶液中，立即利用DLS在25 ℃下测定微凝胶在不同时间间隔下的流体粒径，图8为得到的数据。从图8可以看出，在降解反应刚刚开始时(0 min)测得的PNIPAM微凝胶的粒径约为260 nm，在降解反应进行到3 min时，微凝胶的粒径增大至约313 nm，之后的粒径大小虽在一定范围内波动，但随着降解时间的延长大致趋于平稳，在降解反应进行到120 min时，测得的微凝胶粒径约为330 nm。伴随着DTT的加入，微凝胶中的二硫键被破坏，微球中的分子链被打开，颗粒交联程度降低，分子链端的活动范围增大，所以在DLS测试中表现出粒径的增大。这与上文通过UV-Vis测试分析得到的结果相符。

3 结论

利用无皂乳液聚合的方法，以NIPAM为单体，含有二硫键的BAC为交联剂，TEMED为还原剂，APS为氧化剂，利用氧化还原体系引发合成BAC交联的PNIPAM微凝胶。利用FTIR、¹H-NMR、TEM、DLS和UV-Vis等方法对PNIPAM微凝胶进行详细的表征。所得微凝胶为亚微米尺寸的规整球形结构，具有明显的温度敏感性，VPTT约为29.1 ℃。BAC交联PNIPAM微凝胶在DTT溶液中表现出明显的降解性能，并且DTT浓度越大，微凝胶的降解速度越快，降解程度越大。

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基金资助

辽宁省教育厅科学研究青年项目(LJKQ20222422)