高效液相色谱-串联质谱法快速筛查药用复合包装袋中8种水溶性杂质

Rapid Screening of eight Water-soluble Impurities in Medicinal Composite Packaging Bag by HPLC-MS/MS Method

摘要

建立了同时测定药用复合包装袋中8种水溶性杂质的高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。将药用复合包装袋剪碎，采用超纯水在50℃条件下超声提取30 min。提取液经0.22μm聚四氟乙烯（PTFE）微孔滤膜过滤后，以甲醇-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱，经ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（3.5μm,4.6 mm×150.0 mm）色谱柱分离，在ESI源正离子模式下进行多反应监测（MRM）扫描，采用外标法定量。对色谱柱、流动相和质谱参数进行优化，并对基质效应进行评价。结果表明：最优条件下的检出限（LOD）为0.20～0.35 ng/g，线性相关系数均高于0.995，平均加标回收率为85.0%～115.8%，相对标准偏差（RSD）为0.3%～9.2%（n=6）。该方法前处理简单，分析时间短至6 min，无明显基质效应，可用于药用复合包装袋中8种水溶性杂质的快速筛查。

关键词

水溶性杂质 / 高效液相色谱-串联质谱法 / 药用复合包装袋

Key words

Water-soluble impurity / HPLC-MS/MS / Medicinal composite packaging bag

药用复合包装袋常使用油墨作为印刷剂^{[1- 2]}，并使用黏合剂对不同的膜层进行黏接^[3-4]。生产油墨常采用醇溶性的聚酰胺树脂为原料^[5]，未聚合完全的酰胺类单体对人体健康有很大的威胁。例如，丙烯酰胺被欧盟法规No.1272/2008认定为2类致癌物^[6-7]；N,N-二甲基丙烯酰胺已被证实对肝脏和肾脏均有毒性^[8]；误食N-羟甲基丙烯酰胺可造成急性中毒^[9]。黏合剂常用的主要原料为异氰酸酯(主要包括邻位和对位异构的甲苯二异氰酸酯^[10-11])，其合成过程中可能添加N,N-二甲基苄胺作为脱氢催化剂。游离的甲苯二异氰酸酯与空气中的水分接触后极易发生水解，生成潜在的基因毒性杂质二氨基甲苯^[12-13]，而N,N-二甲基苄胺会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤，吞食或吸入体内也有毒性^[14]。研究表明，小分子化合物(分子量小于1 000)可以穿过高聚物无定形区链段之间的空隙^[15-16]。因此，药用复合包装袋中油墨及黏合剂产生的对人体有毒有害的物质有迁移至药品中的风险^[17-18]。综上所述，十分有必要对药用复合包装袋中酰胺类化合物、二氨基甲苯类化合物和N,N-二甲基苄胺的残留量进行检测，从而快速筛查出安全可靠的药用复合包装袋^[19-20]。

目前，丙烯酰胺类、甲基丙烯酰胺、2,4-二氨基甲苯和2,6-二氨基甲苯的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法^[21-23]、气相色谱-质谱联用法^[24-26]和液相色谱法^[27-29]等；N,N-二甲基苄胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-环己基甲酰胺和N,N-二甲基丙烯酰胺的检测方法鲜有报道。本实验基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)的技术建立了快速检测药用复合包装袋中8种水溶性杂质的方法，为快速筛选出安全可靠的药用复合包装袋提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪，1290/6470B，美国Agilent公司；电子分析天平，SQP，德国Sartorius公司；数控超声波清洗器，KQ5200DE，昆山舒美超声仪器有限公司；漩涡混匀仪，VORTEX 3，德国IKA集团；超纯水机，Advantage A10，美国Millipore公司。

N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA)、N-环己基甲酰胺(CyF)，质量分数大于98.0%，广州佳途科技有限公司；丙烯酰胺(AM)、N-(羟甲基)丙烯酰胺(N-MA)、甲基丙烯酰胺(MAC)、2,4-二氨基甲苯(2,4-TDA)、2,6-二氨基甲苯(2,6-TDA)、N,N-二甲基苄胺（BDMA)，质量分数大于98.0%，北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、甲酸，质谱级，上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水，一级水(超纯水)，由Advantage A10超纯水机制备。

单标储备液：分别精密称取AM等8种标准品25 mg(精确至0.1 mg)于25 mL容量瓶中，加入适量的甲醇溶解并稀释至刻度，混匀后即得8种单标储备液。

混合中间液：分别准确移取一定体积的单标储备液，用超纯水稀释成BDMA质量浓度为500 ng/mL，其余各物质质量浓度均为1 000 ng/mL的中间液。

1.2 样品前处理

将购买的药用复合包装袋剪开，倒掉所有药品，并用超纯水冲洗干净，自然晾干后剪成小碎片(单个尺寸约5 mm×5 mm)，混匀后准确称取2.0 g(精确至0.1 mg)样品于25 mL带盖的螺口试管中，然后加入超纯水10.0 mL，使样品浸没在液体中。50 ℃条件下超声提取30 min，冷却至室温，摇匀，用0.22 μm聚四氟乙烯(PTFE)微孔滤膜过滤，取滤液，上HPLC-MS/MS进行检测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(4.6 mm×150.0 mm，3.5 μm)；流动相A(水相)为0.1%甲酸水溶液，流动相B(有机相)为甲醇；进样体积5 μL；柱温40 ℃；流速0.8 mL/min。

梯度洗脱程序：0~0.5 min，5% B；0.5~3.0 min，5%~40% B；3.0~4.0 min，40%~98% B；4.0~6.0 min，98% B；6.0~6.1 min，98% ~5% B；6.1~8.0 min，5% B。

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描模式MRM；离子模式正模式(+)；鞘气温度300 ℃；鞘气流速11 L/min；干燥气温度300 ℃；干燥气流速6 L/min；雾化气压力310.3 kPa；毛细管电压3 500 V。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

分别考察Accucore HILIC(2.6 μm，2.1 mm×100.0 mm)、ZORBAX Eclipse Plus C₁₈(1.8 μm，2.1 mm×100.0 mm)和ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(3.5 μm，4.6 mm×150.0 mm)对8种水溶性杂质分离效果的影响。结果表明，使用Accucore HILIC时，BDMA的峰形展宽，2,4-TDA和2,6-TDA不能有效分离；使用ZORBAX Eclipse Plus C₁₈时，初始流动相水相的比例调至95%，2,4-TDA和2,6-TDA可以有效分离，但保留时间太靠前，不利于目标化合物与样品中未知杂质的分离；使用ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱时，8种水溶性杂质均能正常出峰，分离效果较好。原因可能是ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱覆盖了更多的活性硅醇基，使碱性化合物在pH值2~9范围内具有出色的峰形。同时，选择150 mm柱长，更有利于极性化合物的保留，因此最终选择ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(3.5 μm，4.6 mm×150.0 mm)色谱柱进行分离。图1为8种水溶性杂质的多反应监测图。

2.2 流动相的优化

液质联用技术一般采用甲醇或乙腈作为有机流动相。本方法中的8种水溶性杂质的分子极性比较强，因此采用极性更大的甲醇作为有机相更有利于目标化合物的分离。当采用纯水为水相时，BDMA的峰严重拖尾，为改善其峰形，考察水相流动相中不同甲酸浓度(0.02%、0.05%、0.08%、0.10%)的影响，图2为测试结果。

从图2可以看出，甲酸浓度为0.02%可明显改善BDMA的峰形，其保留时间延迟约0.5 min。随着酸浓度的增加，BDMA的响应逐渐增强。但过高的甲酸浓度可能损坏色谱柱和质谱仪，因此一般情况下采用的甲酸浓度不超过0.10%。综上所述，最终选择甲醇为有机相，选择0.10%甲酸为水相。

2.3 质谱参数的优化

基于自动优化软件(Agilent Optimizer Version 10.1)，采用8种水溶性杂质的单标溶液(质量浓度约1.0 μg/mL)进行质谱条件的优化。首先分别在ESI^＋、ESI^-模式下分别进行母离子的选择并优化其裂解电压，然后进行子离子的选择并优化其碰撞能。表1为优化得到的8种水溶性杂质的质谱参数，其中“*”代表定量离子。

2.4 提取条件的优化

按“1.2”节所述的样品前处理方法，选择阴性药用复合袋样品，在称样后加入100 μL混合中间液，室温条件下放置若干小时，待溶剂挥发后得到阳性样品，平行制备若干份。由于本实验中检测的物质均为水溶性化合物，因此采用超纯水作为提取溶剂，考察不同超声温度和不同超声时间对阳性样品中各水溶性杂质提取效果的影响，每个条件点进行3个平行，图3为测试结果。

从图3可以看出，随着超声温度的升高，各水溶性杂质的回收率基本呈先升高后降低的趋势，在50 ℃时，各物质的回收率达到最大；随着超声时间的增加，各水溶性杂质的回收率先增大，且在30 min之后回收率略有降低且基本保持稳定。因此，最终选择50 ℃超声30 min作为最终的提取条件。

2.5 基质效应的评价

基质(即样品中目标化合物以外的物质)常对目标物的分析产生干扰，并对方法的检出限(LOD)、定量限(LOQ)、线性相关性、回收率和精密度等产生影响，这些干扰或影响被称为基质效应。基质效应一般采用基质曲线与溶剂曲线线性方程的斜率比(S)进行评价^[30]。S>1表明存在基质增强效应；S<1则存在基质抑制效应；S在0.9~1.1之间表明基质效应非常小，可以忽略不计^[31]。

本实验分别选择普通复合膜(PET/AL/PE)、纸铝塑复合膜(纸/PE/AL/PE)、药用条状易撕膜(PT/PE/AL/PE)、耐高温蒸煮膜(PET/Al/CPP)、耐高温蒸煮膜(PET/CPP)共5种材质的阴性药用复合袋样品进行基质效应的考察。首先对以上5种阴性药用复合袋样品进行提取，得到不同的空白基质溶液；然后将其用于配制基质标准溶液，分别上机测试后得到对应的基质曲线的斜率K_i；最后，采用同样的方法得到溶剂曲线(采用超纯水配制标准溶液)的斜率K ₀，计算斜率比S_i (S_i =K_i /K ₀)。结果显示，不同药用复合袋样品基质曲线与溶剂曲线的斜率比均接近1(0.906~1.083)。因此，本方法无明显的基质效应。

2.6 线性关系、检出限与定量限

准确移取适量的混合中间液，用超纯水逐级稀释成BDMA质量浓度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 ng/mL，其余7种化合物质量浓度均为0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的标准工作溶液。在最优的条件下上机测试，以各水溶性杂质的质量浓度为横坐标(x，ng/mL)，对应的定量离子峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，建立线性回归方程。

选取阴性药用复合包装袋进行加标，按照“1.2”中的方法进行前处理后上机测试，分别以信噪比(S/N)3和10确定仪器的各水溶性杂质的检出限和定量限分别为0.04~0.07 ng/mL和0.10~0.20 ng/mL。由此再根据“1.2”节中的前处理方法进行计算，得到本方法中各水溶性杂质的检出限和定量限。表2为8种水溶性杂质的线性方程、线性相关系数、线性范围、检出限和定量限。

从表2可以看出，BDMA和其余7种水溶性杂质分别在0.10~10 ng/mL和0.20~20.00 ng/mL浓度范围内线性良好，线性相关系数R均大于0.995。8种水溶性杂质的检出限和定量限分别为0.20~0.35 ng/g和0.50~1.00 ng/g。

2.7 回收率与标准偏差

选取阴性药用复合袋样品分别进行低、中、高3个浓度水平的加标实验，每个浓度水平分别进行6次平行试验，表3为测试结果。

从表3可以看出，8种水溶性杂质的平均加标回收率在85.0%~115.8%之间，相对标准偏差(RSD)在0.3%~9.2%范围内，表明本方法的准确度和精密度良好，能够满足实际样品检测的需求。

2.8 药用复合包装样品检测

采用本方法对25组市售药用复合包装袋中的8种水溶性杂质进行筛查，其中20组样品均为阴性，5组样品为阳性。表4为阳性样品检测结果。从表4可以看出，其中1组样品检出AM，两组样品同时检出AM和N-MA，1组样品检出2,4-TDA，1组样品检出CyF。

3 结论

本文通过对色谱柱、流动相、质谱参数和提取条件的优化，建立一种快速筛查药用复合包装袋中8种水溶性杂质的HPLC-MS/MS方法。本方法前处理简单快速，定性和定量准确度均较高，无明显基质效应，可在6 min内实现8种水溶性杂质的同时检测，为保证药用复合包装袋的安全使用提供技术手段。在常见的药用复合包装袋样品中检测出AM、N-MA和2,4-TDA，存在一定的安全风险。此外，部分药用复合物包装袋用于水剂药品的包装，提高了水溶性杂质的迁移风险，因此相关监管部门应加强药用复合包装袋中该类物质的监管。

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基金资助

重庆市科技局科研院所绩效激励引导专项(cstc2022jxjl50001)

重庆市市场监督管理局科研计划项目(CQSJKJ2022040)