增益染色吸光法检测水中低浓度微纳塑料

Detection of Low Concentration of Micro-nano Plastics in Water by Gain-stained Absorbance Method

摘要

按照染料增益吸光性的原理建立新的光谱法测定水中微塑料含量，具有操作简便、快速、灵敏度高和可选择性检测微纳碎片等优点。采用不同粒径、不同种类塑料作为测试材料，结果显示均有良好的增益吸光效果。方法的适用性研究显示，对于粒径大于1μm的微塑料颗粒和纤维混合体，可在染色、离心后取定量溶液在血球计数板上，采用显微荧光计数法测定其含量；对于粒径小于1μm的纳塑料，可利用其染色后悬浮相浓度和吸光度呈现的线性关系，采用分光光度法进行测定。将该检测方法应用于某污水处理厂实际水样中，结果显示，实际样品加标回收率在99.00%～107.00%之间，方法检测限可达1.53 mg/L。研究将为环境中微纳塑料的定量检测提供一种便利的方法，具有良好的适用性和广阔的应用前景。

关键词

微塑料 / 检测方法 / 染色 / 分散红3B

Key words

Microplastics / Detection method / Staining / Disperse red 3B

微塑料已被国际社会公认为四大“新污染物”之一，其污染特性和存在特征受到广泛关注。生产过程中的磨损以及使用后不合理的处理方式，导致了大量微纳塑料的产生^[1]。微纳塑料污染已经波及空气^[2]、土壤^[3]、湖泊、河流和海洋^[4]。环境中的微纳塑料可以通过消化道摄入^[5]、呼吸道吸入^[6]以及皮肤接触^[7]等多种途径进入人体，进而对人体健康构成潜在威胁^[8]。更令人担忧的是，微纳塑料已在人体的多个组织中被检测到，包括血液^[9]、肺部组织^[10]、肝脏^[11]、胎盘^[12]和母乳^[13]。因此，对微纳塑料进行快速且准确的定量检测，已成为有效控制这类新型污染物的关键。

当前常用的微纳塑料检测方法包括直接观察法^[14]、热分析法^[15]和光谱法^[16]等。其中直接观察法常借助显微镜和扫描电子显微(SEM)来进行计数观察^[17]。薛晓熠等^[18]发现，直接观察法测试同样的样品，检测人员不同，结果也存在明显差异，此法虽简单快捷，但存在一定的误差。热分析法将微塑料在无氧高温热解后的产物经气相色谱(GC)分离，生成与微塑料相对应的热解色谱图，再分析微塑料的种类^[19]。卢琦园等^[20]认为，将微塑料热处理后用质谱分析法测定含量对样品前处理要求较高，普适性受到限制。光谱法主要包括傅里叶红外光谱法^[21]、拉曼光谱法^[22]。其原理分别是不同的微塑料样品会吸收不同的红外光或发出不同频率的散射光，从而生成不同的图谱，在光谱数据库中进行匹配确定塑料种类^[23]。光谱法测定微塑料具有快速、简便和可视性强等优点^[21]。张万万等^[24]采用罗丹明B作为染色剂，建立了土壤中微塑料的快速检测方法。胥文瑞等^[25]利用尼罗红染料对聚苯乙烯进行染色，发现该染料染色效果良好。因此，探索新的染料与光谱法结合测定水体中的微塑料具有应用推广价值。

1-氨基-2-苯氧基-4-羟基蒽醌又称分散红3B，是偶氮分散染料的一种，分子结构中含有的偶氮基团，具有性质十分稳定以及容易与C=C偶联的特点^[26]。本研究在对分散红3B与微塑料表层基团偶联机制进行分析的基础上，建立染色增益吸光法快速测定水相中微纳塑料含量，以期实现微纳塑料快速定量检测。

1 实验部分

1.1 主要原料

1-氨基-2-苯氧基-4-羟基蒽醌(分散红3B)，质量分数98%，郑州新丰化学试剂有限公司；无水乙醇、丙酮，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；聚乙烯(PE)纳塑料标样，0.1 μm，白色，郑州新丰化学试剂有限公司；聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，1 000~4 000 μm，透明，矿泉水瓶老化打磨；聚丙烯(PP)，3 000~5 000 μm，白色，塑料盆老化打磨；聚苯乙烯(PS)，2 000~5 000 μm，透明，快餐盒老化打磨；盐酸、氢氧化钠，分析纯，郑州新丰化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计，UV-6000PC，上海元析仪器有限公司；双光束紫外可见分光光度计，TU-1900，北京普析通用仪器有限责任公司；显微镜，OLYMPUS-CX41，日本奥林巴斯有限公司；超声波清洗机，XM-P04H，江苏昆山小美超声仪器有限公司；电热恒温干燥箱，HWL-70，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；雷磁pH计，PHS-3C，上海仪电科技有限公司；台式高速离心机，H3-18K，湖南可成仪器设备有限公司；UPR系列(超)纯水机，UPR-Ⅱ-L，四川优普超纯科技有限公司；电子天平，BCE224I-1CCN，德国赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 实验方法与步骤

1.3.1 染色液的配置与优化

1.3.1.1 染色溶液的配制

称取一定量分散红3B粉末，溶于蒸馏水与无水乙醇的混合液，完全溶解后的溶液为染色溶液。

1.3.1.2 染色溶液浓度的优化

配置不同质量浓度(20、40、60、80、100 mg/L)的分散红3B系列染色溶液，分别取50 mL一系列浓度梯度的染色溶液于比色管中，加入5 mg PS纳塑料颗粒，常温避光染色2 h后吸取一定量的悬浮液，置于载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察不同浓度染色液的染色效果。

1.3.1.3 染色溶液有机溶剂加入比例的优化

选取无水乙醇作为分散红3B的有机溶剂，分别与蒸馏水混合形成乙醇体积浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的一系列染色溶液，分别取50 mL一系列有机溶剂，加入一系列的染色溶液于比色管中，加入5 mg PS纳塑料颗粒，常温避光染色2 h后吸取一定量的悬浮液，使用紫外分光光度计在518 nm波长下测得吸光度。

1.3.2 微塑料样品染色与测定-计数法

实验模拟常见的塑料经老化磨损后产生的较大颗粒微塑料，进行显微镜观察实验^[27]。选取日常生活中较为常见的PE、PS、PET、PP等塑料，模拟各类塑料在高温条件下老化30 d，将其用粉碎机粉碎打磨，刮取一定量的微塑料碎颗粒。加入10 mg的微塑料于50 mL离心管中，加入30 mL分散红3B质量浓度为60 mg/L的染色溶液，放于超声仪器中染色2 h，在10 000 r/min条件下离心5 min，离心后倒掉离心管中的上清液，用移液枪吸取10 μL下层浓缩液，转移至血球计数板上，在显微镜下观察染色效果并计数分析。

1.3.3 纳塑料的测定-染色分光光度法

取50 mL染色溶液于100 mL比色管中，称取5 mg 100 nm PS纳塑料颗粒，加入染色溶液中，超声振荡2 h后吸取纳塑料悬浮溶液，用10 mm石英比色皿在518 nm波长下测量吸光度。

1.3.4 检测环境影响因素的优化

（1）染色时间的优化。

取50 mL最优的染色溶液于比色管中，加入5 mg PS纳塑料颗粒，分别染色0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，吸取染色后的溶液，采用紫外分光光度计在518 nm下测得吸光度。

（2）染色温度的优化。

取50 mL最优的染色溶液于比色管中，加入5 mg PS纳塑料颗粒，分别置于10、20、30、40、50 ℃等一系列温度下，经过最优染色时间后吸取纳塑料染色溶液，利用紫外可见分光光度计在518 nm下测其吸光度。

（3）染色溶液pH值的优化。

取50 mL染色溶液于比色管中，采用稀盐酸和氢氧化钠为调节剂，调节染色溶液pH值为5、6、7、8、9，加入5 mg PS纳塑料颗粒，经过最优染色时间后吸取纳塑料染色溶液，利用紫外分光光度计在518 nm波长下检测吸光度。

1.3.5 标准曲线的建立

取50 mL最优染色溶液于100 mL比色管中，称取10 mg的100 nm PS纳塑料颗粒加入染色溶液中，通过梯度稀释法配置一系列纳塑料质量浓度为200、100、80、60、40、20 mg/L的标准溶液，经过最优染色时间后吸取纳塑料染色溶液，利用紫外可见分光光度计在518 nm下测定吸光度，建立纳塑料含量与吸光度线性相关的标准曲线。

1.3.6 实际水样检测

采集郑州市五龙口污水处理厂出水口水样，静置1 d后，取一定量实际水样于比色管中，加入相同体积的无水乙醇，配制60 mg/L的分散红3B染色溶液，加入一定量的PS纳塑料颗粒，经过最优染色时间后吸取染色后的溶液测量其吸光度，计算加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 染色原理与效果分析

在自然降解的过程中，微纳塑料在聚合物的末端仍具有不饱和双键。在红外光谱图上，通常在1 630~1 680 cm^-1之间呈现出一个强烈的吸收峰，C=C的红外吸收峰是一种非常有用的结构指纹^[28]。分散红3B是一种含有偶氮键(—N=N—)的芳香胺化合物，在合适的pH值、温度、溶剂条件下，很容易和微塑料的双键偶联，形成红色偶氮化合物，此化合物具有一定的稳定性^[29]。图1为PS纳塑料染色流程与原理。利用偶氮化合物的形成，即染色后的微纳塑料边缘形成了红色偶氮化合物，引起电子云密度发生变化，导致吸收光谱发生变化，在特定波长下具有显著吸收峰。

采用紫外可见分光光度计对分散红3B染色溶液(DR)和加入PS塑料后的染色溶液(PSDR)进行光谱扫描，设置扫描波长为320~700 nm，扫描间隔为1 nm，扫描速度为中速。图2为DR和PSDR的紫外可见分光光度谱图。从图2可以看出，分散红3B溶液在518 nm波长下有显著的吸收峰，与纳塑料偶联后，溶液(PSDR)吸收峰不变，吸光度等比例增大，以此增益吸光效应可建立吸光光度法测定纳塑料的方法。

2.2 染色溶液优化

图3为染色浓度与染色效果。从图3可以看出，随着染料质量浓度的增加，微纳塑料的颜色逐渐加深。考虑到高浓度染料容易引起假阳性现象，本研究发现在60 mg/L质量浓度下微塑料染色效果达到最佳效果。综合考虑，选取60 mg/L作为后续染色溶液浓度。

微纳塑料和分散红3B均为有机大分子，具有疏水性，在水溶液中呈现分散状态。为了增加彼此的络合能力，通过添加水溶性有机溶剂来增加彼此的表面活性。图4为乙醇体积浓度对吸光度的影响。从图4可以看出，50%的无水乙醇加入比例能够取得较好的吸光度。综合考虑，选取50%的乙醇溶剂染色液作为染色溶液配制添加比例。

2.3 染色影响因素优化结果

按照1.3.4的方法研究时间、温度和溶液pH值对吸光度的影响，图5为实验结果。

2.3.1 染色时间的优化

从染色机制分析可知，染色反应为络合反应，因此具有最佳络合时间段。染色时间会对染色效果产生较大影响。从图5a可以看出，染色30 min时，纳塑料已经染上颜色。随着放置时间的增加，染色效果反而越来越淡，说明时间增加后，络合反应会随着时间的增加而解离。因此，为了使偶氮化合物具有良好的稳定性，选取30 min作为最优染色时间。

2.3.2 染色温度的优化

偶氮络合物反应的进行与反应体系的温度有着重要联系。从图5b可以看出，在30 ℃下，染色液具有良好的吸光度，因此后续采取30 ℃作为最优的偶氮反应温度。

2.3.3 染色溶液pH值的优化

pH值对络合反应偶氮化合物的稳定性具有重要影响，染色溶液的pH值直接影响染色效果。从图5c可以看出，染色溶液pH值为6时，溶液的吸光度最大，染色效果最佳。因此，确定染色溶液最佳pH值为6。

2.4 颗粒微塑料的染色效果与计量方法

实验模拟现实中的大粒径微塑料颗粒进行染色实验，然后在显微镜下经过检测计数对微塑料进行定量分析。对不同的大颗粒微塑料染色后，镜检结果显示，不规则微塑料颗粒的边缘及棱角处的颜色更深，进一步验证了染色机制中所述的在聚合物末端发生的偶氮络合反应生成了红色的络合物。本实验以模拟实际情况打磨后微塑料颗粒为染色样品，取30 mL pH值为6的染色溶液于离心管，加入30 μg的微塑料，在30 ℃下染色0.5 h，在10 000 r/min条件下离心5 min，离心后倒掉离心管中上清液。用移液枪吸取10 μL下层浓缩液转移至血球计数板上，用显微镜观察计数塑料颗粒。因此，对于水环境样品中大颗粒的微塑料，可以采用此方法进行初步定量检测。图6为实际样品的染色效果及计数。从图6可以看出，实际样品染色效果良好。

2.5 纳塑料的标准曲线及加标回收率

大颗粒染色效果良好，但是容易沉淀，不宜采用分光光度法进行测定。而对于粒径小于1 μm的纳塑料，由于水的浮力和塑料的密度，在水中呈悬浮态，因此可以采用分光光度法进行测定。图7为PS纳塑料标准曲线。从图7可以看出，在PS纳塑料质量浓度在20~200 mg/L范围内时，吸光度与PS纳塑料质量浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=0.005 59x-0.055 72，R ²=0.990 42，检测限为1.53 mg/L。

为了评价该检测方法在实际样品中的适用性，将该方法用于污水处理厂出水口的水样中微纳塑料的检测。按照20、40、60、80、100 mg/L质量浓度将微塑料添加至预处理过的污水处理厂出水口溶液配制的染色溶液中，在最优实验条件下对微纳塑料进行检测。表1为检测结果。从表1可以看出，加标回收率为99.00%~107.00%，相对标准偏差(RSD)为0.08%~1.30%，结果较为理想。

3 结论

本研究以分散红3B为染色增益化合物，在考察其染色机制的基础上，提供优化染色液的配比和环境因素，对采用增益吸光法测定水相中的微纳塑料进行研究。结果发现，在染色液配制优化中，采用体积浓度为50%的乙醇溶液作为溶剂，配制染色溶液具有更好的测试效果。微塑料末端的C=C与染色液中的偶氮键发生偶氮反应，生成的红色偶氮化合物可利用紫外可见光分光光度计在518 nm波长下检出。基于这一原理，建立一种染色吸光法检测水中低浓度微纳塑料的方法。该方法的线性范围为20~200 mg/L，检测限为1.53 mg/L。将该方法应用于污水处理厂实际出水口水样的微纳塑料检测，加标回收率为99.00%~107.00%，相对标准偏差为0.08%~1.30%。本研究建立的采用染色吸光法快速检测微纳塑料的方法具有成本低、操作简单、数据处理方便、灵敏度高等优点，为拓宽各类水体中低浓度微纳塑料的快速检测方法提供了新思路。

参考文献

[1] 朱令楠,李艳博,郭彩霞.环境微塑料呼吸道暴露及其健康效应研究进展[J].中国环境科学,2024,44(2):1134-1143.

[2] 王晓雄,刘心悦.空气中微塑料的危害与治理[J].生态经济,2023,39(12):5-8.

[3] 吴泽隆,胡良,郭若彬,农田土壤中的微塑料研究进展[J].农业与技术,2024,44(1):86-90.

[4] 李道季,蒋春华.海洋中的塑料垃圾和微塑料:从污染到治理[J].世界科学,2023(12):33-35.

[5] 秦潇,周颖,黄艺.微塑料的人群暴露途径及其健康危害[J].生态毒理学报,2021,16(5):221-227.

[6] 孙梦瑶,郭家阳,王欣奕,微塑料来源、分布及其对植物、动物和人体危害研究进展[J].应用生态学报,2024,35(8):2301-2312.

[7] 孙香莹,庄银,王玉邦,微塑料环境暴露与人体健康效应研究进展[J].环境科学研究,2023,36(5):1020-1031.

[8] 谢颖,杨波,刘琳豆,微塑料的人体内外暴露现状及其检测技术进展[J].环境卫生学杂志,2023,13(10):778-787.

[9] COBANOGLU H, BELIVERMIS M, SIKDOKUR E, et al. Genotoxic and cytotoxic effects of polyethylene microplastics on human peripheral blood lymphocytes[J]. Chemosphere, 2021, 272: 129805.

[10] JENNER L C, ROTCHELL J M, BENNETT R T, et al. Detection of microplastics in human lung tissue using μFTIR spectroscopy[J]. Science of the Total Environment, 2022, 831: 154907.

[11] LU L, WAN Z Q, LUO T, et al. Polystyrene microplastics induce gut microbiota dysbiosis and hepatic lipid metabolism disorder in mice[J]. Science of the Total Environment, 2018, 631-632: 449-58.

[12] 李伟.警惕进入人体的微塑料[J].检察风云,2024(9):36-37.

[13] 孙一喆,詹健.水环境中微塑料去除技术研究进展[J].应用化工,2024,53(2):447-452.

[14] 王嘉嘉,王佩瑶,王成浩,土壤中微塑料的检测及其对土壤生态环境的影响[J].塑料科技,2022,50(10):108-112.

[15] 王兴,邓玉明,宋利君,ATR及热分析法在塑料食品包装质控方面应用的研究[J].农产品加工,2017(11):12-14, 19.

[16] 章勇.水环境微塑料分析方法研究进展[J].安徽农学通报,2024,30(5):62-65.

[17] 万青云,黄燕平,秦嘉,环境中微塑料检测分析方法研究进展[J].环境监测管理与技术,2024,36(2):1-6.

[18] 薛晓熠,沈之霞.微塑料的主要来源及其检测方法研究进展[J].塑料包装,2023,33(6):39-45.

[19] 刘禹慧,韩卓,巢静波,热分析质谱技术在微塑料检测领域的应用[J].中国无机分析化学,2024,14(8):1166-1176.

[20] 卢琦园,马艳,陈思帆,环境中微塑料检测方法的研究进展[J].环境化学,2024,43(7):2166-2180.

[21] 贾春荣,孟淼,高建鑫,水体中微塑料的光谱检测研究和应用[J].激光杂志,2025,46(1):9-15.

[22] 肖铮,贺仪,苑林宏,水环境中微塑料的来源分布及其分子光谱检测技术的研究进展[J].中国无机分析化学,2024,14(8):1147-1156.

[23] 崔胜东,李永增,彭伟金,饮用水中的微塑料及其拉曼光谱检测技术研究进展[J].激光生物学报,2024,33(1):14-23.

[24] 张万万,郑永杰,田景芝.罗丹明B染色法快速测定土壤中微塑料[J].齐齐哈尔大学学报:自然科学版,2022,38(2):77-83.

[25] 胥文瑞,周李俊君,王超,尼罗红染色聚苯乙烯微塑料新方法开发[J].塑料科技,2024,52(4):49-55.

[26] 朱善长.浅论塑料染色的染料选样与应用[J].染料工业,1988(3):52-56.

[27] 苗令占,邓肖雅,杨铮,微塑料的老化过程、产物及其环境效应研究进展[J].中国环境科学,2023,43(11):6156-6171.

[28] 张倩芝,陈晓红.基于显微红外光谱法鉴定室内空气沉降物中的微塑料[J].光谱学与光谱分析,2023,43(S1):7-8.

[29] 牟可磊.亲核取代改性蒽醌染料原液着色性能研究[D].上海:东华大学,2022.

基金资助

河南省科技厅联合基金项目(232103810070)