同位素稀释液相色谱串联质谱法在PVB塑料中全氟辛酸标准物质定值方法中的应用

Application of Isotope Dilution-Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Certification of Reference Material of Perfluorooctanoic Acid in PVB Plastics

摘要

以全氟辛酸-¹³C₄（PFOA-¹³C₄）作为同位素内标，建立聚乙烯醇缩丁醛（PVB）塑料中全氟辛酸（PFOA）同位素稀释液相色谱串联质谱方法。在优化实验条件下，PFOA在0.1~10.0 μg/L范围内线性相关系数（R²）为0.999 4，检出限为1.0 \mathrm{\mu }g/kg，定量限为3.0 \mathrm{\mu }g/kg。在3个质量浓度添加水平（10.0、20.0、50.0 ng/g）下，PFOA的回收率为87.3%~102.5%，日内精密度为2.2%~4.7%。研究结果表明，所提出的方法准确度高，灵敏度高，可满足PVB塑料中PFOA标准物质定值研究需要。

Abstract

An isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed for the determination of perfluorooctanoic acid (PFOA) in polyvinyl butyral (PVB) plastics using perfluorooctanoic acid-¹³C₄ (PFOA-¹³C₄) as an internal standard. Under optimized experimental conditions, the linear correlation coefficient (R²) for PFOA was 0.999 4 in the concentration range of 0.1~10.0 μg/L. The limit of detection was 1.0 μg/kg, and the limit of quantification was 3.0 μg/kg. At three spiked concentration levels (10.0, 20.0, 50.0 ng/g), the recoveries of PFOA ranged from 87.3% to 102.5%, and the intra-day precision ranged from 2.2% to 4.7%. The results indicated that the proposed method exhibited high accuracy and high sensitivity, meeting the requirements for the certification of reference materials for PFOA in PVB plastics.

Graphical abstract

关键词

同位素稀释 / 液相色谱串联质谱 / 全氟辛酸 / 标准物质定值 / 聚乙烯醇缩丁醛塑料

Key words

Isotope dilution / Liquid chromatography-tandem mass spectrometry / PFOA / Certification of reference material / PVB plastics

全氟辛酸(PFOA)化学性质稳定，能耐高温、光照、酸碱及微生物，广泛应用于塑料、包装材料、不粘涂层、表面活性剂、灭火泡沫等产业^[1-3]。该物质在自然条件下难以降解，可通过摄取、吸入、皮肤接触等途径被人体吸收，具有持久性和生物蓄积性毒性，可诱发癌症，对生态环境和人体健康构成较大安全风险^[4-5]。2023年，世界卫生组织下属的国际癌症研究署(IARC)将PFOA列为致癌物，中国生态环境部将其列入《重点管控新污染物清单》^[6-7]。目前，PFOA的检测方法主要有气相色谱法^[8-9]、液相色谱法^[10-11]、气相色谱-串联质谱法^[12-14]、液相色谱-串联质谱法^[15-19]以及液相色谱-串联高分辨质谱法^[20]等。其中，高效液相色谱-串联质谱法具有分辨率高、灵敏度高等优点；同位素稀释质谱法受基质效应和仪器条件变化影响较小，准确度和精密度高，适用于标准物质定值研究^[21]。

本研究利用全氟辛酸-¹³C₄(PFOA-¹³C₄)作为同位素内标，甲醇作为提取溶剂，超声辅助提取，采用液相色谱分离，电喷雾离子源负离子模式，多反应监测模式检测，建立聚乙烯醇缩丁醛(PVB)塑料中PFOA同位素稀释液相色谱串联质谱法。该方法灵敏度高，准确性好，满足国家标准物质定值和均匀性检验要求。

1 实验部分

1.1 主要原料

甲醇中PFOA，50 mg/L，1.2 mL，上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇中PFOA-¹³C₄，50 mg/L，1.2 mL，上海安谱实验科技股份有限公司；乙腈(MeCN)、丙酮(ACE)、二氯甲烷(DCM)、甲醇(MeOH)，色谱纯，美国TEDIA公司；乙酸铵(AmOAc)，质量分数98.0%，阿拉丁试剂(上海)有限公司；实验用水，Milli-Q Integral纯水仪制备的超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Ultimate 3000-TSQ Endura，美国Thermo公司；分析天平，AUW120D EXP，日本岛津公司；超声波清洗器，KH5200B，上海昆山有限公司；涡旋混合器，Vortex2，德国IKA公司；0.22 μm微孔滤膜，上海安谱公司。

1.3 样品制备

1.3.1 标准储备溶液的制备

PFOA标准储备溶液(200 μg/L)：移取适量PFOA标准溶液，用甲醇稀释配制成PFOA质量浓度为200 μg/L的标准储备溶液。

PFOA-¹³C₄标准储备溶液(200 μg/L)：移取适量PFOA-¹³C₄标准溶液，用甲醇稀释配制成PFOA-¹³C₄质量浓度为200 μg/L的内标储备液。

混合标准溶液：取适量PFOA、PFOA-¹³C₄储备液，用甲醇逐级稀释，配制成系列浓度的对照品混合溶液。

1.3.2 样品处理

将PVB塑料样品剪成不超过4 mm×4 mm的小块，混匀，准确称取样品1.0 g (精确至0.1 mg)于50 mL具塞玻璃瓶中，加入20 µL PFOA-¹³C₄内标溶液，准确加入10 mL甲醇，涡旋混匀后在室温下超声提取20 min，10 000 r/min离心5 min，移取全部上层液过0.22 μm微孔滤膜，待测定。

1.3.3 标准物质的制备

筛查PVB塑料颗粒料，对现有市售PVB塑料的PFOA含量进行测定。将PVB塑料母料(颗粒)与助剂按配比称重，混匀后经1次熔融、挤出、造粒后得到空白母料。将PVB塑料母料(颗粒)与助剂和试剂按配比称重，混匀后熔融挤出造粒，制得浓缩母料。按比例称取浓缩母料和空白母料，混合均匀后熔融挤出造粒两次，得标准物质颗粒。在60 ℃烘干4 h，密封保存。

1.4 性能测试与表征

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm)。流动相：5 mol/L乙酸铵、甲醇。表1为流动相梯度洗脱程序。流速为0.3 mL/min，进样量为10 μL，柱温为35 °C。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源负离子模式，扫描方式为多反应监测模式，电喷雾电压为-3 000 V，离子传输管温度为325 ℃，鞘气流速为12 L/min，辅助气流速为10 L/min。表2为PFOA的质谱参数。

2 结果与讨论

2.1 标准物质定值方法的优化

本研究建立测定塑料中PFOA的同位素稀释液相色谱串联质谱法，优化色谱条件、质谱条件、提取溶剂、提取时间等条件，确认方法的基质效应、线性范围、检出限(LOD)、定量限(LOQ)和加标回收率。

2.1.1 液相色谱条件

在色谱分析时，全氟化合物的保留时间和色谱峰形会受到流动相的pH值影响。PFOA结构中含有磺酸和羧酸基团，加入乙酸氨能够改善色谱峰型，提高离子化效率。在负离子模式扫描下，当流动相水相为弱碱性时，PFOA的质谱响应数值更高。实验考察甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵、甲醇-水、乙腈-水4种不同流动相体系对PFOA分离效果影响。图1为不同流动相条件下PFOA色谱图。从图1可以看出，甲醇-乙酸铵流动相的分离效果较好，当乙酸铵溶液质量浓度为5 mol/L时，全氟化合物的保留时间和色谱峰型最好。流动相的有机相使用甲醇时的灵敏度高于乙腈。因此，选择甲醇-乙酸铵为流动相。

实验考察Acquity BEH C18色谱柱和Phenomenex Kinetex C18色谱柱对分离效果的影响。图2为不同色谱柱下条件PFOA色谱图。从图2可以看出，使用Acquity BEH C18色谱柱时，分离效果和色谱峰型最好。因此，选择Acquity BEH C18色谱柱。

2.1.2 质谱条件

PFOA结构中含有磺酸和羧酸基团，难以质子化，在负离子模式下，PFOA极易失去一个H而生成较稳定的准分子离子峰[M—H]—峰，离子响应较高^[22]，因此本实验选择负离子模式全扫描。实验确定412.9为母离子，在子离子中选择响应较高且不发生干扰的169.0作为定量子离子。实验同时优化锥孔电压、碰撞能量、流速、温度等质谱参数，最终确定各化合物的最佳质谱条件见1.4.2。

2.1.3 提取剂和提取时间的选择

实验考察甲醇、二氯甲烷、丙酮3种不同提取剂对塑料中PFOA回收率的影响。图3为提取剂对PFOA回收率的影响。从图3可以看出，以丙酮、甲醇为提取剂所获得的提取液较澄清，提取效果较好，二氯甲烷的提取效率较低。以丙酮为提取剂时，低浓度PFOA回收率小于80.0%；以甲醇为提取剂时，塑料中PFOA的回收率为81.6%~105.1%。因此，实验选择甲醇为提取剂。

2.1.4 提取时间的优化

以甲醇为提取剂，超声提取时间分别选择5、10、15、20、25、30、35 min。图4为提取时间对PFOA回收率的影响。从图4可以看出，随着提取时间的延长，塑料中PFOA的回收率逐渐提高，20 min后回收率趋于平稳。因此，选择提取时间为20 min。

2.1.5 样品基质效应

塑料在生产过程中会加入阻燃剂、抗氧化剂、增塑剂等添加剂，同时塑料表面可能会残留油墨、油漆等，以上情况可能会在液相色谱质谱分析过程中产生基质效应(ME)，从而影响测试结果。同位素内标具有与目标物相似的理化性质，可以补偿由基质效应引起的信号改变^[22]。因此，实验利用PFOA-¹³C4同位素内标进行定量，降低基质效应对PFOA的影响^[22]。

实验通过计算基质匹配混合标准曲线与溶剂混合标准曲线的斜率比评价PFOA的ME^[23]。当ME为0.8~1.2时，基质效应不明显，当ME为0.5~0.8或1.2~1.5时，说明存在中等强度基质效应，当ME<0.5或ME>1.5时，说明基质效应强烈^[23]。实验结果表明，PFOA的基质效应为1.04，说明本方法基质效应不明显。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围

图5为PFOA及PFOA-¹³C₄液相色谱-质谱图。根据PFOA质谱信号响应程度的不同制备标准曲线。配制系列质量浓度的标准溶液，按照上述仪器条件进样分析获得标准曲线。采用内标法进行定量分析，PFOA以PFOA-¹³C₄为内标进行定量分析。PFOA标准曲线质量浓度范围为0.1、0.2、1.0、2.0、10.0 μg/L，内标物PFOA-¹³C₄质量浓度为1.0 μg/L。图6为PFOA标准曲线。从图6可以看出，PFOA在曲线浓度范围内，线性关系良好，线性方程为y=2.191x+0.019 34，相关系数(R²)为0.999 4。

2.2.2 LOD和LOQ

在PVB塑料样品中加入一定量的PFOA标准溶液，按照上述前处理方法处理样品后上机测试，用塑料样品溶液逐级稀释，信噪比(S/N)为3时，PFOA的质量浓度为LOD；S/N为10时，PFOA的质量浓度为LOQ。综合考量PVB塑料基质干扰、仪器状态等因素确定PFOA的LOD为1.0 µg/kg，LOQ为3.0 µg/kg。

2.2.3 加标回收和精密度

对PVB塑料样品进行3个质量浓度(10、20、50 ng/g)的加标回收实验，每个质量浓度制备6个样品，计算PFOA回收率。每个加标水平在1 d内平行测定6次，计算日内精密度；在1、3、5 d分别测定6次，计算日间精密度。表3为PFOA的回收率、日内精密度和日间精密度。从表3可以看出，塑料样品中PFOA的回收率为87.3%~102.5%，日内精密度为2.2%~4.7%，日间精密度为3.2%~6.3%，回收率和精密度均满足实际样品测定的要求。

2.3 标准物质定值方式和要求

按照标准物质定值^[24]要求，采用同位素内标-液相色谱串联质谱法，邀请多家实验室同时对标准物质中特性量值进行定值分析，参与定值的实验室具有中国检验检测机构资质认定，检测设备和计量器具均通过检定和校准。表4为8家实验室定值结果。

2.4 标准物质量溯源性

本实验所使用的PFOA和PFOA-¹³C₄标准物质均购自上海安谱实验科技股份有限公司，均为国家有证标准物质，符合标准物定值溯源要求。实验所使用的分析天平、超高效液相色谱-串联质谱联用仪等仪器均通过检定和校准，保证标准物质量值溯源要求。

2.5 标准物质不确定度评价

依据标准物质不确定度^[25]要求，标准物质定值不确定度应考虑所有在定值测量程序中遇到的相关不确定度来源。本实验中标准物质定值不确定度来源主要包括：(1)标准物质的不均匀引入的不确定度(u_hom)；(2)标准物质的不稳定引入的不确定度(u_s)；(3)标准物质的研制过程引入的不确定度(u_char)。

u_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}=\sqrt[]{u_{\mathrm{h}\mathrm{o}\mathrm{m}}^{\mathrm{2}}+u_{\mathrm{s}}^{\mathrm{2}}+u_{\mathrm{c}\mathrm{h}\mathrm{a}\mathrm{r}}^{\mathrm{2}}}(1)

U_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}=u_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\times k(2)

U_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M}}=u_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}\times \overline{x}(3)

式(1)~(3)中：U_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}为扩展不确定度；u_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M},\mathrm{r}\mathrm{e}\mathrm{l}}为合成不确定度；U_{\mathrm{C}\mathrm{R}\mathrm{M}}为绝对不确定度；k为包含因子；\overline{x}为平均值。

表5为PVB塑料中PFOA标准物质定值及不确定度。

3 结论

利用PFOA-¹³C₄同位素内标，建立塑料中PFOA液相色谱串联质谱法。实验考察提取溶剂、提取时间对PFOA回收率的影响，通过优化液相色谱条件和质谱参数，消除基质干扰影响，提高质谱分析的准确度和精密度。该方法灵敏度好，准确度高，可应用于PFOA标准物质定值研究。

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基金资助

吉林省市场监督管理厅科技项目(2023MK005)