阿达木单抗还原肽指纹图谱鉴别方法的建立与验证

摘要

目的 建立阿达木单抗基于高分辨质谱的肽指纹图谱表征分析方法及用于质控放行的肽指纹图谱液相鉴别方法。方法 阿达木单抗经变性、还原、烷基化和酶解后，应用高分辨质谱测定阿达木单抗氨基酸序列覆盖率，并确证互补决定区(complementarity determining region, CDR)特征肽段。建立能够有效鉴别阿达木单抗肽指纹图谱的液相色谱分析方法，并进行方法学验证和应用评价。结果 阿达木单抗经胰蛋白酶(Trypsin)和胞内蛋白酶(Lys-C)酶解后，CDR肽段均由高分辨质谱完成确证。贝伐珠单抗和利妥昔单抗用于评估方法专属性，结果表明该方法专属性强。选择Fc段保守氨基酸序列作为参比峰，以CDR特征肽段的相对保留时间(RRT)和相对峰面积(RPA)考察方法的变异程度。Trypsin酶解的样品连续5次进样各特征肽段RRT的RSD在0.008%～1.097%之间，RPA的RSD在1.212%～7.951%之间；中间精密度考察各特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.985%之间，RPA的RSD在2.306%～10.939%之间；酶切比例为1∶35～1∶45,酶切时间为3.5～4.5 h时，RRT和RPA的RSD均符合方法耐用性要求。Lys-C酶解的样品方法学验证结果也表明其精密度、耐用性均表现良好。不同色谱柱对肽段的选择性、保留强弱、分离效果以及峰强度等具有一定差异。结论 建立的基于Trypsin/Lys-C酶切、鉴定CDR特征肽段的高效液相肽指纹图谱鉴别方法可用于阿达木单抗的质量控制及批检验放行，同时可为企业建立单抗肽指纹图谱鉴别方法提供参考。

关键词

阿达木单抗 / 肽指纹图谱 / 互补决定区 / 高效液相色谱法 / 液质联用 / 方法学验证