牡荆素鼠李糖苷通过EGFR抑制酒精引起的胃上皮细胞焦亡

摘要

目的 探讨牡荆素鼠李糖苷(Vitexin-2″-o-rhamnoside, RHV)对酒精所致胃上皮细胞(human normal gastric epithelial cells, GES-1)焦亡是否有改善作用及其作用机制。方法 GES-1细胞分别用不同浓度(0,200,400,600,800,1 000 mmol/L)酒精干预，检测细胞存活率、焦亡相关蛋白的表达、乳酸脱氢酶(LDH)的释放量，筛选引起细胞焦亡的最佳干预浓度。GES-1细胞分别用800 mmol/L酒精干预0,2,4,6,8 h, CCK-8检测细胞存活率，筛选最佳干预时间。GES-1细胞分别用不同浓度RHV(5,15,30,60μmol/L)预处理，检测酒精引起的细胞存活率及焦亡相关蛋白的变化，筛选RHV的最佳干预浓度。采用网络药理学分析及分子对接预测RHV的可能作用靶点。GES-1细胞分别用酒精及联合RHV预处理干预，检测磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)的表达。GES-1细胞分别用不同浓度EGFR抑制剂(0,1,2,4,8,10 nmol/L)及激活剂(0,5,10,20μmol/L)处理，检测p-EGFR蛋白表达，观察核心靶点改变是否影响细胞焦亡。GES-1细胞分别用不同浓度RHV(0,15,30,60μmol/L)预处理，再用EGFR激活剂干预，检测p-EGFR的表达。Western blot和免疫荧光检测焦亡相关蛋白的表达，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH的释放量。结果 酒精处理后GES-1细胞存活率呈剂量和时间依赖性降低(P<0.05),LDH释放量及cleaved caspase-1, GSDMD-N, NLRP3, IL-1β蛋白表达剂量依赖性增多(P<0.05),考虑模型的稳定性，后续实验选择800 mmol/L酒精干预4 h。RHV预处理后，酒精诱导的GES-1细胞存活率剂量依赖性升高(P<0.01),NLRP3, COX-2, cleaved caspase-1, IL-18蛋白表达剂量依赖性减少(P<0.05),RHV最佳干预浓度为60μmol/L。酒精性胃炎及牡荆素共同作用的核心靶点可能为IL-6,EGFR,IL-1β等，相关通路集中于氧化还原、代谢、受体活化及EGFR相关通路，且RHV与EGFR可能有较好结合性。与酒精单独处理比较，联合RHV预处理后p-EGFR水平升高(P<0.05)。EGFR抑制剂使酒精诱导的LDH释放量及p-EGFR,GSDMD-N,IL-1β蛋白表达剂量依赖性减少(P<0.05),而EGFR激活剂使p-EGFR和GSDMD-N表达增多(P<0.05)。30,60μmol/L RHV预处理使EGFR激活剂诱导的p-EGFR蛋白水平降低(P<0.05)。结论 RHV可通过抑制EGFR磷酸化改善酒精诱导的GES-1细胞焦亡。

关键词

酒精性胃炎 / 牡荆素鼠李糖苷 / 细胞焦亡 / 网络药理学 / 表皮生长因子受体