CaMKK2调控肝细胞癌化疗耐药性的作用和机制

摘要

目的 探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2,CaMKK2)调控肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)化疗耐药性的作用及其机制。方法 (1)为了检测CaMKK2在HCC耐药细胞株中的表达变化，将实验分为亲本组和耐药组。采用浓度梯度递增法建立奥沙利铂(oxaliplatin, OXA)耐药细胞株MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA。采用Western blot检测CaMKK2的磷酸化和总蛋白表达水平。(2)为了检测CaMKK2对肝细胞癌化疗药性的调控作用，将实验分为对照组和CaMKK2敲除组。采用CRISPR/Cas9技术敲除MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株中的CaMKK2基因表达，采用Western blot验证CaMKK2敲除效率。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)实验检测CaMKK2敲除对MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株细胞存活率的影响。采用流式细胞术检测CaMKK2敲除对MHCC97H/OXA和Hep3B/OXA细胞株凋亡的影响。采用Western blot检测CaMKK2敲除对微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)和UNC-51样激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)蛋白表达水平的影响。(3)为了验证CaMKK2对肝细胞癌化疗药性的调控作用，将实验分为CaMKK2敲除+空载体组和CaMKK2敲除+CaMKK2载体组。采用Western blot检测CaMKK2的蛋白表达水平。采用CCK-8实验检测重新表达CaMKK2对CaMKK2敲除的细胞耐药性的影响。采用Western blot检测重新表达CaMKK2对CaMKK2敲除的细胞中AMPK、ULK1和LC3蛋白表达水平的影响。结果 (1)与亲本组相比，耐药组HCC细胞株中CaMKK2的总蛋白表达水平无显著变化(P>0.05),而CaMKK2的磷酸化水平显著升高(P<0.01)。(2)与对照组比较，CaMKK2敲除组细胞中CaMKK2表达水平显著减少(P<0.01)。与对照组比较，CaMKK2敲除组HCC耐药细胞对OXA的敏感性显著提高(P<0.05),OXA细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。与对照组比较，CaMKK2敲除组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著降低，p62蛋白水平显著升高，p-AMPK/AMPK以及p-ULK1/ULK1显著降低(均P<0.01)。(3)与CaMKK2敲除+空载体组比较，CaMKK2敲除+CaMKK2载体组HCC耐药细胞对OXA的敏感性显著降低(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK和p-ULK1/ULK1显著升高(P<0.01)。结论 基因敲除CaMKK2有效逆转HCC化疗耐药性，其作用机制与调控AMPK/ULK1介导的自噬通路相关。

关键词

肝细胞癌 / 化疗耐药性 / 细胞自噬 / CaMKK2 / 奥沙利铂 / 基因敲除