人C/EBP β结构与功能的生物信息学分析及原核表达

摘要

目的 研究人CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBP β)原核表达载体的构建和蛋白表达，并通过生物信息学分析其结构和生物学功能。方法 收集对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721,通过TRIzol法提取SMMC-7721细胞内总RNA,并以RNA为模板采用RT-PCR获得C/EBP β基因的编码序列，通过同源重组的方法将目的基因与原核表达质粒pET-28a(+)相连接，经过大肠杆菌转化、抗性筛选、质粒提取、酶切和DNA测序获得重组质粒pET-28a(+)-C/EBP β。将重组质粒导入大肠杆菌BL21中，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogal, IPTG)诱导C/EBP β重组蛋白表达，采用镍离子亲和层析法纯化C/EBP β融合蛋白，通过蛋白免疫印迹验证目的蛋白并分析C/EBP β的蛋白纯度。同时对人C/EBP β编码的蛋白质进行理化性质、亲水/疏水性、二级结构以及磷酸化位点等生物信息学分析。结果 通过RT-PCR成功获得人C/EBP β基因，构建的pET-28a(+)-C/EBP β重组质粒经测序鉴定C/EBP β DNA序列完全正确，表明重组pET-28a(+)-C/EBP β质粒构建成功。C/EBP β蛋白是一个性质不稳定的亲水蛋白质，由345个氨基酸组成，分子量为36.105 kD,等电点为8.55。其是一种胞内蛋白质，主要分布在细胞质和细胞核。对其结构分析发现：无规则卷曲是其主要的二级结构，为60.87%。蛋白免疫印迹结果显示通过亲和层析纯化后获得较高纯度的C/EBP β。结论 本实验成功克隆并构建人pET-28a(+)-C/EBP β重组质粒，获得较高纯度的C/EBP β,为进一步C/EBP β蛋白功能的研究和抗体的制备奠定了良好的基础。

关键词

C/EBP β / 重组质粒 / 原核表达 / 生物信息学 / 翻译后修饰