人源RNA解旋酶DHX34基因功能结构域缺失载体的构建及鉴定

黄立敏; 张春丽; 李泽雨; 孙晋; 田红卫

doi:10.13753/j.issn.1007-6611.2025.01.004

山西医科大学学报 ›› 2025, Vol. 56 ›› Issue (1) : 20 -27. DOI: 10.13753/j.issn.1007-6611.2025.01.004

人源RNA解旋酶DHX34基因功能结构域缺失载体的构建及鉴定

黄立敏, 张春丽, 李泽雨, 孙晋, 田红卫

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摘要

目的分别构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体，测序分析和验证其在293T细胞中的蛋白表达。方法以pECMV-hDHX34-3×FLAG-SV40-Puro(hDHX34)质粒为模板，根据同源重组克隆的技术原理设计不同功能结构域引物，通过聚合酶链式反应扩增片段，重组克隆到pECMV-MCS-3×FLAG-SV40-Puro空载上，经限制性酶切、重组、转化分别构建ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔOB、ΔWR载体。经测序验证后，利用脂质体转染293T细胞，Western blot检测各载体蛋白的表达。结果测序结果与预期结果相符，证实人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的真核表达载体构建成功。核酸电泳结果显示，hDHX34及突变质粒ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR和ΔOB片段长度符合预期，证明质粒构建成功。Western blot结果显示，293T细胞分别转染ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR、ΔOB载体后，蛋白条带清晰可见且符合预期相对分子量，说明质粒转染成功，hDHX34及各突变质粒成功表达。结论成功构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体，并验证了各载体的表达情况，为研究人源DHX34基因的生物学功能奠定基础。