FLCN对糖尿病视网膜病变发生发展的影响及其机制

摘要

目的 探讨卵泡蛋白（FLCN）对糖尿病视网膜病变（DR）发生发展及腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路的影响。方法 将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19分为对照组、高糖组、shRNA对照（NC-sh）组、FLCN-shRNA(FLCN-sh)组、过表达对照（NC-oe）组和FLCN过表达（FLCN-oe）组。各组细胞转染后，对照组细胞在含正常葡萄糖（5 mmol/L）的培养基中培养48 h；其他组细胞均在含高葡萄糖（25 mmol/L）的培养基中培养48 h。采用CCK-8法检测细胞活力，EdU法检测细胞增殖，TUNEL法检测细胞凋亡。采用一次性腹腔注射1%链脲佐菌素（STZ）溶液（35 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，将糖尿病大鼠继续饲养1个月构建DR大鼠模型。造模后，将DR模型大鼠分为DR组、DR+NC-sh组和DR+FLCN-sh组，每组12只；另取12只正常大鼠作为对照组。对照组和DR组大鼠玻璃体腔注射20μL生理盐水，DR+NC-sh组和DR+FLCN-sh组大鼠分别玻璃体腔注射20μL的NC-sh和FLCN-sh，滴度为1×109 TU/mL，每隔7 d注射1次，共注射4次。HE染色观察视网膜形态，试剂盒检测ARPE-19细胞和大鼠视网膜组织中氧化应激指标[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）]和炎症指标（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平。采用qRT-PCR检测ARPE-19细胞和大鼠视网膜组织中FLCN mRNA水平。采用Western blot检测ARPE-19细胞和大鼠视网膜组织中FLCN、p-AMPKα、AMPKα、线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体融合蛋白1(MFN1)和线粒体融合蛋白2(MFN2)蛋白水平。结果 (1)与高糖组和NC-sh组比较，FLCN-sh组ARPE-19细胞中FLCN mRNA和蛋白水平降低（P<0.05），相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05），细胞凋亡率降低（P<0.05）,SOD、CAT和GSH-Px水平升高（P<0.05）,MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P<0.05）,p-AMPKα、TFAM、MFN1和MFN2蛋白水平升高（P<0.05）。与高糖组和NC-oe组比较，FLCN-oe组细胞中FLCN mRNA和蛋白水平升高（P<0.05），相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.05）,SOD、CAT和GSH-Px水平降低（P<0.05）,MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高（P<0.05）,pAMPKα、TFAM、MFN1和MFN2蛋白水平降低（P<0.05）。(2)与DR组和DR+NC-sh组比较，DR+FLCN-sh组大鼠视网膜组织中FLCN mRNA和蛋白水平降低（P<0.05），眼底新生血管明显减少，视网膜形态明显好转，视网膜组织中SOD、CAT和GSH-Px水平升高（P<0.05）,MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低（P<0.05），视网膜组织中p-AMPKα、TFAM、MFN1和MFN2蛋白水平升高（P<0.05）。结论 下调FLCN可减轻高糖诱导的ARPE-19细胞以及DR大鼠视网膜损伤，其机制可能与激活AMPK信号通路有关。

关键词

糖尿病视网膜病变 / 卵泡蛋白 / 腺苷酸活化蛋白激酶 / 视网膜色素上皮 / 氧化应激 / 炎症