携带miR-141巨噬细胞外泌体对大鼠急性呼吸窘迫综合征的影响及其机制

摘要

目的 探讨巨噬细胞外泌体中miR-141对急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的缓解作用及其分子机制。方法 高速离心法提取RAW264.7细胞外泌体，并通过透射电镜观察外泌体形态，纳米颗粒追踪分析技术测定外泌体的粒径；qRT-PCR检测miR-141在RAW264.7细胞及其外泌体中的表达水平。HUVECs细胞经外泌体处理后，采用荧光显微镜检测外泌体在HUVECs细胞中的摄取，qRT-PCR检测HUVECs细胞中miR-141表达，采用CCK-8检测HUVECs细胞的增殖。大鼠随机分为正常组、模型组、外泌体对照组（exo-NC）、miR-141模拟物外泌体组（exo-miR-141 mimic）和miR-141抑制物外泌体组（exo-miR-141 inhibitor）。通过气管插管技术将脂多糖（LPS）注入大鼠肺部构建ARDS大鼠模型。LPS注射6 h后，exo-NC组、exo-miR-141 mimic组和exo-miR-141 inhibitor组大鼠通过尾静脉注射分别对应的外泌体，每天注射1次，连续3 d。采用HE染色观察和检测肺组织病理变化和损伤程度，称量法检测肺湿/干重比值，血气分析仪检测肺氧合指数和二氧化碳分压。qRT-PCR和免疫组织化学检测大鼠肺组织中Cdk8的表达。双荧光素酶报告实验验证miR-141对Cdk8的靶向调控。结果成功提取并分离了巨噬细胞外泌体，外泌体形态呈碟子状，直径在50～100 nm之间，qRT-PCR结果显示，RAW264.7细胞中miR-141表达水平显著高于外泌体（P<0.001）。HUVECs细胞经外泌体处理后，荧光显微镜观察到PKH67标记的外泌体进入HUVECs细胞；qRT-PCR结果显示，外泌体处理组HUVECs细胞中miR-141表达水平显著低于PBS组（P<0.001）;CCK-8结果显示，外泌体处理组HUVECs细胞增殖显著低于PBS组（P<0.001）。qRT-PCR结果显示，与正常组相比，miR-141 mimic组miR-141的表达显著升高（P<0.001）,miR-141 inhibitor组miR-141的表达则显著降低（P<0.001）;CCK-8结果显示，与对照组相比，miR-141mimic组HUVECs细胞增殖显著升高（P <0.001），而miR-141 inhibitor组HUVECs细胞增殖显著抑制（P<0.001）。与正常组相比，模型组出现明显的肺损伤；与exo-NC组相比，exo-miR-141 mimic组肺组织损伤显著缓解，肺损伤评分、肺湿/干重比值和二氧化碳分压均显著降低（P<0.001），氧合指数显著提高（P<0.001）;exo-miR-141 inhibitor组则与exo-miR-141 mimic组表现出相反趋势。qRT-PCR和免疫组织化学检测结果显示，与exo-NC组相比，exo-miR-141 mimic组Cdk8的表达水平显著降低（P<0.001）,exo-miR-141 inhibitor组Cdk8的表达显著增加（P<0.001）。双荧光素酶报告实验表明，miR-141通过靶向Cdk8的3′UTR区降低Cdk8的表达。结论 巨噬细胞外泌体中miR-141通过下调Cdk8的表达显著缓解了大鼠ARDS的进展，显示了miR-141作为潜在治疗靶点的可能性。

关键词

外泌体 / miR-141 / 急性呼吸窘迫综合征 / 细胞周期蛋白依赖性激酶 / 巨噬细胞 / 大鼠