miR⁃508⁃3p靶向CLEC1B基因抑制肝癌细胞增殖及侵袭

miR⁃508⁃3p inhibits proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells by targeting CLEC1B gene

摘要

目的 探究微小RNA⁃508⁃3p（miR⁃508⁃3p）调控肝癌细胞增殖及侵袭的相关分子机制。 方法 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT⁃PCR）检测本院30例有明确病理诊断的肝癌及对应的癌旁正常组织中miR⁃508⁃3p及C型凝集素结构域家族1成员B（CLEC1B）基因表达量。qRT⁃PCR及Western blot检测人正常肝细胞LO2及肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2中miR⁃508⁃3p及CLEC1B表达差异。人肝癌细胞HepG2分为：control组、NC⁃mimics组、miR⁃508⁃3p mimics组、miR⁃508⁃3p mimics+si⁃NC组和miR⁃508⁃3p mimics+si⁃CLEC1B组，克隆形成实验及Transwell实验分别检测各组细胞增殖及侵袭能力，Western blot检测Hedgehog信号通路相关蛋白（Shh、Gli1、Ptch1）表达。Targetscan生物信息学网站预测miR⁃508⁃3p下游靶基因，双荧光素酶实验检测miR⁃508⁃3p与靶基因CLEC1B相关性。 结果 与癌旁正常组织相比，肝癌组织中miR⁃508⁃3p基因表达量和CLEC1B基因表达量均明显降低（P<0.05），且肝癌组织中miR⁃508⁃3p和CLEC1B表达呈正相关（R²=0.746 2，P<0.001）。与control组及NC⁃mimics组相比，miR⁃508⁃3p mimics组HepG2细胞增殖及侵袭能力显著降低（P<0.05），Hedgehog信号通路中Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达减少（P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验证明CLEC1B是miR⁃508⁃3p的靶标。回复实验结果显示，与miR⁃508⁃3p mi⁃mics+si⁃NC组相比，miR⁃508⁃3p mimics+si⁃CLEC1B组细胞增殖及侵袭能力均显著提升（P<0.05），并且Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达量升高（P<0.05）。 结论 过表达miR⁃508⁃3p可靶向提高CLEC1B表达抑制Hedgehog通路蛋白，进而抑制HepG2细胞增殖及侵袭。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanism of miR⁃508⁃3p regulating the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Methods Real⁃time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qRT⁃PCR） was used to detect the expression levels of miR⁃508⁃3p and CLEC1B genes in 30 cases of liver cancer with definite pathological diagnosis and corresponding adjacent normal tissues. The expressions of miR⁃508⁃3p and CLEC1B in human normal liver cells LO2 and hepatoma cells Huh7， Hep3B and HepG2 were detected by qRT⁃PCR and Western blot. Human hepatoma cells HepG2 cells were divided into control group， NC⁃mimics group， miR⁃508⁃3p mimics group， miR⁃508⁃3p mimics+si⁃NC group and miR⁃508⁃3p mimics+si⁃CLEC1B group. Colony formation assay and Transwell assay were used to detect cell proliferation and invasion abilities， respectively. Western blot was used to detect the expressions of Hedgehog signaling pathway⁃related proteins（Shh，Gli1 and Ptch1）. Targetscan bioinformatics website was used to predict the downstream target genes of miR⁃508⁃3p， and the target relationship between miR⁃508⁃3p and CLEC1B was detected by dual luciferin assay. Results Compared with adjacent normal tissues， the expressions of miR⁃508⁃3p gene and CLEC1B gene were significantly decreased in liver cancer tissues（P<0.05）， and the expressions of miR⁃508⁃3p and CLEC1B were positively correlated in liver cancer tissues（R²=0.746 2， P<0.001）. Compared with control group and NC⁃mimics group， the proliferation and invasion abilities of HepG2 cells were significantly decreased in miR⁃508⁃3p mimics group（P<0.05）， and the protein expressions of Shh， Gli1 and Ptch1 in Hedgehog signaling pathway were decreased（P<0.05）. Dual luciferase reporter gene assay confirmed that CLEC1B was the target of miR⁃508⁃3p. The response test showed that compared with miR⁃508⁃3p mimics+si⁃NC group， the cell proli⁃feration and invasion abilities were significantly increased in miR⁃508⁃3p mimics+si⁃CLEC1B group（P<0.05）， and the protein expressions of Shh， Gli1 and Ptch1 were increased（P<0.05）. Conclusion Overexpression of miR⁃508⁃3p can target to increase CLEC1B expression and inhibit Hedgehog pathway proteins， thereby inhibiting proliferation and invasion of HepG2 cells.

Graphical abstract

关键词

miR⁃508⁃3p / CLEC1B / 肝癌 / Hedgehog信号通路 / 增殖 / 侵袭

Key words

miR⁃508⁃3p / CLEC1B / liver cancer / Hedgehog signaling pathway / proliferation / invasion

原发性肝癌是全球第七大常见癌症，也是2020年全球因癌症死亡的第三大原因^［1］，肝细胞癌是肝癌的主要组织学类型，占肝癌发病率和死亡率的90%以上^［2，3］。尽管有包括肝切除及移植、消融术、化疗栓塞和全身治疗等综合治疗方案^［4，5］，晚期肝癌患者的预后仍然很差^［6］。因此，更好地了解肝癌发生发展的关键调节因子将有助于开发新的治疗策略。

microRNAs（miRNAs）是一种小的内源性非编码RNA，长度为19~25个核苷酸^［7］，其通过与靶mRNA的3'非翻译区（UTRs）结合，转录调节基因表达^［8］，目前被认为是一种新型基因表达调控因子。人类miR-508-3p基因位于染色体Xq27.3^［9］，目前已有研究表明miR-508-3p在胃癌^［10］、乳腺癌^［11］、卵巢癌^［12］等数种癌症组织中表达异常。然而，miR-508-3p在肝癌中的作用仍未完全阐明。

C型凝集素结构域家族1成员B（C⁃type lectin domain family 1 member B，CLEC1B）是一种新型血小板相关分子，主要通过血液中的血小板表达，分子量约为32 kD^［13］。先前的研究表明，CLEC1B不仅在血小板中表达，也在免疫细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞等中表达，它通过识别和结合配体来调节各种信号通路，参与肿瘤发生、发展和转移^{［14，15］}。因此，本研究通过探讨miR-508-3p对肝癌细胞增殖及侵袭的影响及相关机制，并验证CLEC1B与miR-508-3p的靶向关系，为治疗肝癌提供潜在靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取蚌埠医科大学第一附属医院于2023年6月至2023年12月行肝癌根治术患者30例，术中采集肝癌及癌旁正常组织，并-80 ℃保存，用于后续qRT-PCR检测miR-508-3p及CLEC1B表达量。纳入标准：原发性肝癌；术后有明确的肝细胞癌病理诊断；术前均未接受任何其他治疗；肝功能Child-Pugh分级为A或B级；所有患者及家属签署知情同意书。排除标准：存在远处转移；合并其他恶性肿瘤；梗阻性黄疸患者。本研究经蚌埠医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦科批字〔2024〕第219号）。

1.2 材料及试剂

人正常肝细胞LO2及肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2购于中国科学院细胞库；胎牛血清及DMEM培养基购自美国Gibco公司；Transwell小室及matrigel基质胶由美国Corning公司生产；SYBR Green试剂盒由日本Takara公司生产，cDNA反转录试剂盒及Lipofectamine 2000由美国赛默飞公司提供；Shh、Gli1、Ptch1、CLEC1B、GAPDH一抗、IgG二抗均购于英国abcam公司；引物，miR-508-3p mimics及si-CLEC1B片段由中国上海吉玛基因公司生产。

1.3 细胞培养及转染

本次研究细胞均培养于DMEM完全培养基中（内含10%胎牛血清及1%青链霉素），37 ℃，5% CO₂培养箱中培养。取对数生长期细胞，使用Lipofectamine 2000分别将各片段转入HepG2细胞，无血清培养6 h后更换完全培养基，荧光显微镜检测转染效率，完成后续实验。HepG2细胞分为：control组（未转染）、NC-mimics组（转染空载体）、miR-508-3p mimics组（转染miR-508-3p模拟物）；并进行回复实验将HepG2细胞分为：miR-508-3p mimics+si-NC组（同时转染miR-508-3p模拟物和CLEC1B siRNA对照）和miR-508-3p mimics+si-CLEC1B组（同时转染miR-508-3p模拟物和CLEC1B siRNA干扰片段）。

1.4 qRT-PCR检测miR-508-3p及CLEC1B RNA表达量

采用qRT-PCR方法检测肝癌组织和细胞，以及转染处理后各组细胞中miR-508-3p及CLEC1B RNA表达量。TRIzol法提取相应组织或细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA。再根据SYBR Green试剂盒说明，加入引物及cDNA配置体系进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 20 s变性，55 ℃ 40 s退火，72 ℃ 35 s延伸，共35个循环。β-actin为内参，通过2 ^-ΔΔCt 方法检测基因相对表达量。引物序列：①miR-508-3p正向序列：5′-GTCGCTGATTGTAGCCTTTTGG-3′，反向序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3′；②CLEC1B正向序列：5′-GCTGCTATGGGTTCTTCAGG-3′，反向序列：5′- TCCCACTTCCAGACCTCATT-3′；③β-actin正向序列：5'-CTTCGCGGGCGACGAT-3'，反向序列：5'- CCACATAGGAATCCTTCTGACC-3'。

1.5 Western blot检测CLEC1B及Hedgehog信号通路相关蛋白表达

使用RIPA裂解液提取各组HepG2细胞总蛋白并测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h。Shh、Gli1、Ptch1、CLEC1B、GAPDH抗体以1∶1 000稀释比例4 ℃下孵育过夜。IgG二抗以1∶2 000稀释比例室温孵育2 h。配置ECL显影液进行化学发光显影。GAPDH为内参，Image J软件分析条带灰度值，分析目的蛋白相对表达量。

1.6 克隆形成实验检测细胞增殖能力

取对数生长期HepG2细胞，以300个/孔接种于6孔板，37 ℃，5% CO₂培养箱中进行培养，10 d集落形成后，多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，计数细胞集落形成数量。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力

实验前一天将matrigel基质胶平整铺于Transwell小室底部。取各组对数生长期细胞，胰蛋白酶消化细胞后，使用无血清DMEM培养基重悬细胞为1× 10⁵个/mL，吸取100 μL接种于上室，下室为600 μL完全培养基。继续孵育24 h，多聚甲醛固定，结晶紫染色，棉签轻抹去上层未穿膜细胞后显微镜下拍照计数。

1.8 双荧光素酶实验检测miR-508-3p与CLEC1B的靶向关系

分别构建基因质粒CLEC1B野生型（WT-CLEC1B）和CLEC1B突变型（MUT-CLEC1B），取HepG2细胞，按Lipofectamine 2000说明操作，将WT-CLEC1B和MUT-CLEC1B基因质粒分别与NC-mimics或miR-508-3p mimics共同转染，培养箱孵育24 h，根据双荧光素酶报告基因活性化学发光法定量检测试剂盒说明书，检测荧光相对强度。

1.9 统计学分析

通过SPSS 22.0软件分析数据，GraphPad prism 8.0软件制图，计量资料以均值±标准差（X±S）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。每组实验重复3次，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织中miR-508-3p和CLEC1B的表达

qRT-PCR检测结果显示，与癌旁正常组织相比，肝癌组织中miR-508-3p基因和CLEC1B基因表达量均降低（P<0.05，见图1）。Pearson法分析得出，肝癌组织中miR-508-3p与CLEC1B表达呈正相关（R²=0.746 2，P<0.001，见图1）。

2.2 肝癌细胞中miR-508-3p和CLEC1B的表达及转染验证

qRT-PCR检测结果显示，与人正常肝细胞LO2相比，miR-508-3p和CLEC1B基因表达量在肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2中表达量均降低（P<0.05，见图2），HepG2细胞中最低。Western blot检测结果发现，与人正常肝细胞LO2相比，CLEC1B蛋白在肝癌细胞Huh7、Hep3B、HepG2中表达量均降低（P<0.05，见图2）。故本研究选择进行后续转染实验。qRT-PCR实验显示，与control组相比，miR-508-3p表达量在NC-mimics组中无差异，在miR-508-3p mimics组中明显升高（P<0.05，见图2），证明转染成功。

2.3 miR-508-3p对肝癌细胞增殖及侵袭的影响

Transwell实验结果显示，与control组及NC-mi⁃mics相比，miR-508-3p mimics组细胞侵袭能力显著降低（P<0.05，见图3A）。克隆形成实验检测HepG2细胞增殖得出，与control组及NC-mimics相比，miR-508-3p mimics组细胞增殖能力同样降低（P<0.05，见图3B）。

2.4 miR-508-3p对Hedgehog信号通路的影响

Western blot实验检测Hedgehog信号通路蛋白表达情况，与control组及NC-mimics相比，miR-508-3p mimics组中Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达量均明显降低（P<0.05，见图4）。

2.5 miR-508-3p靶向调控CLEC1B基因的验证

Targetscan网站预测miR-508-3p与CLEC1B基因序列之间存在结合位点（见图5A）。双荧光素酶报告表明，在HepG2细胞中，与共转染WT-CLEC1B质粒的NC-mimics组相比，共转染WT-CLEC1B质粒的miR-508-3p mimics组荧光素酶活性明显降低（P<0.05）；与共转染MUT-CLEC1B质粒的NC-mimics组相比，共转染MUT-CLEC1B质粒的miR-508-3p mimics组之间荧光表达无差异（见图5B）。Western blot检测各组HepG2细胞中CLEC1B蛋白发现，与control组及NC-mimics组相比，miR-508-3p mimics组明显升高（P<0.05，见图5C）。

2.6 回复实验证明miR-508-3p与CLEC1B之间的调控关系

qRT-PCR结果显示，与miR-508-3p mimics+si-NC组相比，miR-508-3p mimics+si-CLEC1B组HepG2细胞中CLEC1B基因表达量明显降低（P<0.05，见图6A），证明转染片段有效。Transwell实验表明，与miR-508-3p mimics+si-NC组细胞比较，miR-508-3p mimics+si-CLEC1B组细胞侵袭能力明显提高（P<0.05，见图6B）；克隆形成实验表明，与miR-508-3p mimics+si-NC组细胞比较，miR-508-3p mimics+si-CLEC1B组细胞增殖能力明显提高（P<0.05，见图6C）。Western blot实验显示，与miR-508-3p mimics+si-NC组比较，miR-508-3p mimics+si-CLEC1B组HepG2细胞中Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达量均升高（P<0.05，见图6D）。

3 讨论

目前，全球每年因肝癌死亡的病例高达20万人，新发病例约50万人^［16］。尽管肝癌在早期诊断及治疗方面取得了令人鼓舞的进展，但患者5年生存率仍然不理想，这可能与肝癌的复发和肝癌细胞的转移相关^{［17，18］}。已有文献表明，肝癌的发生和发展与癌基因和抑癌基因的表达有关^［19］，因此了解肝癌的潜在病理机制对改善治疗效果和预后具有重要意义。

现已有研究表明，miR-508-3p在实体恶性肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。Guo等^［20］研究发现，miR-508-3p表达在三阴性乳腺癌组织中显著降低，过表达miR-508-3p基因抑制乳腺癌细胞侵袭及迁移能力，并逆转细胞EMT进程。Chang等^［21］发现，在骨肉瘤组织中miR-508-3p表达量明显低于癌旁正常组织，miR-508-3p可能通过靶向调控下游ZEB1基因抑制MG63细胞增殖侵袭及迁移。本研究同样发现，miR-508-3p表达在肝癌组织中明显降低，且过表达HepG2细胞中miR-508-3p基因后，细胞增殖及侵袭能力明显降低。此外，本研究根据Targetscan网站预测及双荧光素酶实验发现CLEC1B是miR-508-3p的下游靶基因，并且miR-508-3p与CLEC1B表达量呈现正相关性，而敲低CLEC1B表达能够促进HepG2细胞增殖及侵袭。

Hedgehog信号通路是脊椎动物胚胎细胞增殖和分化的中介^［22］。哺乳动物信号通路家族中存在3种类型的Hedgehog同源物，其中Sonic Hedgehog（Shh）最为重要，Shh蛋白属于信号分泌分子，其可以通过结合细胞膜上的12-跨膜蛋白Patched蛋白（Ptch）激活受体细胞的Hedgehog通路^［23］。最新研究表明，Hedgehog信号通路紊乱与多种癌症发展有关，包括胰腺癌、胃癌和乳腺癌等^［24-26］。本研究在HepG2细胞中过表达miR-508-3p后发现，Hedgehog信号通路中Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达量均明显降低，而敲低CLEC1B表达后能够逆转上述结果，提示miR-508-3p可能通过CLEC1B抑制Hedgehog信号通路进程，降低HepG2细胞增殖及侵袭能力。

综上所述，miR-508-3p在肝癌中表达降低，过表达HepG2细胞中的miR-508-3p可靶向提高CLEC1B表达进而抑制Hedgehog通路蛋白，从而降低HepG2细胞增殖及侵袭能力。但本研究仅在组织及细胞层面检测miR-508-3p表达及对肝癌细胞的影响，浅显地探讨了miR-508-3p与CLEC1B基因的靶向性，未有动物实验在体内验证miR-508-3p对肝癌发展的影响。后续本课题组将继续完成相关动物实验，更加完整地说明miR-508-3p在肝癌的发生发展机制中的作用，为肝癌早期诊断及靶向治疗提供新方向。

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基金资助

安徽省高校自然科学研究重点项目(2024AH051276)

蚌埠医科大学科技项目(2023byzd071)