SALL4对宫颈癌细胞顺铂耐药性的影响及其机制

Effect and mechanism of SALL4 on cisplatin resistance in cervical cancer

摘要

目的 探讨婆罗双树样基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）对宫颈癌细胞顺铂耐药性的影响并探讨其可能分子机制。 方法 构建SALL4过表达质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo-SALL4，分别将空质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo（对照）和SALL4过表达质粒转染至HeLa和SiHa细胞，通过新霉素（G418）筛选稳定过表达SALL4的HeLa和SiHa细胞株。采用浓度梯度递增法建立HeLa和SiHa细胞的顺铂（cisplatin，DDP）耐药细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP。过表达SALL4组和对照组宫颈癌细胞加入不同浓度的顺铂（3，6，12，24，48 μg/mL），培养48 h，采用MTT法计算顺铂半抑制浓度（IC₅₀）。过表达SALL4组和对照组宫颈癌细胞加入浓度为5 μg/mL的顺铂，培养不同时间（24，48，72 h），采用MTT法计算细胞活率。应用qRT‐PCR和Western blot法分别检测过表达SALL4细胞及顺铂耐药细胞中SALL4、ABCG2和MDR1的mRNA和蛋白表达水平。 结果 干预48 h，与对照组相比，过表达SALL4组不同浓度顺铂作用下宫颈癌细胞存活率明显升高，顺铂半抑制浓度（IC₅₀）显著升高（P<0.05）。同一浓度顺铂作用下，过表达SALL4组宫颈癌细胞培养48，72 h细胞存活率明显高于对照组（P<0.05）。与对照组比较，过表达SALL4组宫颈癌细胞中ABCG2和MDR1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。顺铂耐药细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP细胞中SALL4、ABCG2和MDR1的mRNA和蛋白表达水平均显著高于亲本细胞（P<0.05）。 结论 过表达SALL4诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药性，其作用机制可能与SALL4调控细胞耐药相关基因ABCG2和MDR1相关。

Abstract

Objective To explore the role and mechanism of spalt-like transcription factor 4（SALL4） in cisplatin（DDP） resistance of cervical cancer. Methods The overexpression plasmid of SALL4（pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo-SALL4） was constructed， then the overexpression plasmid and empty plasmid（pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo） were transfected respectively into HeLa and SiHa cells， and the cells stably expressing SALL4 were screened by neomycin（G418）. The cisplatin resistant cell lines HeLa-DDP and SiHa-DDP were established using concentration gradient increasing method. The cervical cancer cells in SALL4 overexpression group and control group were cultured with different concentrations of cisplatin（3， 6， 12， 24， 48 μg/mL） for 48 h， then the half maximal inhibitory concentration（IC₅₀） of cisplatin was calculated using MTT assay. The cells in SALL4 overexpression group and control group were cultured with cisplatin（5 μg/mL） for 24， 48， 72 h， and the cell viability was calculated using MTT assay. The mRNA and protein expression levels of SALL4， ABCG2， and MDR1 in SALL4 overexpression cells and cisplatin resistant cell lines were detected by qRT‐PCR and Western blot， respectively. Results After 48 h treatment， the cell viability in SALL4 overexpression group was higher than that in control group under different concentrations of cisplatin， and the IC₅₀ of cisplatin was higher（P<0.05）. Under the same concentration of cisplatin， the cell viability in SALL4 overexpression group was significantly higher than that in control group at 48 h and 72 h（P<0.05）. Compared with control group， the mRNA and protein expression levels of ABCG2 and MDR1 were significantly increased in SALL4 overexpression group（P<0.05）. The mRNA and protein expression levels of SALL4， ABCG2， and MDR1 in HeLa-DDP and SiHa-DDP cells were significantly higher than those in parental cells（P<0.05）. Conclusion Overexpression of SALL4 can induce the resistance of human cervical cancer cells to cisplatin， which may be related to the regulation of cell resistance-related genes ABCG2 and MDR1.

Graphical abstract

关键词

宫颈癌 / SALL4 / 基因过表达 / 顺铂 / 耐药性 / ABCG2 / MDR1

Key words

cervical cancer / SALL4 / gene overexpression / cisplatin / drug-resistance / ABCG2 / MDR1

宫颈癌是发生在子宫颈部位的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率和死亡率均位居女性恶性肿瘤第四位^［1］。近几十年来世界范围内宫颈癌的发病率和死亡率有明显下降趋势，与加强健康教育、宫颈癌筛查有关。然而，全球的数据表明新发宫颈癌的平均发病年龄降低，有年轻化趋势^［2］。目前，宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗以及免疫治疗^［3］。化疗是晚期、复发性和转移性宫颈癌患者的重要疗法之一。铂类化疗药物是主要化疗药，然而部分患者会产生化疗耐药性，严重降低铂类药物的疗效^［4］，影响预后。那么，实体肿瘤化疗的耐药难题亟待解决。因此，探索宫颈癌化疗耐药性的分子机制，发掘重要的调控基因，为解决宫颈癌化疗耐药性、提高疗效提供理论依据和治疗靶点意义重大。

婆罗双树样基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4），作为锌指转录因子，在胚胎发育^［5］和细胞增殖^［6］中发挥关键作用。SALL4在胃癌^［7］、乳腺癌^［8］、口腔癌^［9］、前列腺癌^［10］、肺癌^［11］和宫颈癌^［12］等多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭等密切相关^［13］。SALL4已被认为与耐铂类非小细胞肺癌^［14］、阿霉素耐药的乳腺癌^［15］、耐药的急性髓细胞白血病^［16］相关。但是，关于SALL4是否参与宫颈癌的化疗耐药性，目前未见相关报道。基于此，本研究通过在宫颈癌细胞中过表达SALL4基因和构建顺铂（cisplatin，DDP）的耐药细胞株，初步探索SALL4对宫颈癌细胞顺铂耐药功能的调控作用及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

宫颈癌细胞系HeLa和SiHa购自美国ATCC细胞库；DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；脂质体Lipofectamine 2000购自美国Life公司；顺铂购自山东齐鲁制药集团有限公司；MTT细胞增殖检测试剂盒（M1020）购自北京百奥莱博科技有限公司；鼠抗人SALL4抗体、鼠抗人ABCG2抗体、鼠抗人GAPDH抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗人MDR1抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 过表达SALL4细胞株的建立及分组

将构建的SALL4真核表达质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo-SALL4和空质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo按照LipofectamineTM 2000转染说明书转染至HeLa和SiHa细胞，通过G418筛选稳定表达的阳性克隆细胞，用Western blot方法鉴定出稳定表达SALL4的阳性细胞克隆。HeLa和SiHa细胞分别转染空质粒和SALL4过表达质粒，命名为HeLa-GFP组、SiHa-GFP组、HeLa-SALL4组和SiHa-SALL4组。

1.3 顺铂耐药细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP建立

根据文献报道^［17］，应用浓度梯度递增法建立顺铂耐药细胞株。对处于对数生长期的HeLa和SiHa细胞经胰酶消化，接种于35 mm培养皿，当细胞汇合度至60%时，加入0.1 μg/mL顺铂持续处理15 d。再分别按浓度递增添加顺铂（HeLa：0.4，0.8，1.0，2.0 μg/mL； SiHa： 0.2，0.4，0.8，1.0 μg/mL），培养7 d，最终获得稳定生长的顺铂耐药的细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP。

1.4 MTT法检测细胞增殖活性和对顺铂的耐药性

分别将处于对数生长期的各组HeLa细胞（3×10⁴/孔）和SiHa细胞（1×10⁴/孔）接种于96孔板，细胞培养箱中常规培养24 h。①每孔加入不同浓度的顺铂（3，6，12，24，48 μg/mL）培养48 h，加入MTT终浓度为5 g/L的细胞培养液100 µL，37 ℃继续培养4 h，缓慢吸弃上清液，加入DMSO 100 µL，摇床低速震荡15 min，于酶标仪检测各组细胞在490 nm波长处的吸光度值，以此计算顺铂半抑制浓度（IC₅₀）。②每孔加入5 μg/mL顺铂，分别培养24，48，72 h，应用MTT法检测细胞存活率。

1.5 qRT⁃PCR检测SALL4、ABCG2和MDR1基因mRNA的表达

分别收集过表达SALL4宫颈癌细胞和对照细胞以及顺铂耐药细胞株和亲本细胞，采用Trizol试剂盒提取总RNA，然后使用随机引物法反转录获得cDNA，反转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。根据 NCBI 网站上Gene bank中提供的序列设计real-time PCR特异性引物，引物序列见表1。按照SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ说明书的反应条件，在Bio-Rad iQ5 PCR仪中扩增。应用2^-ΔΔCt 法计算SALL4、ABCG2和MDR1的相对表达水平。

1.6 Western blot检测SALL4、ABCG2和MDR1蛋白表达

分别收集过表达SALL4宫颈癌细胞和对照细胞以及顺铂耐药细胞株和亲本细胞，采用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白，BCA蛋白定量法检测蛋白质浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加一抗：SALL4（1∶1 000）、ABCG2（1∶500）、MDR1（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入相应的二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，加入ECL发光剂显影，采用Western blot化学发光成像系统一体机曝光成像并拍照，采用ImageJ2软件分析蛋白条带灰度值。

1.7 统计学分析

本研究采用GraphPad Prism 8软件进行数据统计学分析和制图，实验数据以均数±标准差（X±S）表示，两组间比较采用非配对t检验分析两组间差异，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达SALL4对宫颈癌细胞顺铂IC₅₀的影响

在不同浓度顺铂作用下，HeLa-SALL4和SiHa-SALL4细胞的存活率显著高于各自的对照细胞（P<0.05，见图1）。由此计算出HeLa-SALL4细胞的顺铂IC₅₀为43.14 μg/mL，SiHa-SALL4细胞为44.68 μg/mL，均高于各自对照细胞（HeLa-GFP：20.55 μg/mL，SiHa-GFP：22.82 μg/mL）。

2.2 过表达SALL4对宫颈癌细胞增殖活性的影响

用5 μg/mL的顺铂处理过表达SALL4的宫颈癌细胞及对照细胞48 h和72 h，结果显示HeLa-SALL4和SiHa-SALL4细胞的细胞存活率均明显高于各自对照细胞（P<0.01，见图2）。

2.3 SALL4对耐药基因ABCG2和MDR1的mRNA表达的影响

与对照细胞比较，HeLa-SALL4和SiHa-SALL4细胞中ABCG2和MDR1的mRNA水平显著升高（P<0.05）；与亲本细胞相比，HeLa-DDP和SiHa-DDP细胞中SALL4、ABCG2和MDR1的mRNA水平均明显升高（P<0.05，见图3）。

2.4 过表达SALL4对耐药基因ABCG2和MDR1的蛋白表达的影响

与对照细胞比较， HeLa-SALL4和SiHa-SALL4细胞中ABCG2和MDR1蛋白表达水平明显升高（P<0.05，见图4）。

2.5 顺铂耐药细胞株中SALL4，ABCG2和MDR1的蛋白水平

与亲本细胞比较，HeLa-DDP和SiHa-DDP细胞中SALL4、ABCG2和MDR1蛋白水平明显升高（P<0.05，见图5）。

3 讨论

宫颈癌的发生是多因素、长期相互作用的结果，研究表明基因的异常表达在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用^［18］。前期研究已发现，转录因子SALL4在宫颈癌组织中呈高表达，过表达SALL4促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤形成能力^［12］。而随着肿瘤化疗耐药性的产生，耐药问题已经成为导致肿瘤复发和转移的重要原因。因此需要进一步探索增强宫颈癌化疗敏感性的生物学指标，为宫颈癌化疗耐药的治疗提供新的思路和方法。

既往研究发现SALL4在多种肿瘤化疗耐药中的起关键作用。在非小细胞肺癌中，与亲本细胞相比，顺铂耐药细胞中SALL4的表达显著上调，siRNA敲降SALL4降低顺铂的IC₅₀，抑制细胞增殖，诱导凋亡，通过AKT/mTOR信号通路调控这一过程，从而恢复获得性耐药细胞对顺铂的敏感性^［14］。在乳腺癌中，SALL4在耐药乳腺癌细胞系中高表达，敲降SALL4抑制耐药乳腺癌细胞增殖，诱导细胞周期G1期阻滞，并通过下调膜转运蛋白BCPR逆转肿瘤的化疗耐药性^［15］。在急性髓细胞白血病中，SALL4的表达是急性髓细胞白血病对阿霉素和柔红霉素产生耐药的正性调节因素^［16］。这些研究结果一致提示，SALL4是介导肿瘤化疗耐药的多效性调控因子。本研究结果显示，过表达SALL4显著减弱了宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，具体表现为顺铂的IC₅₀值升高及细胞增殖抑制率显著降低，提示SALL4可增强宫颈癌细胞的顺铂耐药性；在顺铂耐药细胞株中，SALL4的表达水平亦显著升高，这进一步支持了SALL4与宫颈癌顺铂耐药性的相关性。本研究首次在宫颈癌细胞模型中揭示了SALL4在化疗耐药中的关键作用，这与在非小细胞肺癌^［14］、乳腺癌^［15］和白血病^［16］中的发现一致，有力地支持了SALL4作为肿瘤耐药调控因子的多效性，提示SALL4是宫颈癌顺铂耐药的一个重要驱动因素和潜在生物标志物。

肿瘤化疗耐药调控的分子机制比较复杂，包括原癌基因突变、细胞内药物外排增加和DNA损伤修复改变等^［19］。其中ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白介导的药物流出是肿瘤细胞常见的耐药机制之一，ABC亚家族G亚型2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）是ABC转运蛋白超家族之一，通过结合并利用水解ATP提供的能量来转运药物，将化疗药物泵出胞外，导致肿瘤细胞呈现抗药性^［20］。多药耐药蛋白1（multidrug resistance 1，MDR1），也是ABC转运蛋白超家族的重要成员，与肿瘤细胞耐药高度相关^［21］。有研究表明ABCG2和ABCB1的作用与肿瘤的发生、侵袭性和多药耐药性有关^［22］。本研究结果显示，过表达SALL4后，ABCG2和MDR1的mRNA和蛋白表达水平均明显升高；同时在HeLa-DDP和SiHa-DDP中ABCG2和MDR1的mRNA和蛋白表达水平也明显升高，这也与既往ABCG2和MDR1作为广谱耐药标志物作用的研究结果一致^［20-22］，表明SALL4可能通过调控ABCG2和MDR1诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药。

综上所述，SALL4可能通过激活ABCG2和MDR1介导宫颈癌顺铂耐药的作用，这为克服宫颈癌化疗耐药提供了潜在靶点。但是，SALL4调控ABCG2和MDR1的具体分子机制有待进一步研究，并且SALL4的耐药生物学作用也需要在动物体内进一步验证。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2020JM-385)

国家自然科学基金资助项目(82203465)