RAB42对卵巢癌细胞生物学功能及上皮间充质转化的影响

Effect of RAB42 expression on biological function and epithelial mesenchymal transition of ovarian cancer cells

摘要

目的 探究RAS相关蛋白RAB42在卵巢癌组织中的表达和预后价值，及其对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化（EMT）的影响。 方法 基于生物信息学数据库分析RAB42在卵巢癌组织中的表达情况及其对卵巢癌患者生存期的影响。收集55例卵巢癌组织和23例正常卵巢组织，采用RT-qPCR法检测RAB42的表达水平，分析其表达水平与卵巢癌患者临床病理特征及其预后的关系。采用慢病毒载体转染构建下调RAB42表达的SKOV-3卵巢癌细胞模型，采用CCK-8、细胞划痕和Transwell小室侵袭实验检测RAB42基因下调对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，采用Western blot检测RAB42表达改变对EMT相关蛋白表达水平的影响。 结果 与正常卵巢组织比，卵巢癌组织中RAB42的表达显著上调（P<0.05），且高表达的卵巢癌患者总生存期更短（P<0.05）。下调RAB42基因表达后卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显降低（P<0.05），EMT相关蛋白E-cadherin表达水平明显升高（P<0.05），而N-cadherin、Ki-67和Vimentin的表达水平则显著下降（P<0.05）。　结论RAB42基因在卵巢癌中高表达且与患者的不良预后有关。敲低RAB42基因可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力和EMT进程。

Abstract

Objective To investigate the expression and prognostic value of Ras-related protein RAB42 in ovarian cancer， and explore its effect on the proliferation， migration， invasion， and epithelial-mesenchymal transition（EMT） of ovarian cancer cells. Methods The expression of RAB42 in ovarian cancer tissues and its effect on the survival of ovarian cancer patients were analyzed based on bioinformatics database. Fifty-five cases of ovarian cancer tissues and 23 cases of normal ovarian tissues were collected from Shanxi Bethune Hospital to detect the expression level of RAB42 using RT-qPCR， and analyze its relationships with the clinicopathological characteristics and the prognosis. A SKOV-3 ovarian cancer cell model with downregulated RAB42 expression was constructed by transfection with lentiviral vector， CCK-8， cell scratch and Transwell assays were used to detect the proliferation， migration and invasion of ovarian cancer cells， and Western blot was used to detect the expressions of EMT-related proteins. Results Compared to normal ovarian tissues， the expression of RAB42 in ovarian cancer tissues was significantly upregulated（P<0.05）， and the ovarian cancer patients with high RAB42 expression had a shorter overall survival（P<0.05）. After the expression of RAB42 gene was downregulated， the proliferation， migration， and invasion abilities of ovarian cancer cells were significantly reduced（P<0.05）， and the expression of EMT-related protein E-cadherin was significantly increased（P<0.05）， while the expressions of N-cadherin， Ki-67， and Vimentin were significantly decreased（P<0.05）. Conclusion RAB42 gene is highly expressed in ovarian cancer and is associated with poor prognosis of patients. Knockdown of RAB42 gene can inhibit the proliferation， migration and invasion of ovarian cancer cells and the EMT process， and RAB42 may become a potential therapeutic target for ovarian cancer.

Graphical abstract

关键词

卵巢癌 / RAB42 / 预后 / 增殖 / 迁移 / 侵袭 / 上皮-间充质转化

Key words

ovarian cancer / RAB42 / prognosis / proliferation / migration / invasion / epithelial-mesenchymal transition（EMT）

女性生殖系统最致命的恶性肿瘤，卵巢癌（ovarian cancer，OV）是全球女性癌症死亡的第七大原因^［1］。由于起病初期缺乏特异性的临床症状，75%以上的卵巢癌患者确诊时已于病程晚期^［2］。目前的规范模式是手术治疗+以铂类为基础的化疗+维持治疗，即便如此，由于其高耐药率和高复发率，卵巢癌5年总生存率仍不足30%^［2］，根据2022年全球癌症统计数据库（Global Cancer Statistics Database，GLOBOCAN）统计，卵巢癌发病率有下降趋势，但其死亡率无明显变化^［3］。所以不断探索新的治疗靶点是目前面临的主要挑战。

RAB（Ras-related proteins）组成了Ras超家族中最大的小GTP酶家族。人体组织中已鉴定出60多种RAB GTP酶^［4］。RAB GTP酶可以驱动细胞间囊泡运输，它们通过与下游效应子的瞬时相互作用来控制膜芽的形成、囊泡运输和膜融合^［5］。RAB蛋白表达失调与恶性肿瘤密切相关，某些RAB GTP酶的过表达可以增强某些癌细胞类型的增殖、侵袭和迁移^［6］。RAB42，也称为RAB7b，是RAB GTP酶家族的新成员，可能参与代谢相关途径^［7］。随着研究的深入，RAB42已被证实与肿瘤的关系紧密，一项研究报道，与健康对照组相比，RAB42在黏液性肺腺癌患者的肺组织中过表达^［8］。RAB42被指出参与了乳腺癌的发病机制，可能是乳腺癌的潜在治疗靶点^［9］。有学者指出RAB42是脑胶质瘤预后不良的有力指标，在胶质瘤中具有促瘤功能，下调RAB42可通过调控VEGF信号通路，从而触发脑胶质瘤细胞凋亡，抑制脑胶质瘤细胞的增殖和侵袭^［10］。沉默RAB42可以抑制肝癌细胞E2F信号通路，下调PD-L1表达，抑制免疫逃逸，RAB42可能成为肝细胞癌临床诊断和治疗的新标志物^［11］。并且在肝细胞癌中RAB42过表达与细胞凋亡、细胞外基质蛋白、上皮-间充质转化有关，敲低RAB42表达或使其功能失活可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移^［12］。然而迄今为止鲜见RAB42在卵巢癌中作用的报道，在卵巢癌细胞中是否存在RAB42异常表达情况，并且其异常表达与卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为是否有关不得而知。本研究从生物信息学角度探究RAB42在卵巢癌中的表达，观察了RAB42在卵巢癌组织中的表达情况，并分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系，同时通过敲低RAB42表达探究其对卵巢癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的影响，以期为进一步探索卵巢癌的治疗提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选择2016年1月至2018年12月在山西白求恩医院治疗的卵巢癌患者55例作为研究对象，年龄41~70岁，平均55岁，对55例卵巢癌患者进行随访，最长时间为90个月。卵巢癌按照2014年国际妇产科联盟（FIGO）制定的标准，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者分别为10例、6例、25例和14例。根据肿瘤的病理组织学分级，中、高分化26例，低分化29例。选择因子宫平滑肌瘤进行全子宫+双侧附件切除的患者23例，以其正常卵巢组织作为对照。手术切除标本一部分常规制作蜡块行HE染色；一部分组织于新鲜状态下冻存于液氮以便提取总RNA。本研究经山西白求恩医院伦理委员会批准（批准号：YXLL-2024-020），患者知情并签署知情同意书。卵巢癌组织标本经HE染色，经两名病理医师共同鉴定其组织标本为上皮性卵巢癌。

1.2 细胞株及主要试剂

人卵巢癌细胞株SKOV-3购自中国科学院细胞库（上海）。慢病毒GVl02载体购自上海吉凯基因生物公司，嘌呤霉素购自美国sigma公司，CCK-8试剂盒购自美国Abbkine公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，BCA蛋白检测试剂盒购自美国Sigma公司，RAB42抗体购自美国Abcam公司，Transwell小室购自德国Millipore公司。Ki-67及Vimentin、E-cadherin及N-cadherin一抗购自美国ABCAM武汉伊莱瑞特公司，GAPDH一抗、二抗购自上海泊湾生物科技有限公司。

1.3 生物信息学分析

应用GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析卵巢癌及多种恶性肿瘤组织以及正常样本中的RAB42表达数据，并分析卵巢癌组织中mRNA表达。用Kaplan-Meier Plotter数据库（https：//kmplot.com/analysis/）分析RAB42表达对卵巢癌患者生存期的影响。

1.4 qRT-PCR检测RAB42基因的表达水平

从卵巢癌组织及对照组标本中提取总RNA，按TRIzol试剂盒说明书操作。总RNA逆转录成cDNA，并以其为模板进行扩增，GAPDH作为内参，行qRT-PCR扩增检测RAB42的表达，由2^-ΔΔCt 计算目标基因的相对表达量。使用以下PCR程序（每个样品重复3次）：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸20 s，循环45次。RAB42上游引物序列：5′-AGACCTCGGTTAAAAACAACTGC-3′，下游引物序列：5′-AGCCCTCTTCTAGCTTGATGTC-3′；GAPDH上游引物序列：5´-CAGGAGGCATTGCTGGATGAT-3′，下游引物序列：5´-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3´。

1.5 细胞培养

将人卵巢癌细胞株SKOV-3培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素培养基中，37 ℃、5%CO₂培养。根据细胞生长速度和密度更换培养基，取对数生长期的卵巢癌细胞进行后续实验。

1.6 慢病毒转染和分组

构建稳定RAB42基因下调的卵巢癌细胞株，根据RAB42基因序列设计合成干扰片段，构建sh-RAB42干扰质粒，同时合成无义链。根据慢病毒转染手册操作步骤转染，分别将其克隆入慢病毒并转染到SKOV-3细胞系中，用嘌呤霉素（5 μg/mL）筛选转染细胞14 d，获得稳定细胞株，分别命名为sh-RAB42组和sh-NC组。另设不做任何处理的SKOV-3细胞为control组。这三组细胞株用于后续实验。

1.7 Western blot检测RAB42及EMT相关蛋白表达

收集处于对数生长期的细胞，RIPA蛋白裂解液（含1％蛋白酶抑制剂和1％磷酸酶抑制剂）提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，10％脱脂牛奶封闭4 ℃过夜，加入一抗稀释液RAB42（稀释倍数1∶1 000）、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Ki-67（稀释倍数1∶5 000），TBST洗3次，加羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）常温孵育1 h，TBST洗3次，避光显影、拍照，Image J软件分析条带灰度，内参一抗选用GAPDH（1∶ 5 000）。

1.8 CCK-8实验检测卵巢癌细胞的增殖能力

将处于对数生长期的卵巢癌细胞接种至96孔板，待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂在培养箱中孵育1 h。使用酶标仪测定24，48，72 h细胞在450 nm波长下的吸光度值（OD值），并绘制增殖曲线图。

1.9 划痕实验检测卵巢癌细胞的迁移能力

将处于对数生长期的细胞接种于6孔板，培养至细胞达80％融合，待细胞贴壁后，无菌移液管尖端垂直于孔板轻划直线，PBS洗后用细胞培养基培养。观察0，24，48 h时细胞迁移状态并拍照。用ImageJ测量划痕宽度，计算平均划痕愈合率。细胞的迁移能力是通过细胞对划痕区域的修复能力来判断的。

1.10 Transwell侵袭实验检测卵巢癌细胞的侵袭能力

取处于对数生长期的细胞进行侵袭实验。将Matrigel胶与DMEM 培养液按1∶9稀释，上室垂直加入50 μL，放置在37 ℃培养箱中培养3 h，使Matrigel聚合成膜，吸弃上室多余液体，将细胞密度调整为1.0×10⁵/mL，接种于上室，小室的下腔加入500 μL的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，37 ℃、5%CO₂孵育48 h。取出小室，PBS洗3次，用甲醇固定，0. 1%结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野观察并拍照，计数每个视野中的细胞数。

1.11 统计学分析

实验数据分析应用Image J处理分析，并通过Prism10.0和SPSS 26.0进行数据分析与对比，计量资料以均数±标准差（X±S）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用SNK-q检验，采用χ²检验分析分类变量的组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAB42在不同肿瘤组织中的表达

GEPIA数据库中检索结果显示，RAB42在卵巢癌、慢性大B细胞淋巴瘤、多形成性胶质细胞瘤、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌等肿瘤中均显著高表达（见图1）。

2.2 RAB42蛋白在卵巢癌组织中的表达及与临床病理特征的关系

GEPIA数据库结果显示，RAB42在卵巢癌组织中的表达水平显著高于正常卵巢组织（P<0.05，见图2A）。本研究检测55例卵巢癌组织和23例正常卵巢组织中RAB42基因的表达，结果同样显示RAB42在卵巢癌组织中的相对表达量显著高于正常卵巢组织（P<0.05，见图2B）。根据RAB42基因在卵巢癌中表达的中位数（2.025 7），将55例卵巢癌患者分为高表达组（29例）和低表达组（26例），分析患者RAB42基因表达与临床病理特征的关系，结果显示RAB42基因高表达与淋巴结转移及FIGO分期相关（P<0.05，见表1）。

2.3 卵巢癌中RAB42表达对患者生存率的影响

GEPIA数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库中生存分析显示，与RAB42低表达患者相比，RAB42高表达的卵巢癌患者总生存期缩短（P<0.05，见图3）。通过Kaplan-Meier法，绘制卵巢癌患者的总生存时间曲线，结果表明，RAB42高表达的卵巢癌患者总生存期更短（P<0.05，见图3）。

2.4 敲低RAB42对卵巢癌细胞增殖能力的影响

Western blot结果显示，sh-RAB4转染至SKOV-3

细胞后，RAB42表达成功下调（P<0.05，见图4）。CCK-8实验结果显示，与control组及sh-NC组相比，sh-RAB42组细胞增殖能力明显被抑制（P<0.05，见图4）。

图4　敲低RAB42对卵巢癌SKOV-3细胞增殖能力的影响

Figure 4　Effect of RAB42 knockdown on proliferation of ovarian cancer cell line SKOV-3

2.5 敲低RAB42对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响

细胞划痕实验结果显示，敲低RAB42可抑制卵巢细胞的迁移能力（P<0.05，见图5）。Transwell实验结果亦表明，敲低RAB42可抑制卵巢细胞的侵袭能力（P<0.05，见图6）。

2.6 敲低RAB42对卵巢癌细胞EMT的影响

Western blot实验结果显示，与control组和sh-NC组相比，sh-RAB42组E-cadherin表达水平明显升高（P<0.05），而N-cadherin、Ki-67和Vimentin的表达水平则显著下降（P<0.05，见图7）。

3 讨论

卵巢癌严重威胁女性的生命健康，然而由于其发病部位的隐匿性，临床预后往往较差^{［13，14］}。即使经过规范化治疗，其复发率及死亡率仍居高不下^［15］。为了改善患者预后，以期为卵巢癌的治疗提供新的思路，探寻卵巢癌的潜在治疗靶点迫在眉睫。

RAB42是小GTP酶Rab家族的成员^［16］，研究发现RAB42在乳腺癌、肺腺癌、脑胶质瘤、肝细胞癌中均存在异常表达，并且与脑胶质瘤、肝细胞癌患者的不良预后有关，提示RAB42有可能作为恶性肿瘤早期诊断和预后评估的生物学标志物^{［8，9，17-19］}。本研究首先通过GEPIA在线数据库分析，发现RAB42在卵巢癌组织中表达明显增加，并且与患者的不良预后有关，这与RAB42在其他肿瘤表达的报道情况一致，而且这一结论在本研究临床资料中亦得到了验证，即在卵巢癌患者中RAB42表达与淋巴结转移、临床分期呈正相关，证明其高表达可能与卵巢癌进展有关。为了进一步探讨RAB42对卵巢癌细胞生物学功能的影响，本研究设计合成RAB42干扰片段，并转染SKOV3细胞降低RAB42基因表达后，发现卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力明显下降。而这一发现也与其他报道RAB42促进肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学功能一致^{［18，19］}。这些研究结果提示RAB42在卵巢癌中过表达并发挥致癌功能，并影响患者的预后。

导致肿瘤复发的主要原因是肿瘤细胞的侵袭和转移，而上皮-间质细胞转化（EMT）是其获得迁移和侵袭的重要生物学过程^［20］。肿瘤细胞发生EMT过程中可发生免疫抑制作用，从而使其能够躲避机体免疫系统的识别和攻击。EMT发生过程中，当E-cadherin转化为N-cadherin时，可促进细胞增殖，细胞生长失去控制，增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，而N-cadherin的异常表达提供给肿瘤细胞由原发肿瘤范围转移至继发部位的能力，使其获得侵袭性的肿瘤表型的能力，是EMT的标志。Vimentin是典型的间充质分子标志物，对患者的治疗及预后评估具有重要临床意义^{［14，21］}。有学者发现沉默肝细胞癌中RAB42基因的表达可以显著抑制肝癌细胞侵袭、迁移和EMT进程^［12］。为了进一步明确卵巢癌细胞中RAB42表达变化与EMT是否同样存在相关性，本研究检验了抑制RAB42基因表达后EMT相关蛋白的表达，结果显示相比空白组和sh-NC组，sh-RAB42组卵巢癌SKOV3细胞中与肿瘤增殖侵袭相关E-cadherin表达水平显著上升，N-cadherin、Vimentin和Ki-67表达水平明显降低，这与既往学者在其他恶性肿瘤中的研究结果一致。提示RAB42可能参与EMT进程，并通过调控EMT相关基因的表达进而促进卵巢癌细胞的恶性行为。

综上所述，RAB42基因在卵巢癌中高表达，并且与患者的不良预后有关，敲低RAB42基因的表达会抑制卵巢癌增殖、迁移、侵袭能力及EMT进展，提示RAB42可能是卵巢癌的一种促癌基因，有望成为卵巢癌预后评估的标志物。但本研究未能观察RAB42对卵巢癌细胞凋亡的影响，且仅从体外实验初步探讨RAB42表达及对卵巢癌细胞生物学行为的影响，未来需进一步研究其是通过何种途径促进EMT的发生，并进行动物实验以验证其在体内是否具有同样效应。

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基金资助

山西省基础研究计划项目(202103021224352)

中央引导地方科技发展基金项目(YDZJSX2022B012)