基于转录组学与细胞模型的天然免疫网络昼夜节律特性研究

Research on circadian rhythm characteristics of innate immune network based on transcriptomics and cell models

摘要

目的 系统解析天然免疫网络的全局节律特征，探究基于昼夜节律系统开展免疫干预的可行性。 方法 整合GEO和GTEx两大公共数据库的转录组数据集开展分析，系统解析4条天然免疫通路中54个核心基因的昼夜震荡特征。利用地塞米松同步处理构建基于293T细胞的昼夜节律模型，验证视黄酸（维甲酸）诱导基因I（RIG-I）受体通路基因表达与免疫应答强度的节律特征。利用时钟基因REV-ERBα的抑制剂SR8278，以及基因CLOCK的抑制剂CLK8分别处理293T细胞，考察干预昼夜节律系统对天然免疫应答的影响。 结果 转录组数据分析结果显示在天然免疫网络54个关键基因中，30个基因呈现出昼夜震荡特征。其中TBK1激酶与NF-κB亚基RELA等分子在U2OS细胞、阴道组织等至少两种样本类型中呈现显著且稳定的节律性表达（P<0.05）。基于293T细胞的昼夜节律模型中，RIG-I信号通路中IFIH1、TBK1、IRAK1、RELA和IRF3基因的表达存在显著昼夜节律变化。免疫应答强度也呈现出显著昼夜节律特征，其中授时因子时间（ZT）24时组的ISG15、INFβ、ISG56和CCL5的基因表达水平显著低于ZT12时组（P<0.05）。基于抑制剂的昼夜节律干预实验结果显示，与CLK8处理组相比，SR8278处理组293T细胞中天然免疫效应分子基因ISG15、INFβ、ISG56和CCL5的表达水平提高30%以上（P<0.05）。 结论 天然免疫网络核心基因表达呈现显著的昼夜震荡节律，且激活昼夜节律系统可有效增强免疫应答水平，基于昼夜节律系统开展免疫干预具有科学可行性。

Abstract

Objective To systematically analyze the global rhythmic characteristics of the innate immune network and explore the feasibility of immune intervention based on the circadian rhythm system. Methods The transcriptome datasets from the two major public databases， GEO and GTEx， were integrated to systematically dissect the circadian oscillation characteristics of 54 core genes in four innate immune pathways. A circadian rhythm model of 293T cells was established by dexamethasone synchronization treatment to verify the rhythmic characteristics of gene expression and immune response intensity in the retinoic acid-inducible gene I（RIG-I） receptor pathway. 293T cells were respectively treated with the key circadian rhythm system gene REV-ERBα inhibitor SR8278 and the gene CLOCK inhibitor CLK8 to investigate the impact of interfering with the circadian rhythm system on innate immune responses. Results The results of transcriptome data analysis showed that among the 54 key genes of innate immunity， 30 genes including IRAK1 exhibited circadian oscillation characteristics. Among them， the molecules such as TBK1 kinase and NF-κB subunit RELA showed significant and stable rhythmic expression in at least two sample types including U2OS cells and vaginal tissues（P<0.05）. In the circadian rhythm model based on 293T cells， the expressions of IFIH1， TBK1， IRAK1， RELA and IRF3 genes in the RIG-I signaling pathway showed significant circadian rhythm changes， and the intensity of the immune response also presented significant circadian rhythm characteristics. The expression levels of ISG15， INFβ， ISG56 and CCL5 at ZT24 were significantly lower than that at ZT12（P<0.05）. The results of the circadian rhythm intervention experiments showed that compared with CLK8 treatment group， the expression levels of the natural immune effector molecule genes ISG15， INFβ， ISG56 and CCL5 in 293T cells increased by more than 30% in SR8278 treatment group（P<0.05）. Conclusion The expression of core genes in the innate immune network shows significant circadian oscillation rhythms， and activating the circadian rhythm system can effectively enhance the immune response level. It is scientifically feasible to carry out immune intervention based on the circadian rhythm system.

Graphical abstract

关键词

昼夜节律系统 / 天然免疫信号通路 / 转录组分析 / 时间节律调控 / 细胞模型 / “时间精准化”治疗

Key words

circadian rhythm system / innate immune signaling pathway / transcriptome analysis / temporal rhythm regulation / cell model / “time-precise” treatment

昼夜节律系统是生物体在长期进化过程中形成的内源性计时机制，可调控10%~40%的哺乳动物基因表达，以此协调代谢、免疫及神经内分泌等系统的昼夜节律性波动^［1-3］。在免疫系统中，多种免疫功能（如免疫细胞迁移、趋化作用、抗原提呈及细胞因子释放等）及关键免疫参数（如循环白细胞数量、淋巴细胞亚群分布、细胞因子水平等）均呈现显著的昼夜依赖性特征^［4，5］。天然免疫作为宿主防御病原体入侵的第一道防线，已有研究发现，天然免疫核心信号通路［如Toll样受体（TLR）信号通路、RIG-I样受体（RLR）信号通路、NOD样受体（NLR）信号通路和cGAS-STING信号通路］的激活强度与效应输出均存在显著昼夜震荡。例如，巨噬细胞中TLR9介导的炎症反应在小鼠活动期（黑夜期）比静息期增强3倍以上^［6］，而环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）对胞质脱氧核糖核酸的识别效率在昼夜不同阶段差异达40%^［7］。此外，流行病学证据也表明，昼夜节律紊乱已成为威胁公众健康的核心问题。流行病学研究显示，长期轮班工作者患呼吸道感染的风险增加23%^［8］，而睡眠障碍患者疫苗接种后的抗体效价下降高达50%，凸显免疫节律稳态对宿主健康的重要性^［9］。然而，现有研究多局限于天然免疫系统单一免疫基因或通路的节律调控分析，其中关于天然免疫网络昼夜节律特性尚不明确，制约了基于昼夜节律的精准免疫干预策略开发。因此，本研究通过整合多样本转录组学数据分析与体外细胞模型验证，系统解析天然免疫信号通路的昼夜调控网络，并探索了基于昼夜节律的免疫干预的可行性，为基于昼夜节律的精准免疫干预提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据收集

本研究基于国际权威生物医学数据库GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和GTEx（https：//www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project），系统整合了5个经严格质控的公共数据集（GSE220120、GSE57891、GSE71620、GTExV8_Uterus、GTExV8_Vagina），涵盖5种生物样本类型：包括3例健康志愿者外周血样本（GSE220120）、2例人脑组织原代细胞（GSE71620）、2例U2OS细胞系昼夜培养样本（GSE57891）、1例人子宫上皮组织（GTExV8_Uterus）及1例阴道组织（GTExV8_Vagina）。

1.2 数据的整理与分析

针对所获取的原始数据利用常规的Python预处理pipeline开展预处理工作，具体涵盖适配子切除、低质量读长过滤、宿主基因组污染去除等操作。完成预处理后，将这些经过处理的读长与参考基因组或转录组进行比对。依据比对结果，精准计算每个基因的表达水平，实现原始测序数据到标准化BAM文件的快速转化（平均处理速度提升4.5倍），处理后的数据经SAMtools flagstat和BAM文件过滤（映射率>70%，唯一匹配率>85%）后，采用featureCounts v2.0进行基因表达定量，通过M值修剪均值法（trimmed mean of M-values，TMM）归一化算法计算基因的每百万reads中对应基因每千碱基长度的reads数（reads per kilobase of transcript per million mapped reads， RPKM），构建可比的基因表达矩阵。随后，基于不同时间点所获得的基因表达数据，采用Cosinor模型拟合基因表达曲线，预测基因的节律相位与振幅。针对天然免疫通路关键基因（见表1），深入剖析天然免疫相关基因的昼夜节律特性。

1.3 昼夜节律细胞模型构建

本研究参照之前所报道的方法^［10］，采用地塞米松（Dex）同步化策略构建293T细胞昼夜节律模型。具体构建步骤如下：使用浓度为100 nmol/L的Dex对生长到80%-90%的293T细胞进行2 h的处理。处理完毕后，细胞更换新鲜培养基。在随后的28 h内，每隔4 h采集一次293T细胞样本。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法对昼夜节律核心基因（如BMAL1、CLOCK、PER1、PER2、CRY1、CRY2等）的mRNA表达水平进行检测，引物序列见表2。随后，基于不同时间点所获得的基因表达数据，采用Cosinor模型拟合基因表达曲线，预测基因的节律相位与振幅等关键参数。

1.4 RT-PCR检测RIG-I通路中显著昼夜节律变化基因表达

为了验证生信分析获得的显著昼夜节律变化基因的普适性，基于构建的293T昼夜节律细胞模型， 对10个RIG-I通路中表现出显著昼夜节律变化的基因（IFIH1、Mavs、TBK1、IRAK1、IKBKE、IKBKG、NFκB1、RELA、IRF3、IRF7）进行细胞水平验证。具体步骤如下：使用浓度为100 nmol/L的地塞米松对生长到80%~90%的293T细胞进行2 h的处理。处理完毕后，细胞更换新鲜的培养基。在随后的28 h内，每隔4 h采集一次293T细胞。用RT-PCR法检测10个基因的mRNA表达水平，引物序列见表3。随后，基于不同时间点所获得的基因表达数据，采用Cosinor模型拟合基因表达曲线，预测基因的节律相位与振幅等关键参数。

1.5 昼夜节律对RIG-I通路免疫应答的影响

1.5.1 分组与处理

为探究昼夜节律对RIG-I通路免疫应答的影响，基于293T细胞分别设置对照组、昼夜节律未同步组（Without Dex组）、昼夜节律同步ZT12时组（ZT12组）和昼夜节律同步ZT24时组（ZT24组）。其中，对照组不进行Dex和poly（I：C）刺激处理，只用溶媒PBS处理，Without Dex组的细胞不经过Dex处理，然后在任意单个时间点对细胞采用poly（I：C）刺激处理，以此模拟自然状态下无节律调控时的免疫应答情况。而ZT12组和ZT24组则先使用Dex处理293T细胞2 h，使细胞的昼夜节律实现同步化，之后分别在ZT12和ZT24这两个特定时间点对细胞进行poly（I：C）刺激处理，从而对比不同节律时段下免疫应答的差异。

为了探究干预昼夜节律对RIG-I通路免疫应答的影响，本实验将未进行Dex处理的293T细胞分别设置对照组（Control组）、溶媒处理组（Vehicle组）、SR8278处理组（使细胞更多的处于ZT0-ZT12的光照/活动期）和CLK8处理组（使细胞更多的处于ZT12-ZT24的黑暗/静息期）。其中，对照组不进行poly（I：C）刺激处理，Vehicle组、SR8278处理组及CLK8处理组分别以溶媒二甲亚砜、10 mmol/L SR8278或10 mmol/L CLK8对293T细胞进行24 h处理，随后采用poly（I：C）进行刺激。

1.5.2 RT-PCR检测RIG-I通路免疫应答水平

不同组都在poly（I：C）处理4 h后取样，用RT-PCR法检测干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene 15，ISG15）、干扰素-β（interferon beta，IFN-β）、干扰素刺激基因56（interferon-stimulated gene 56，ISG56）以及趋化因子配体5（C-C motif chemokine ligand 5，CCL5）的表达水平，引物序列见表4。所有实验均独立重复3次，且每次实验中生物样本设置6次重复。

1.6 统计学分析

采用Python、R以及GraphPad Prism 6.0软件开展统计作图。计量资料用均值±标准差（X±S）的形式呈现。对于计量资料的组间比较，多组间的两两比较先通过方差分析（ANOVA）判断整体差异是否显著，若整体差异具有统计学意义（P<0.05），则进一步采用Tukey检验进行组间两两比较。若数据不服从正态分布，则采用非参数秩和检验。当P<0.05时，认定差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 天然免疫核心基因表达的昼夜节律振荡

基于GEO和GTEx数据库转录组数据系统分析天然免疫4条通路中核心基因的振荡周期、峰值和相位位移等关键参数，结果发现天然免疫54个关键基因中30个基因的表达均呈现显著的昼夜节律变化特征。其中，TBK1、IRAK1、CHUK、TLR2等多个基因在多种组织样本中表现出显著的昼夜震荡特征，是典型的节律相关基因（见图1A、B）。进一步分析表明，50%的受体基因（14/28）、效应分子（4/8），60%的衔接蛋白（3/5）、转录因子（3/5）以及75%的激酶基因（6/8）是节律相关基因（见图1C），这一结果表明，天然免疫信号通路的调控机制对昼夜节律系统存在高度依赖性。其中，激酶分子TBK1作为免疫信号转导的关键分子，同时在U2OS细胞和阴道组织样本等4种组织中均呈现时间依赖性节律表达（见图1D）。此外，关键转录因子RELA（NF-κB亚基）的表达在U2OS细胞和阴道组织样本中也同时表现出显著的昼夜震荡特征（图1E）。

2.2 昼夜节律细胞模型的成功构建

为验证昼夜节律对天然免疫信号通路的影响，本研究利用Dex构建基于293T细胞的昼夜节律细胞模型，并通过检测细胞中核心生物钟基因（如BMAL1、CLOCK等）在28 h内的mRNA表达水平动态变化，判断模型构建是否成功。结果显示，与ZT0时相比，核心生物钟基因在28 h内呈现出典型的昼夜节律性震荡表达，其中BMAL1、CLOCK和NPAS2基因在白天表达升高，而PERs和CRYs基因在夜间表达较高（见图2）。进一步数据分析显示，构建的细胞模型中，昼夜节律核心基因的表达表现出显著的昼夜震荡特征（P<0.05，见表5），表明构建的模型稳定，能稳定体现昼夜节律特征。同时，核心基因的周期都在24 h左右，其中BMAL1、CLOCK和NPAS2的峰相位分别在ZT12、ZT14和ZT14，而PER1、PER2、PER3、CRY1和CRY2的峰相位分别在ZT22、ZT18、ZT20、ZT20和ZT22（见表5），符合BMAL1、CLOCK和NPAS2基因在白天表达较高，而PERs和CRYs基因在夜间表达较高的特点，进一步验证了该模型的准确性和可靠性。

2.3 基于构建的细胞模型验证RIG-I通路中显著昼夜节律变化基因

为了验证生信分析获得的显著昼夜节律变化基因的普适性，本研究在构建的昼夜节律细胞模型中，主要验证了10个RIG-I通路中表现出显著昼夜节律变化的基因。结果显示，与生信分析结果不同的是，只有IFIH1、TBK1、IRAK1、RELA和IRF3在内的5个基因在293T细胞模型中表达表现出显著的昼夜震荡特征（P<0.05）；昼夜节律参数分析结果显示，IFIH1、TBK1、IRAK1会在白天达到表达的峰值，而RELA和IRF3会在晚上进入表达的峰值（见图3、表6）。结果表明，构建的昼夜节律细胞模型可以一定程度上模拟昼夜节律对天然免疫信号通路的影响，为后续研究提供了重要的验证基础。

2.4 昼夜节律对天然免疫应答的影响

为了探究昼夜节律对天然免疫信号通路的影响，本研究基于293T细胞探究昼夜节律对RIG-I通路免疫应答的影响。实验结果显示，与对照组相比，Without Dex组在poly（I：C）刺激后，ISG15、INFβ、ISG56和CCL5的表达水平显著提高（P<0.05，见图4A），提示该组产生了较好的免疫应答。进一步比较发现，ZT12组的免疫应答均强于Without Dex组，但仅INFβ的表达差异具有统计学意义（图4A）；而ZT24组的免疫应答水平显著低于ZT12组（P<0.05，见图4A），表明天然免疫应答具有显著的时间差异性。

此外，本研究利用生物钟基因抑制剂来探究干预昼夜节律对RIG-I通路免疫应答的影响，实验结果显示在未进行昼夜节律同步的条件下，SR8278处理组的细胞免疫应答显著强于对照组和CLK8处理组，ISG15、INFβ、ISG56和CCL5的表达水平提高30%以上（P<0.05，见图4B），呈现出与ZT12组和ZT24组对比一致的差异趋势，表明干预昼夜节律系统可以调控RIG-I通路免疫应答。综上结果表明，昼夜节律对RIG-I通路的应答具有显著影响。

3 讨论

昼夜节律系统是生物体在长期进化过程中形成的内源性计时机制，可调控10%~40%的哺乳动物基因表达，以此协调代谢、免疫及神经内分泌等系统的昼夜节律性波动，系统解析天然免疫网络的全局节律特征，可以为“时间精准化”治疗提供重要的理论依据^{［11，12］}。本研究全面且系统地整合多样本转录组数据集，深度剖析了天然免疫信号通路中54个核心基因的昼夜震荡特征，结果表明，TBK1、NF-κB亚基RELA等关键分子在多种组织中呈现稳定的节律表达模式，这一成果为理解天然免疫的时间特异性调控机制提供了关键线索，弥补了现有研究^{［13，14］}多是对天然免疫系统中单一免疫基因或通路的节律调控分析的局限。为进一步验证生信分析结果，并深入探究昼夜节律对天然免疫的影响，本研究成功构建了基于293T细胞的昼夜节律模型。通过该模型证实，RIG-I受体通路的基因表达和免疫应答强度呈现出明显的时间依赖性调控特征，在ZT12时最强，ZT24时最弱。这一结果表明天然免疫应答在时间维度上的精细调控规律，意味着机体在不同时间点对病原体的免疫防御能力存在差异。这种差异可能与机体的日常活动模式、代谢状态以及环境因素的昼夜变化相适应，从而为优化免疫干预策略提供了重要的时间依据。此外，节律干预实验结果显示，激活昼夜节律系统能够显著增强干扰素-β等效应分子的表达。这一结论不仅表明了昼夜节律系统在调控天然免疫应答中的重要作用，也证实了基于昼夜节律调控进行免疫干预的可行性，为“时间精准化”治疗奠定了坚实的理论基础。在实际应用中，这一理论成果具有潜在的指导价值。例如，在疫苗接种方面，依据本研究结论，选择在活动期（ZT0-ZT12时）接种疫苗，可能会增强机体的抗体效价，提高疫苗的预防效果；对于炎症性疾病的治疗，在静息期（ZT12-ZT 24时）使用抗炎药物，或许能够有效减少过度免疫反应，降低炎症对机体的损伤^{［15，16］}。

然而，本研究也存在一定的局限性。在模型方面，虽然基于293T细胞构建的昼夜节律模型为研究提供了重要的细胞水平证据，但细胞模型与复杂的生物体存在差异。因此，在未来的研究工作中，本研究结论需要在动物模型及临床队列中进一步验证。只有通过更接近真实生理环境的研究，才能确保研究成果在实际临床应用中的有效性和安全性。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81972652)

国家自然科学基金项目(32270635)

北京市自然科学基金项目(7232082)

北京市自然科学基金项目(5254029)

首都医科大学培育基金项目(PYZ24165)

量子传感与精密测量山西省重点实验室开放基金项目(201905D121001005)

首都医科大学附属北京地坛医院院内科研基金项目(DTQL-202405)