miR-320介导氧化应激在糖尿病视网膜病变中的作用机制

Role and mechanism of miR-320-mediated oxidative stress in diabetic retinal microangiopathy

摘要

目的 探讨miR-320介导氧化应激反应参与糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的机制。 方法 采用H₂O₂诱导构建视网膜内皮细胞氧化应激模型，并利用miR-320敲低或过表达质粒以及NF-κB激活蛋白（NKAP）过表达质粒转染细胞。将视网膜内皮细胞（hRECs）分为H₂O₂（0，50，100，200 μmol/L）组、agomir-NC组、agomir-320组、antagomir-NC组、antagomir-320组、PBS+agomir-NC组、PBS+agomir-320组、H₂O₂+agomir-NC组、H₂O₂+agomir-320组、agomir-NC+Vector组、agomir-NC+NKAP oe组、agomir-320+Vector组、agomir-320+NKAP oe组。CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，ELISA检测氧化应激相关指标过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，qRT-PCR检测miR-320及NKAP的mRNA水平，Western blot检测炎症因子IL-1β、IL-6、IκBα、p-NF-κB、NF-κB和NKAP蛋白水平。荧光素酶报告基因实验（LUC）验证miR-320与NKAP靶向关系。 结果 与0 μmol/L H₂O₂相比，不同浓度H₂O₂处理均显著降低hRECs细胞活力、增加细胞凋亡率及细胞内ROS水平（P<0.05）。Western blot结果证实，H₂O₂呈浓度依赖性地诱导炎症相关蛋白IL-1β、IL-6的表达及NF-κB信号通路的激活（P<0.01）。为确保实验有效性，最终选择100 µmol/L H₂O₂用于后续实验。成功构建miR-320低表达和高表达的hRECs。与PBS+agomir-NC组或H₂O₂+agomir-NC组相比，PBS+agomir-320组和H₂O₂+agomir-320组hRECs凋亡率，CAT、MDA、SOD水平，炎症因子和p-NF-κB水平均显著降低（P<0.05），IκBα蛋白表达显著上调（P<0.05）。LUC实验证实miR-320能够与NKAP靶向结合并下调NKAP的表达。与agomir-NC+Vector组或agomir-320+Vector组相比，agomir-NC+NKAP oe组或agomir-320+NKAP oe组hRECs细胞凋亡，CAT、MDA、SOD水平，炎症因子和p-NF-κB水平均显著上调（P<0.05），IκBα蛋白水平显著降低（P<0.05）。 结论 miR-320能够与NKAP靶向结合，并通过下调NKAP的表达抑制细胞的氧化应激反应，进而缓解DR的进程。

Abstract

Objective To explore the mechanism of miR-320-mediated oxidative stress response involving in diabetic retinopathy（DR）. Methods The oxidative stress model of retinal endothelial cells was induced by H₂O₂， and the cells were transfected with miR-320 knockdown or overexpression plasmids and NKAP overexpression plasmids. Retinal endothelial cells（hRECs） were divided into PBS group， H₂O₂（50， 100， 200 μmol/L） groups， agomir-NC group， agomir-320 group， antagomir-NC group， antagomir-320 group， PBS+agomir-NC group， PBS+agomir-320 group， H₂O₂+agomir-NC group， H₂O₂+agomir-320 group， agomir-NC+Vector group， agomir-NC+NKAP oe group， agomir-320+Vector group， and agomir-320+NKAP oe group. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay， cell apoptosis was detected by flow cytometry， the levels of oxidative stress-related indicators such as catalase（CAT）， malondialdehyde（MDA）， and superoxide dismutase（SOD） were detected by ELISA， and the mRNA levels of miR-320 and NKAP were detected by qRT-PCR. The protein levels of inflammatory factors IL-1β， IL-6， IκBα， p-NF-κB， NF-κB and NKAP were detected by Western blot. Luciferase reporter gene experiment（LUC） was used to verify the targeted binding of miR-320 to NF-κB activating protein（NKAP）. Results Compared with 0 μmol/L H₂O₂， different concentrations of H₂O₂ significantly reduced the viability of hRECs cells， and increased the apoptosis rate and intracellular ROS levels（all P<0.05）. Western blot results confirmed that H₂O₂ induced the expression of inflammation-related proteins IL-1β and IL-6 and the activation of NF-κB signaling pathway in a concentration-dependent manner（P<0.01）. To ensure the validity of the experiment， 100 µmol/L H₂O₂ was finally selected for the subsequent experiments. The hRECs with low and high expression of miR-320 were successfully constructed. Compared with PBS+agomir-NC group or H₂O₂+agomir-NC group， the apoptosis rate of hRECs， the levels of CAT， MDA， SOD， and inflammatory factors and p-NF-κB in hRECs were significantly decreased in PBS+agomir-320 group or H₂O₂+agomir-320 group， and the expression of IκBα protein was significantly upregulated（P<0.05）. The LUC experiment verified that miR-320 could targetedly bind to NKAP and downregulate the expression of NKAP. Compared with agomir-NC+Vector group or agomir-320+Vector group， the apoptosis rate of hRECs， the levels of CAT， MDA， SOD and inflammatory factors， and p-NF-κB in hRECs were significantly upregulated in agomir-NC+NKAP oe group or agomir-320+NKAP oe group， and the level of IκBα protein was significantly decreased（P<0.05）. Conclusion miR-320 can target and bind to NKAP， and inhibit the oxidative stress response of cells by downregulating the expression of NKAP， thereby alleviating the progression of DR.

Graphical abstract

关键词

糖尿病视网膜病变 / 视网膜内皮细胞 / 氧化应激 / 炎症 / miR-320 / NF-κB激活蛋白 / 细胞凋亡

Key words

diabetic retinopathy / human retinal endothelial cells / oxidative stress / inflammation / miR-320 / NF-κB activating protein / apoptosis

随着人们生活质量不断提高，糖尿病发生几率不断增加，预计到2045年将有6.93亿成年人受糖尿病困扰^［1］。糖尿病中晚期会出现多种并发症（如心血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等），严重影响患者正常生活质量，并导致死亡率增加^［2］。其中糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy， DR）是一种常见的进行性的糖尿病微血管并发症，引起不可逆的视网膜损害，最终可能导致患者失明^［3］。

研究表明，氧化应激是引起微血管病变和DR发生发展的重要原因之一^［4，5］。miRNA作为多种生理病理过程中基因表达的关键调节剂和核心参与者，近几年被发现与糖尿病及其并发症密切相关^［6］。其中，miR-320能够调控高糖诱导的血管活性因子表达^［7］，并参与调控缺血脑神经元的氧化应激损伤^［8］。然而其是否介导氧化应激参与DR的发生发展尚不清楚。本研究通过构建H₂O₂诱导的视网膜内皮细胞氧化应激模型，分析miR-320在细胞模型中的表达及其对氧化应激的调控作用及调控机制，为临床治疗DR寻找新的分子靶标提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

视网膜内皮细胞（hRECs）购自中国科学院细胞库；CCK8试剂盒、活性氧ROS试剂盒、BCA试剂盒及RNA提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒及丙二醛（MDA）检测试剂盒均购自上海通蔚生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；IL-1β、IL-6、IκBα、p-NF-κB、NF-κB抗体和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒均购自美国Abcam公司；SYBR green qRT-PCR试剂盒和逆转录试剂盒均购自日本Takara公司；Lipofectamine^TM 2000 转染试剂购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 细胞培养及分组

1.2.1 细胞分组与处理

为探究H₂O₂干预的最佳浓度，hRECs分别用0，50，100，200 μmol/L H₂O₂处理48 h后，采用CCK-8法检测细胞活力。为探究H₂O₂干预的最佳时间，用100 μmol/L H₂O₂分别干预0，24，48，72 h后采用CCK-8法检测细胞活力。

为探讨miR-320在H₂O₂诱导的hRECs氧化应激中的作用，实验分为：PBS组、H₂O₂模型组（100 µmol/L H₂O₂处理48 h）、PBS+agomir-NC组、PBS+agomir-320组、H₂O₂+agomir-NC组、H₂O₂+agomir-320组。

为验证miR-320是否通过NKAP发挥作用，在H₂O₂诱导的氧化应激细胞模型背景下，实验分为：agomir-NC+Vector组、agomir-NC+NKAP oe组、agomir-320+Vector组、agomir-320+NKAP oe组。

1.2.2 细胞模型构建

含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基于37 ℃、5% CO₂培养箱培养hRECs细胞。待细胞生长到80%时，用含0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养，利用100 μmol/L的H₂O₂刺激hRECs 48 h构建视网膜内皮细胞氧化应激模型。

1.2.3 细胞转染

取对数期细胞接种于6孔板中（5×10⁵个/孔），37 ℃中培养过夜，当细胞汇合达80%左右时，分别参照Lipofectamine^TM 2000转染试剂说明书采用miR-320敲低（antagomir-320）或过表达（agomir-320）、NKAP过表达（NKAP oe）质粒以及阴性对照质粒转染细胞。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞活力

将hRECs细胞加入96孔板中（10⁵个/孔），于37 ℃、5% CO₂培养24 h使细胞贴壁。分别按1.2.1分组用H₂O₂干预后，每孔加入10 µL的CCK-8孵育2 h，使用酶标仪检测450 nm波长处的光密度（OD）值。细胞活力（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数期细胞接种于6孔板，按照分组进行不同处理后收集细胞，用500 μL 1×Binding Buffer工作液重悬细胞；每管加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI，混匀后室温孵育5 min，进行流式分析。在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测Annexin Ⅴ-FITC（Ex=488 nm，Em= 530 nm）和通过PI检测通道（Ex=535 nm，Em=615 nm）检测PI，利用配套分析软件对获取的数据进行处理，通过四象限图分析计算细胞凋亡率（早期凋亡细胞百分比+晚期凋亡细胞百分比）。

1.3.3 qRT-PCR检测miR-320的表达效率

hRECs细胞转染miR-320敲低或过表达质粒后，应用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。按SYBR green qRT-PCR试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR扩增反应。反应条件：95 ℃预变性30 s；随后进行40个循环的PCR反应（95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s）；最后进行熔解曲线分析（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s）以确认产物特异性。采用熔解曲线分析扩增产物特异性，采用2^-ΔΔCt 法进行相对定量。

1.3.4 Western blot检测NKAP、炎症和NF-κB通路相关蛋白表达

收集细胞，用蛋白裂解缓冲液冰上裂解1 h，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，分离上清液。用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用10% SDS-PAGE分离凝胶分离蛋白，并转移至PVDF中。5%脱脂牛奶25 ℃封闭2 h，加入IL-1β（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、IKBα（1∶1 000）、NF-κB（1∶1 000）、p-NF-κB（2 µg/mL）、NKAP（1∶3 000）等特异性抗体孵育过夜，GAPDH作为内参，加入相应一抗（4 ℃孵育过夜）。用含TBST的Tris缓冲液洗涤，加入对应的二抗（1∶1 000）孵育1 h。用增强型ECL显影液显色，全自动凝胶成像系统采集和分析数据。

1.3.5 重组wt-NKAP 3′UTR和mut-NKAP 3′UTR构建

构建野生型和突变型两种NKAP荧光素酶报告基因载体。以人源cDNA做为模板DNA，以NKAP 3′UTR-F/R作为引物，通过PCR扩增获得目的片段wt-NKAP 3′UTR和mut-NKAP 3′UTR，PCR完成后进行1%琼脂糖凝胶电泳，采用限制性内切酶DpnⅠ酶切PCR产物，酶切产物转化DH5α感受态细胞，挑选阳性单菌落接种培养，菌液做PCR鉴定及测序。

1.3.6 荧光素酶报告基因实验

miR-320过表达或敲低质粒转染48 h后收集细胞，随后用PBS漂洗，然后裂解细胞，12 000 r/min离心3 min，取上清。吸取20 μL裂解液到发光板中，在各孔中加入100 μL LAR II工作液，轻轻混匀，在多功能酶标仪的发光检测模式下测定萤火虫荧光素酶产生的发光值（RLU1）。在同一孔中加入100 μL海肾荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，再次在多功能酶标仪上测定海肾荧光素酶产生的发光值（RLU2）。计算公式为：相对荧光素酶活性=RLU1/RLU2。

1.4 统计学分析

数据统计及分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料用均数±标准差（X±S）表示，根据方差齐性检验结果，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni检验。P<0.05为具有统计差异性。

2 结果

2.1 H₂O₂对hRECs细胞增殖、凋亡、氧化应激和炎症反应的影响

CCK-8的结果显示，与0 μmol/L H₂O₂相比，100 μmol/L和200 μmol/L的H₂O₂干预均会降低hRECs的活力（P<0.01，见图1）。此外，选择100 μmol/L的H₂O₂干预48 h和72 h，hRECs的细胞活力显著下降（均P<0.01，见图1）。流式细胞术结果显示，与0 μmol/L H₂O₂相比，50，100，200 μmol/L的H₂O₂干预均促使hRECs细胞的凋亡率和ROS水平增加（均P<0.05，见图1）。Western blot结果显示，与0 μmol/L H₂O₂相比，50 μmol/L的H₂O₂仅显著增加NF-κB的蛋白磷酸化水平（P<0.01），对IL-1β、IL-6和IκBα的蛋白水平都没有显著影响（均P>0.05）；100 μmol/L的H₂O₂干预可显著升高IL-1β、IL-6和NF-κB的蛋白磷酸化水平（均P<0.01），但对IκBα的蛋白水平无影响（P>0.05）；200 μmol/L的H₂O₂可显著增加IL-1β、IL-6、IκBα的蛋白水平和NF-κB的蛋白磷酸化水平（均P<0.01，见图1）。结果表明，H₂O₂能够引起hRECs产生氧化应激反应，并显著影响细胞的增殖、凋亡与炎症反应，由于200 μmol/L的H₂O₂导致hRECs活性严重降低，影响实验的顺利进行，因而选择100 μmol/L H₂O₂刺激hRECs构建视网膜内皮细胞氧化应激模型。

2.2 miR-320对H₂O₂诱导的hRECs细胞凋亡、氧化应激和炎症反应的影响

与PBS组相比，H₂O₂组miR-320低表达（P<0.01，见图2）。进一步在hRECs中转染agomir-320后，hRECs中miR-320表达水平显著升高（P<0.01，见图2），表明过表达质粒转染成功。流式细胞术结果显示，与PBS+agomir-NC组或H₂O₂+agomir-NC组相比，PBS+agomir-320组或H₂O₂+agomir-320组hRECs的细胞凋亡率显著降低（均P<0.01，见图2）。

ELISA检测结果显示，与PBS+agomir-NC组相比，H₂O₂+agomir-NC组hRECs中MDA水平显著升高、SOD和CAT水平显著降低（均P<0.01）；与PBS+agomir-NC组或H₂O₂+agomir-NC组相比，PBS+agomir-320组或H₂O₂+agomir-320组hRECs中MDA水平显著降低，SOD和CAT的水平显著增加（均P<0.05，见图3）。

Western blot检测结果发现，与PBS+agomir-NC组或H₂O₂+agomir-NC组相比，PBS+agomir-320组或H₂O₂+agomir-320组hRECs中IL-1β、IL-6的蛋白水平和NF-κB蛋白磷酸化水平显著下调，IκBα的蛋白表达显著上调（均P<0.01，见图4）。

2.3 miR-320与NKAP靶向关系验证及对NKAP蛋白表达的影响

通过双荧光素酶报告基因实验证实，miR-320能够直接靶向NKAP mRNA的3'UTR区，且该靶向结合位点与TargetScan预测结果一致（均P<0.01，见图5）。Western blot结果表明，与PBS组相比，H₂O₂组NKAP蛋白水平显著升高（P<0.01，见图5）。为进一步探究miR-320与NKAP的关系，在hRECs中转染antagomir-320后，hRECs中miR-320表达水平显著降低（P<0.01，见图5），表明敲低成功。qRT-PCR和Western blot结果表明，与agomir-NC组相比，agomir-320组NKAP的mRNA水平和蛋白水平明显降低（P<0.05）；与antagomir-NC组相比，antagomir-320组NKAP的mRNA水平和蛋白水平显著升高（P<0.01，见图5）。2.4　miR-320通过靶向NKAP调控hRECs细胞凋亡、氧化应激和炎症反应

Western blot结果显示，与agomir-NC+Vector组细胞相比，agomir-NC+NKAP oe组细胞中NKAP蛋白表达显著上调；与agomir-320+Vector组细胞相

比，agomir-320+NKAP oe组细胞NKAP蛋白表达显著上调（见图6），表明NKAP过表达成功。流式细胞术结果显示，与agomir-NC+Vector组相比，agomir-NC+NKAP oe组中细胞的凋亡率显著上升（P<0.01）；与agomir-320+Vector组相比，agomir-320+NKAP oe组细胞的凋亡率显著增加（P<0.01，见图6）。

ELISA的结果表明，与agomir-NC+Vector组相比，agomir-NC+NKAP oe组MDA水平显著升高、CAT和SOD的水平明显降低（均P<0.01）；与agomir-320+Vector组相比，agomir-320+NKAP oe组中MDA水平显著升高、CAT和SOD的水平明显降低（均P<0.01，见图7）。

Western blot结果显示，与agomir-NC+Vector组相比，agomir-NC+NKAP oe组IL-1β、IL-6的蛋白水平和NF-κB蛋白磷酸化水平明显增加、IκBα蛋白水平显著降低（均P<0.01）；与agomir-320+Vector组相比，agomir-320+NKAP oe组IL-1β、IL-6的蛋白水平和NF-κB蛋白磷酸化水平明显增加、IκBα蛋白水平显著降低（均P<0.01，见图8）。

3 讨论

DR是糖尿病患者常见的严重并发症之一，也是当前劳动人口视力下降和致盲的主要原因之一，据报道，我国糖尿病患者中DR的总体患病率超过40%^［9，10］。DR早期症状隐匿，当患者自觉视力受损时病情已进展至晚期，治愈难度较大，严重者可发生视力残疾^［11］。目前DR的治疗策略主要是处理微血管并发症，包括玻璃体内药物治疗、激光光凝和玻璃体内注射抗VEGF药物，这些治疗方法均只能稳定和改善视力，或减少眼部不良反应，且抗VEGF药物价格昂贵，只能短时间消退病程中新生血管。因此，研究DR发生发展的相关机制可能为开发新的替代疗法提供新的切入点，对改善患者视力、减轻经济负担、提高患者生活质量具有重要意义。DR的发生与高血糖和血液中炎症细胞因子水平升高引起的持续代谢紊乱有关，长期高血糖会加重炎症反应，进而增加血管通透性引起新生血管病理改变，同时高血糖会增加基底膜厚度，引发视网膜缺氧，诱导VEGFA生成，加速DR进展^［12］。研究表明，高血糖引起的代谢异常可导致ROS（羟基自由基和超氧自由基等）的过量产生，ROS的积累可导致细胞内氧化应激，进而损伤视网膜血管及周围组织，最终导致DR^［13］。因此，氧化应激被认为是DR发病的关键因素之一。本研究采用H₂O₂诱导体外培养的视网膜内皮细胞，结果显示H₂O₂诱导后，细胞中ROS及炎症因子的含量显著升高，CAT的含量显著降低，细胞凋亡增加，表明视网膜内皮细胞氧化应激模型构建成功。这也进一步证实氧化应激和炎症反应在DR中的重要性。有研究结果提示miR-320的表达水平受到氧化应激的影响，Ke等^［14］研究发现，药物减轻细胞内氧化应激反应时伴随着miR-320表达升高。为此猜测miR-320可能在视网膜内皮细胞氧化应激损伤中可作为潜在靶点。本研究采用qRT-PCR检测也发现H₂O₂诱导细胞产生氧化应激时miR-320水平显著降低，与之前的猜想初步相符。氧化应激产生的ROS能够直接参与多种细胞的存活和死亡调控，增强抗氧化酶活力是抑制氧化应激的重要途径，CAT和SOD均可清除自由基，是机体重要的抗氧化酶^［15］。Shen等^［16］研究发现miR-320可在缺氧脑神经细胞中增加SOD、CAT含量，降低MDA和ROS含量。本研究结果也显示，在H₂O₂诱导的细胞中过表达miR-320，MDA及炎症因子含量降低，SOD和CAT含量升高，细胞凋亡减少。这提示，抑制氧化应激和炎症反应可能是miR-320参与DR调控的潜在途径。NKAP是激活NF-κB的核蛋白，大量研究证明，NF-κB信号通路能够介导多种细胞因子的表达在DR进展中发挥重要作用。HMGB1通过上调NF-κB参与DR^［17］；在DR发展过程中，TLR4/NF-κB通路上调，而夹竹桃苷治疗能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善大鼠DR^［18］。NKAP可受多种miRNA的调节，在多种疾病进程中发挥重要作用。miR-297通过靶向调控NKAP参与氧化铝纳米颗粒诱导的肺部炎症^［19］；miR-4766-5p通过靶向NKAP抑制胃癌细胞的增殖和转移^［20］，调节性T细胞通过外泌体miR-709作用于NKAP以减少脊髓损伤后的微胶质细胞焦亡并促进运动功能恢复^［21］。既往研究已经发现miR-320/VEGFA轴调节血管内皮细胞的增殖、凋亡和血管生成能力^［22］。然而，NKAP在DR中的作用尚未报道。本研究结果显示，miR-320可直接靶向结合NKAP并负调控其表达，且过表达NKAP可减弱miR-320对hRECs细胞氧化应激和炎症反应的抑制作用。下调NKAP可有效抑制NF-κB活性^［23］。因此推测，miR-320靶向NKAP调控氧化应激和炎症反应的潜在机制可能是间接抑制了NF-κB通路活性，具体机制还有待进一步探索。综上所述，本研究发现miR-320能够与NKAP靶向结合，并通过下调NKAP的表达抑制细胞的氧化应激反应，进而缓解DR的进程。miR-320的异常表达可能成为DR早期诊断的潜在生物标记物，这对预防和治疗DR，改善患者视力、提高患者生活质量具有重要意义。然而该研究并未在体内实验中进行验证，具有一定的局限性，同时虽然研究揭示了miR-320靶向NKAP调控氧化应激和炎症反应的潜在机制，但对于具体的分子作用路径和上下游信号通路的关联研究还不够深入全面，可能存在其他未知的关键因素和环节未被发现。基于上述不足，本课题组未来将构建DR动物模型，在整体水平上进一步验证miR-320/NKAP轴在DR进展中的作用及机制；同时，将更深入探究miR-320调控NKAP表达及其下游NF-κB信号通路的具体分子细节，并筛选可能参与此过程的其他关键分子，为DR的防治提供更全面的理论依据和潜在靶点。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2021D01C436)

新疆维吾尔自治区卫生健康委员会“天山英才”医药卫生高层次人才培养计划项目(TSYC202301B064)