紫檀芪对脑出血大鼠的脑神经保护作用及其机制

Neuroprotective effect of Pterostilbene against cerebral hemorrhage-induced injury in rats and its underlying mechanisms

摘要

目的 探讨紫檀芪对脑出血大鼠继发性脑损伤的神经保护作用及其机制。 方法 将60只雄性大鼠分为4组：假手术组、模型组、紫檀芪组、紫檀芪+血红素加氧酶-1抑制剂锌原卟啉组（抑制剂组）。紫檀芪组在造模后，使用紫檀芪30 mg/（kg·d），1次/d，连续腹腔注射3 d；抑制剂组分别于造模前30 min、造模后1 d腹腔注射紫檀芪抑制剂锌原卟啉（ZnPP）25 mg/（kg·d），其余步骤同紫檀芪组；脑出血模型组通过立体定向注射胶原酶至右侧大脑纹状体，假手术组不造模，两组均注射等量生理盐水至腹腔内，1次/d，连续3 d。然后分别观察4组大鼠HE染色脑组织病理改变、改良神经功能缺损评分（mNSS），采用干湿比重法测病灶侧脑组织含水量，TUNEL法测脑组织血肿区神经细胞凋亡情况，ELISA法分析血清炎症因子（IL-1β、IL-6），Western blotting法测脑组织NF-κB信号通路相关蛋白（p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα）的含量。 结果 与假手术组比较，模型组HE染色脑病变组织细胞结构紊乱、细胞间质大量炎性细胞，红细胞外漏，mNSS和脑组织含水量均增加（P<0.05），IL-6、IL-1β表达增加（P<0.05），p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量及细胞凋亡率均增加（P<0.05）。与模型组比较，紫檀芪组细胞排列趋于规整，炎性细胞与红细胞的浸润程度明显减少，水肿程度减轻，mNSS和脑组织含水量均下降（P<0.05），IL-6、IL-1β表达均下降（P<0.05），p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量及细胞凋亡率均下降（P<0.05）。与紫檀芪组比较，抑制剂组细胞疏松紊乱，炎性细胞多、红细胞浸润，水肿显著，mNSS和脑组织含水量均增加（P<0.05），IL-6、IL-1β表达均增加（P<0.05），p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量及细胞凋亡率均增加（P<0.05）。 结论 紫檀芪在脑出血大鼠继发性损伤中有明确的神经保护作用、抑制神经炎症反应，其机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。

Abstract

Objective To explore the neuroprotective effects of Pterostilbene（PTE） against secondary brain injury in rats with cerebral hemorrhage and its underlying mechanisms. Methods Sixty male rats were divided into four groups： sham group， model group， Pterostilbene group， and heme oxygenase 1 inhibitor group. The rats in Pterostilbene group were intraperitoneally injected with Pterostilbene at a dose of 30 mg/（kg·d） once a day for three consecutive days after modeling. The rats in inhibitor group were intraperitoneally injected with the heme oxygenase 1 inhibitor zinc protoporphyrin（ZnPP） at a dose of 25 mg/（kg·d） at 30 min before modeling and one day after modeling， and 30 mg/（kg·d） Pterostilbene once a day for three consecutive days after modeling. The cerebral hemorrhage model was established by stereotaxic injection of collagenase into the right striatum of the brain. The rats in sham group did not undergo modeling， and the rats in sham group and model group received equal volumes of physiological saline via intraperitoneal injection once a day for three consecutive days. Subsequently， pathological changes in brain tissue were observed in the four groups using HE staining， and the modified neurological severity score（mNSS） was assessed. The water content in the affected side of brain tissue was measured by the dry-wet weight method. Neuronal apoptosis in the hematoma area of brain tissue was assessed by TUNEL method， while the serum levels of inflammatory factors（IL-1β， IL-6） were analyzed using ELISA. Additionally， Western blotting was used to measure the expressions of NF-κB signaling pathway-related proteins（p-NF-κB p65， NF-κB p65， p-IκBα， IκBα） in brain tissue. Results Compared with sham group， the disordered cellular structures were observed in the HE-stained brain lesion tissues in model group， with a large number of inflammatory cells in the interstitium， and extracellular leakage of red blood cells. Compared with sham group， the mNSS and the percentage of water in the brain tissue increased in model group（P<0.05）， the expression levels of IL-6 and IL-1β were also elevated（P<0.05）， and the relative expression levels of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα/IκBα， and the rate of apoptosis increased（P<0.05）. Compared with model group， more orderly cellular arrangements were observed in the HE-stained brain tissue in Pterostilbene group， the infiltration of inflammatory cells and red blood cells significantly decreased， and the edema was reduced. Compared with model group， both the mNSS and the percentage of water in the brain tissue decreased in Pterostilbene group（P<0.05）， the expression levels of IL-6 and IL-1β were also reduced（P<0.05）， the relative expression levels of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα/IκBα， and the rate of apoptosis decreased（P<0.05）. Compared with Pterostilbene group， loose and disordered cells were presented in inhibitor group， with a high number of inflammatory cells， red blood cell infiltration， and significant edema. Compared with Pterostilbene group， both the mNSS and the percentage of water in the brain tissue increased in inhibitor group（P<0.05）， the expression levels of IL-6 and IL-1β were elevated （P<0.05）， the relative expression levels of p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα/IκBα， and the rate of apoptosis increased（P<0.05）. Conclusion Pterostilbene can protect against the secondary injury after cerebral hemorrhage in rats， and inhibit the neuroinflammatory responses， which may be related to the inhibition of the activation of NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

紫檀芪 / 脑出血 / 继发性脑损伤 / 炎症反应 / NF-κB信号通路 / 细胞凋亡

Key words

Pterostilbene / cerebral hemorrhage / secondary brain injury / inflammatory response / NF-κB signaling pathway / cell apoptosis

脑出血（intracerebral hemorrhage， ICH）是一种具有高发病率和死亡率的脑血管疾病，全球每年有超过300万患者发生脑出血，发病率约为24.68/100 000^［1］。因此脑出血对个人、家庭乃至社会都造成严重的经济负担。脑出血后的脑损伤机制通常包括原发性损伤和继发性损伤，前者是由出血本身引起的初始损伤，后者是与脑实质内血液激活的下游通路损伤相关。继发性损伤发生数天至数周，是炎症、铁和血液相关毒性以及氧化应激等损伤途径激活的结果^［2］。因此，探讨脑出血后继发性脑组织损伤的机制是一个十分重要的研究主题，研究显示，核因子NF-κB是一种关键的核转录因子，NF-κB在神经细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞中广泛表达；脑出血后脑组织中NF-κB蛋白表达和凋亡细胞数量增加，NF-κB表达与凋亡呈显著正相关，NF-κB活化可能促进脑出血后大鼠血肿周围水肿的脑细胞凋亡^［3，4］。紫檀芪（Pterostilbene）是白藜芦醇类似物，其生物利用度高达80%，并且更容易通过血脑屏障，紫檀芪具有调节炎症和氧化应激、抗细胞凋亡、修复神经元损伤和突触功能障碍的作用，其对中枢神经系统疾病的神经保护作用也在体外和体内研究中得到证实，显示出其作为治疗神经系统疾病的有效药物成分的潜力^［5，6］。目前紫檀芪对缺血性脑卒中研究较多，但对脑出血后继发性脑损伤的治疗作用及其机制研究较少，故本研究探究了紫檀芪对脑出血大鼠继发性脑损伤的神经保护作用及其机制，旨在为脑出血后药物治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料1.1.1

实验动物　健康雄性大鼠60只（8~10周龄，体质量250~300 g），大鼠饲养环境通风清洁，由西南医科大学实验动物研究中心提供，所有大鼠在恒温室内适应，每12 h光照黑暗循环持续1周，老鼠可以自由饮水和进食，本研究已获得西南医科大学伦理委员会的批准（swmu20250001）。

1.1.2 主要试剂

紫檀芪、血红素加氧酶-1抑制剂（ZnPP）均购自武汉阿拉丁生物有限公司；白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒、TUNEL试剂盒、P65抗体、p-P65抗体、IκBα抗体、p-IκBα抗体均购自武汉科鹿生物科技有限公司。

1.2 脑出血模型建立和分组

1.2.1 大鼠脑出血造模

所有大鼠恒温室中以12 h光照衔接12 h黑暗循环适应1周，用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，把大鼠置于立体脑定位仪中，消毒和切开后，在颅骨上钻一个直径为0.5 mm的孔，以便将针插入大鼠纹状体，在立体定向引导下将配于生理盐水溶液中的胶原酶0.6 U注入右侧纹状体内，针再停留5 min以防止回流，并在密封前缓慢取出^［7］。制作模型完成后，采用Longa评分，1~3分提示建模成功。

1.2.2 实验分组

60只SD大鼠采用随机数字表法分为：假手术组、脑出血模型组、紫檀芪组和抑制剂组，每组各15只。紫檀芪组脑出血模型成功后，腹腔注射紫檀芪30 mg/（kg·d），1次/d，连续3 d；抑制剂组大鼠则腹腔注射注入锌原卟啉（ZnPP）25 mg/（kg·d）^［8］，分别于造模前30 min、造模后1 d腹腔注射，其余步骤同紫檀芪组；脑出血模型组通过立体定向注射胶原酶至右侧大脑纹状体，假手术组不造模，仅钻孔后插入针头，然后两组均注射等量生理盐水至腹腔内，1次/d，连续3 d。各组大鼠评估神经功能损伤后处死，收集血清采用ELISA检测IL-1β、IL-6的浓度；另收集脑组织，采用干湿比重法检测脑组织含水量，TUNLE法检测神经细胞凋亡率，HE染色法观察脑组织病理形态，Western blotting检测NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。

1.3 神经功能损伤评估和脑组织含水量测定

采用改良神经功能缺损评分（mNSS）评估大鼠神经功能^［9］，满分为18分，分值与神经功能缺损的程度呈正比。mNSS评分后处死大鼠，取大鼠病灶侧脑组织称取湿重，然后将脑组织放入70 ℃恒温培养箱中连续干燥48 h后称取干重，按公式计算：脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。

1.4 TUNEL法检测大鼠脑组织神经细胞凋亡率

大鼠处死后取病灶侧血肿区组织，完成石蜡切片并进行脱蜡处理，直至切片完全脱蜡并回到水相，用组化笔在组织周围画圈，PBS溶液洗涤，取试剂盒中蛋白酶K，按1∶9用PBS稀释，PBS洗涤3次，每次5 min，室温孵育10 min，再洗涤3次，时间同上，取试剂盒内TdT酶、CF488-dUTP绿光反应液、EB平衡缓冲液，按1∶5∶50比例混合配制适量孵育液，避光37 ℃孵育1~1.5 h，再次用PBS洗涤，频次及时间同上，最后染核、孵育、洗涤、封片。使用显微镜200倍下进行拍照观察，对TUNEL阳性细胞计数并计算细胞凋亡率。公式如下：细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 HE染色观察大鼠脑组织病理变化

对大鼠病灶侧脑组织按照HE染色步骤进行脱蜡、染色、脱水、透明、封片，使用普通光学显微镜400倍下观察病变脑组织。

1.6 ELISA法检测大鼠血清炎症因子水平

采用灭菌EP管收集大鼠尾静脉血液样本后，室温放置1 h，待血液凝固后在4 ℃条件下离心10 min，收集血浆，通过市售的酶联免疫吸附测定试剂盒检测IL-1β、IL-6的浓度。

1.7 Western blotting法检测脑组织NF-κB信号通路相关蛋白的测定

取各组大鼠病灶侧脑血肿区周围组织，反复用PBS缓冲液漂洗2~3次，加入10~20倍组织蛋白提取试剂离心，期间用移液器反复吹打，再次离心后收集血浆，并通过BCA蛋白质测定试剂盒测量其浓度，SDS-PAGE进行电泳，再完成制胶与上样、转膜、抗体孵育、化学发光检测等操作，统一使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS29.0统计软件，计量资料以平均值±标准差（X±S）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫檀芪对脑出血大鼠改良神经功能缺损评分和脑组织含水量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠改良神经功能缺损评分和脑组织含水量均增加（P<0.05）；与模型组比较，紫檀芪组大鼠改良神经功能缺损评分和脑组织含水量均下降（P<0.05）；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠改良神经功能缺损评分和脑组织含水量均增加（P<0.05，见表1）。

2.2 各组大鼠脑组织病理切片HE染色结果

假手术组大鼠脑组织切片显示，细胞在整体结构上规整，细胞形态良好；模型组大鼠脑组织表现出明显的组织、细胞结构紊乱，细胞间质区域充斥着大量炎性细胞浸润，并可观察到红细胞外漏；与模型组比较，紫檀芪组大鼠的脑组织切片示组织结构较为完整，细胞排列趋于规整，炎性细胞与红细胞的浸润程度明显减少，水肿程度也有所缓解；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠脑组织镜下示，组织结构排列疏松且紊乱，细胞间隙扩大，伴有较多的炎性细胞及红细胞浸润，水肿现象较为显著（见图1）。

2.3 紫檀芪对脑出血大鼠血清炎症因子表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β表达均增加（P<0.05）；与模型组比较，紫檀芪组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β表达均下降（P<0.05）；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β表达均增加（P<0.05，见图2）。

2.4 紫檀芪对脑出血大鼠脑组织细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示：假手术组大鼠脑组织中未见明显凋亡细胞；模型组大鼠脑组织中凋亡细胞明显增多；与模型组相比，紫檀芪组大鼠脑组织中凋亡细胞明显减少；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠脑组织中凋亡细胞明显增多（见图3）。TUNEL染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中细胞凋亡率增加（P<0.05）；与模型组比较，紫檀芪组大鼠脑组织中细胞凋亡率下降（P<0.05）；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠脑组织中细胞凋亡率增加（P<0.05，见图3）。2.5　紫檀芪对脑出血大鼠脑组织NF-κB通路相关蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织的p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量均增加（P<0.05）；与模型组比较，紫檀芪组大鼠脑组织的p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量均下降（P<0.05）；与紫檀芪组比较，抑制剂组大鼠脑组织的p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα相对表达量均增加（P<0.05，见图4）。

3 讨论

脑出血作为一种严重的脑血管疾病，通常源于脑实质内小穿支动脉或小动脉的自发性破裂^{［10，11］}。当脑出血发生时，血液会渗入脑实质并形成脑血肿，进而对脑组织产生压迫，引发神经功能缺损^{［12，13］}。此外，除了原发性损伤引起的血肿占位效应外，后续的血肿降解过程及凝血级联反应也会对周围脑实质造成继发性损伤^{［14，15］}。紫檀芪是一种天然化合物，已得到广泛证实其具有多种生物学活性，包括抑制神经炎症反应、改善认知功能、保护心血管系统、抗肿瘤等作用，还可穿透血脑屏障发挥对神经功能的保护作用^［16-19］。本研究结果表明，紫檀芪组大鼠改良神经功能缺损评分和脑组织含水量降低，证明紫檀芪能够有效减轻大鼠脑出血后脑水肿以及改善神经功能损伤。

小胶质细胞作为中枢神经系统中最主要的先天免疫细胞，其在遭遇脑出血等病理刺激初期会被激活并主要分化为M1表型，处于M1表型的小胶质细胞会分泌包括白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在内的多种促炎细胞因子，同时还会释放出大量趋化因子和神经毒性因子，引起神经细胞功能障碍和死亡^{［20，21］}。研究证实，紫檀芪可能通过重塑线粒体动力学，抑制小胶质细胞活化，减轻脑出血后的神经炎症反应^{［22，23］}。本实验表明脑出血大鼠血清IL-6、IL-1β均明显升高，细胞间质区域充斥着大量炎性细胞浸润；而紫檀芪治疗后脑出血大鼠血清IL-6、IL-1β均降低，脑组织病理切片示炎性细胞浸润明显减少，表明紫檀芪能够减轻脑出血后神经炎症反应。

NF-κB作为重要的多向转录因子，可与抑制因子IκB结合，在调节神经炎症过程中发挥关键作用^［4］。动物实验和临床尸检表明，缺血性脑损伤后，现有的NF-κB从静息状态被激活，其mRNA和蛋白质表达水平增强^{［24，25］}。Liu等^［26］发现，在脑出血大鼠动物模型中，紫檀芪对NF-κB的活化具有抑制作用，包括IκB磷酸化、NF-κB p65向核的移位以及核NF-κB p65的表达，表明紫檀芪抑制NF-κB通路可能减少下游炎症介质的分泌，并抑制缺血区小胶质细胞的活化。研究表明脑出血后继发性损害与脑梗死机制类似，且NF-κB通路可能与脑出血后继发性损伤有关^［4，27］。另外，研究发现脑出血后小胶质细胞的激活机制复杂多样，可激活核因子κB（NF-κB）信号通路，进而触发小胶质细胞的活化^［28］；此外小胶质细胞通过HMGB 1/TLR-4/NF-κB和TNF-α/TNFR 1/NF-κB信号通路过度产生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，加重神经炎症的发展^［22］。在本研究中脑出血大鼠细胞凋亡率、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα蛋白相对表达均增加，而紫檀芪治疗后脑组织中NF-κB相关蛋白表达量（p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα）、细胞凋亡率、IL-6、IL-1β均减低，这表明紫檀芪在脑出血后可能通过抑制NF-κB信号通路激活、减轻神经炎症反应，从而减轻神经细胞凋亡、继发性脑损伤。

综上所述，紫檀芪能够减轻大鼠脑出血的继发性脑损伤，表现出保护神经功能作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关，从而减少炎性因子的释放、神经细胞凋亡，这表明紫檀芪可以作为脑出血治疗的潜在药物。未来的研究方向将进一步探讨是否存在其他上游或下游分子共同参与这一过程，并通过更深入的体内和体外实验来验证这一假设。

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基金资助

四川省医学会科研课题(2018HSD5-10)