全蝎软膏对皮肤烫伤创面愈合的疗效及其机制

Efficacy and its mechanism of Scorpion Ointment on the healing of scald wounds

摘要

目的 探讨全蝎软膏对深Ⅱ度烫伤模型大鼠皮肤创面愈合的潜在药效及作用机制。 方法 将SPF级6~8周龄SD雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、湿润烧伤膏组和全蝎软膏组，每组10只。采用加热砝码建立深Ⅱ度烫伤大鼠模型，造模成功后模型组给予2 mL生理盐水湿敷，全蝎软膏组外用涂抹全蝎软膏，湿润烧伤膏组外用涂抹湿润烧伤膏，均匀涂抹于烫伤创面厚度2 mm左右，2次/d，连续15 d，空白对照组只作脱毛处理，不造模。观察各组大鼠烫伤创面愈合情况，计算创面愈合率，HE染色和Masson染色观察烫伤皮肤组织病理形态学变化。用ELISA测定大鼠烫伤皮肤组织TNF-α、IL-1β、血管内皮生长因子（VEGF）的水平。 结果 与空白对照组比较，模型组创面愈合率明显降低（P<0.05），皮肤组织明显变薄及变性坏死，且伴有较多炎症细胞浸润，仅有少量结缔组织和新生血管，胶原纤维排列紊乱；烫伤皮肤组织TNF-α、IL-1β水平显著上升（P<0.05），VEGF水平明显降低（P<0.05）。与模型组比较，湿润烧伤膏组和全蝎软膏组烫伤创面面积明显缩小，创面愈合率明显升高（P<0.05），皮肤组织上皮细胞增生明显，形成较厚的新生表皮层，真皮层中可见大量成纤维细胞，结缔组织和新生血管均显著增多，胶原纤维排列整齐；烫伤皮肤组织TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.05），VEGF水平明显升高（P<0.05）。 结论 全蝎软膏通过抑制烫伤创面炎症反应，促进新血管生成来实现深Ⅱ度烫伤大鼠皮肤创面的愈合。

Abstract

Objective To investigate the potential therapeutic effects and underlying mechanism of Scorpion Ointment on the healing of deep second-degree scald wounds in a rat model. Methods SPF-grade 6-8-week-old male SD rats were randomly divided into four groups： blank control group， model group， Moist Burn Ointment group， and Scorpion Ointment group， with 10 rats in each group. A deep second-degree scald rat model was established using a heated weight. After successful modeling， the rats subjected to a 2 mL normal saline-soaked dressing in model group， and the rats were treated with topical application of Scorpion Ointment and Moist Burn Ointment in Scorpion Ointment group and Moist Burn Ointment group， respectively. The ointments were applied evenly to a thickness of about 2 mm on the scald wound surface， twice daily for 15 consecutive days. The rats in blank control group underwent only depilation without modeling. The healing of the scald wounds was observed in each group， and the wound healing rate was calculated. Histopathological changes in the scalded skin tissues were examined using HE staining and Masson staining. The levels of TNF-α， IL-1β， and vascular endothelial growth factor（VEGF） in the scalded skin tissues were measured using ELISA. Results Compared with blank control group， the wound healing rate was significantly decreased in model group（P<0.05）， the skin tissue was markedly thinned and necrotic， accompanied by numerous inflammatory cell infiltrations， only a small amount of connective tissue and neovascularization was observed， and the collagen fibers were disorganized. Compared with blank control group， the levels of TNF-α and IL-1β in the scalded skin tissues were significantly increased in model group（P<0.05）， while the level of VEGF was significantly decreased（P<0.05）. Compared with model group， the scald wound area was significantly reduced in Moist Burn Ointment group and Scorpion Ointment group， and the wound healing rate was significantly increased（P<0.05）； the epidermal cells of the skin tissue showed significant hyperplasia， forming a thicker layer of new epidermis， a large number of fibroblasts were observed in the dermis， and both connective tissue and neovascularization were significantly increased with well-organized collagen fibers； the levels of TNF-α and IL-1β in scalded skin tissue were significantly decreased（P<0.05）， while the level of VEGF was significantly increased（P<0.05）. Conclusion Scorpion Ointment can promote the healing of deep second-degree scald wounds in rats by inhibiting inflammatory responses and promoting neovascularization.

Graphical abstract

关键词

全蝎软膏 / 深Ⅱ度烫伤 / 创面愈合 / 炎症 / 血管新生 / 药效学

Key words

Scorpion Ointment / deep second-degree burn / wound healing / inflammation / angiogenesis / pharmacodynamics

烫伤是日常生活中最常见的意外性伤害，多是由于沸水、油、火、辐射或化学物质等接触导致的伤害，通常会造成皮肤表皮层的损伤或伤及深层组织，继而引发组织感染、溃烂，严重时会伤及内脏甚至危及生命^［1］。目前，烫伤治疗药物主要是局部抗生素、生物制剂和免疫调节剂，然而这些药物有明显副作用，长期使用会产生依赖性^［2］。因此，有必要寻求一种安全且有效的烫伤治疗方法。中医药治疗具有多靶点效应且不良反应少的优点，目前已成为治疗烫伤的研究热点之一^［3］。

全蝎软膏是黑龙江中医药大学第一附属医院特色院内制剂，经多年潜心研究、反复实践筛选研制，组成为全蝎、蜈蚣、冰片，主要功能是息风镇痉、攻毒散结、通络止痛，具有透皮、镇痛、抑菌、抗炎和组织修复等多种药理作用，在治疗蚊虫叮咬、皮炎溃疡、渗出性炎症等皮肤损伤类疾病取得了良好的治疗效果^［4］。截至目前，尚无全蝎软膏治疗烫伤的相关报道，基于全蝎软膏的药理作用及临床应用，推测其可能对烫伤具有较好的治疗效果。因此，本研究以深Ⅱ度烫伤模型大鼠为实验对象评估全蝎软膏对皮肤烫伤创面的愈合作用，并从抑制炎症反应和促进新血管生成两方面探讨全蝎软膏对烫伤皮肤组织的可能机制，为该药的后期研发和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

全蝎软膏（批准文号：黑药制字Z20110137）由黑龙江中医药大学附属第一医院提供，规格18 g/支；湿润烧伤膏（汕头市美宝制药公司，批号为Z20000004）；玛贝拉脱毛膏、4%多聚甲醛固定液、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），血管内皮生长因子（VEGF）ELISA试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）。

1.2 实验动物

SPF级6~8周龄SD雄性大鼠43只，体质量180~220 g。由黑龙江中医药大学安全与药物评价中心提供，动物合格证号为SYXK（黑）2022-001。

1.3 大鼠皮肤刺激实验

随机选取3只大鼠背部脱毛处理，将全蝎软膏连续3 d，2次/d，均匀涂抹于每只大鼠背部脱毛的皮肤。最后一次给药后1 h，用棉花和生理盐水清洗每只大鼠的背部皮肤，并观察给药后的任何体征、症状和皮肤变化（发红、水肿、渗出物）。

1.4 烫伤大鼠模型的制备

所有大鼠适应性喂养1周，自然昼夜采光，室温（22±2）℃，相对湿度40%~60%。造模前24 h，用电动剃毛器去除大鼠背部、腹部、腿部大部分毛发，再用脱毛膏脱去残余毛茬，等待8~10 min，用棉球蘸取清水清洗皮肤并擦干水渍。造模前12 h，大鼠禁食不禁水。造模时，腹腔注射3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，将50 g砝码放入锅内水中加热，煮沸10 min，夹出砝码，擦干，迅速放置于大鼠背部皮肤上并轻微施加压力，持续10 s即可建立深Ⅱ度烫伤模型，用同样方法制备大鼠腹部、腿部皮肤烫伤。大鼠烫伤部位皮肤发白，且次日可见烫伤区域皮肤硬化、结痂，表明造模成功^［5］。造模结束后，腹腔注射5 mL生理盐水抗休克干预。

1.5 分组给药和标本采集

将40只SD大鼠随机分成4组：空白对照组、模型组、全蝎软膏组、湿润烧伤膏组，每组10只。空白对照组只作脱毛处理，不作任何处理。各给药组大鼠每次给药前，用生理盐水清洗伤口，除去残留物质，然后分别给予相应软膏外用涂抹，每次药物用量为均匀涂抹于大鼠烫伤创面且厚度为2 mm左右，模型组大鼠给予2 mL生理盐水湿敷，2次/d，连续15 d。每天给药前定期记录各组大鼠体质量的变化。末次给药后次日，采用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，每组随机选取6只大鼠的烫伤皮肤组织，用PBS清洗干净，滤纸擦干，-80 ℃保存，用于ELISA检测；其余4只大鼠的烫伤皮肤组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于病理组织学观察。

1.6 大鼠烫伤创面愈合情况观察及愈合率计算

实验过程中，模型大鼠每天给药前用生理盐水清洗创面处，观察并拍照记录各组大鼠烫伤创面的愈合情况，包括颜色、分泌物和软硬程度，周围皮肤组织是否有红肿渗出等感染表现。每日观察并记录大鼠的精神状态、活动程度，进食饮水及体质量变化。在造模术后第1，5，10，15天对大鼠的创面拍照，拍照过程中保证拍摄角度与创面平行、相机焦距相同，用Image J图像处理软件统计大鼠的创面愈合面积，计算创面愈合率；创面愈合率=（初始创面面积－给药后创面面积）/初始创面面积×100%。初始创面面积为烫伤24 h的面积，即造模后第1天的面积^［6］。

1.7 HE染色和Masson染色观察大鼠烫伤皮肤组织病理形态学变化

取大鼠经固定后的皮肤组织，脱水、石蜡包埋，制成4~6 μm厚度的切片，经二甲苯脱蜡处理后，一部分进行HE染色，另一部分进行Masson染色，干燥后用中性树脂进行封片处理，采用显微镜观察并拍照记录大鼠烫伤皮肤组织的病理形态学变化。

1.8 ELISA检测大鼠烫伤皮肤组织相关因子水平

取各组大鼠放于-80 ℃冰箱保存的皮肤组织，液氮研磨后加裂解液充分裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min取上清，采用ELISA法检测烫伤皮肤组织中TNF-α、IL-1β、VEGF水平，按1∶100稀释浓缩的检测抗体，在450 nm波长测定吸光度值，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.9 统计学分析

采用SPSS 27.0软件对数据进行统计分析。计量数据均以X±S表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠皮肤刺激实验结果

与空白对照相比，将全蝎软膏涂抹大鼠脱毛处皮肤3 d后，皮肤在刺激、肿胀、渗出液、炎症和发红等方面均未观察到显著差异。表明全蝎软膏对皮肤具有良好的安全性。

2.2 不同组别大鼠体质量变化

造模后第1天，各组大鼠体质量有所降低，其他给药时间点模型组、全蝎软膏组、湿润烧伤膏组与空白对照组之间的体质量差异并不明显，表明药物对大鼠的体质量影响较小。

2.3 全蝎软膏对大鼠烫伤创面愈合程度的影响

给药第1，5天，模型组大鼠烫伤创面干燥，质硬，呈灰白色或黄褐色，周围组织水肿；湿润烧伤膏组和全蝎软膏组大鼠的创面均比较湿润、柔软，呈黄棕色，且有结痂出现。给药第10天，与模型组相比，各给药组大鼠的创面面积均明显缩小，少量痂皮脱落；给药第15天，与模型组相比，各给药组大鼠创面已极大程度愈合，痂皮部分已经脱落（见图1）。另外，与空白对照组相比，模型组大鼠各部位烫伤创面愈合率明显降低（P<0.05）；与模型组相比，各给药组大鼠各部位烫伤创面愈合率均显著升高（P<0.05），其中腹部相对恢复更快，其次为背部，最后为腿部（见图2）。

2.4 全蝎软膏对大鼠烫伤创面组织病理形态学的影响

经HE染色，细胞核染成蓝色，细胞质染成红色。结果示，空白对照组大鼠皮肤组织结构完整，表皮层较薄，毛囊和皮脂腺分布均匀，真皮层和附属结构清晰，细胞质染色均匀，组织结构未出现病理性破坏；模型组大鼠的皮肤组织明显变薄，表皮坏死，毛囊和皮脂腺结构模糊，细胞核溶解或完全消失，真皮层较多纤维组织发生变性坏死，且伴有大量炎性细胞浸润，仅有少量结缔组织与新生血管；湿润烧伤膏组及全蝎软膏组大鼠的皮肤组织可见上皮细胞增生明显，形成较厚的新生表皮层，真皮层中结缔组织、新生血管均明显增多，炎症细胞浸润明显减少（见图3）。

2.5 全蝎软膏对大鼠烫伤创面组织中胶原纤维含量的影响

经Masson染色，胶原纤维染成蓝色，肌纤维染成红色，结果显示，空白对照组真皮层内胶原纤维交错排列，较致密；与空白对照组比较，模型组胶原纤维排列较为紊乱；湿润烧伤膏组和全蝎软膏组可见大量成纤维细胞和胶原纤维，排列较为整齐（见图4）。与空白对照组比较，模型组大鼠创面处的胶原纤维含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，湿润烧伤膏组和全蝎软膏组大鼠创面组织的胶原纤维含量明显升高（P<0.05，见图5）。

2.6 全蝎软膏对大鼠烫伤创面组织中相关因子水平的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠烫伤皮肤组织中VEGF水平显著降低（P<0.05），TNF-α、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）；与模型组相比，湿润烧伤膏组和全蝎软膏组大鼠烫伤皮肤组织中VEGF水平均显著升高（P<0.05），TNF-α、IL-1β水平均显著降低（P<0.05，见图6）。

3 讨论

烫伤是最常见的创伤之一，常给患者带来剧烈疼痛和身体损伤，严重时会继发感染甚至危及生命。目前临床上针对烫伤的治疗药物和方法种类繁多但疗效各异，且可能存在副作用，因此研发更有效的治疗药物具有重要的临床意义。全蝎软膏作为传统中药制剂，具有独特的药理作用，广泛应用于皮损类疾病，其中全蝎和蜈蚣是全蝎软膏中的主要成分，现代药理研究表明具有镇痛、抗菌、抗炎、抗凝等作用^［7］。冰片是全蝎软膏中的另外一个重要成分，具有清热解毒、消肿止痛、抑菌、促进药物透皮吸收等药理作用，是治疗烧烫伤疾病的潜在用药^［8］。因此，本课题组推测该药用于烫伤疾病可能也有相同的疗效。本研究选取SD大鼠为实验对象建立深Ⅱ度烫伤模型，给予全蝎软膏外用涂抹连续用药处理，结果表明全蝎软膏可有效缩短烫伤创面愈合时间，加速创面愈合，证实其对烫伤创面愈合有显著效果，为临床治疗提供更多选择，丰富中医外治法在烫伤领域的应用。

创面愈合是一个动态的、有序的、复杂的过程，主要包括4个时期，即止血期、炎症期、增殖期和重塑期^［9］。烫伤后，受损创口表面产生大量的伤口渗出液和坏死组织，坏死组织产生的高水平炎性细胞因子影响细胞迁移并延迟伤口愈合^［10］。炎症是创面愈合的必要阶段，炎症反应的启动标志着创面愈合的开始，过度或持续的炎症反应可能继发感染，使创面难以愈合^［11］。因此，调节炎症反应对加速创面愈合过程具有重要意义。TNF-α是在伤口愈合过程中，由造血细胞释放的最重要的促炎细胞因子^［12］，IL-1β也是重要的促炎细胞因子，抑制其表达可以实现抗炎作用，加速伤口愈合^［13］。本研究考察药物对炎症反应的调控作用并观察创面愈合的宏观与微观指标，结果可见全蝎软膏可显著抑制烫伤皮肤组织中炎症细胞的过度增殖，改善炎症细胞浸润，大鼠烫伤创面组织中TNF-α、IL-1β水平较模型组均明显下降。综上，全蝎软膏可通过抑制炎症细胞因子的表达，改善炎症反应来发挥促进创面愈合的作用。

血管新生是创面愈合过程中的重要阶段，为伤口提供所需营养物质和氧气，促进细胞增殖和组织修复，并且是伤口愈合增殖期的关键表现^［14］。研究显示烫伤后组织出现微循环障碍，创面出现缺血、缺氧，从而激活血管新生，新生血管既可以重建血运，又能帮助免疫细胞转移交换，抑制感染，进而促进创面愈合^［15］。其中VEGF作为血管生成过程中所需的主要生长因子，对再生组织提供充分营养，以此促进血管形成^［12］。本研究发现全蝎软膏可明显促进组织中上皮细胞、成纤维细胞和结缔组织的增殖，加速新生血管的生成，大鼠烫伤创面组织中VEGF的表达量较模型组显著升高。由此可见，全蝎软膏可通过促进烫伤皮肤组织中新生血管的生成，激活血管新生相关的生长因子来加速创面的愈合。

然而，本研究仍存在某些局限性，一是全蝎软膏为复方中药制剂，组方后发挥促进血管生成及抗炎作用的具体活性成分尚未完全明确；二是缺乏广泛临床试验研究，动物实验不能完全代表在人类临床应用中的情况。因此，在后续研究中，探索该药的具体活性成分，明确其关键的作用靶点和分子通路，为进一步的药物研发和优化提供理论基础；进行多中心、大样本的临床试验，以验证全蝎软膏在人类烫伤创面治疗中的疗效和安全性，观察其在不同烫伤程度、不同年龄、不同身体部位等情况下的应用效果，为临床合理使用提供参考。

综上所述，全蝎软膏可有效促进烫伤创面的愈合，明显缩短烫伤创面愈合时间，提高创面愈合率，其作用机制可能是通过抑制炎症反应，加速血管生成实现伤口修复，并证实了全蝎软膏对不同部位皮肤组织均可起到不同程度的愈合作用，这可能与皮肤组织部位、个体差异有关，且患处无瘢痕形成。这也进一步佐证全蝎软膏作为一种副作用小、安全性好的中药制剂，在临床上具有良好的应用前景。

参考文献

[1] Jeschke MG， van Baar ME， Choudhry MA， et al. Burn injury［J］. Nat Rev Dis Primers， 2020，6（1）：11.

[2] Yu Q， Shen Y， Xiao F， et al. Yuhong ointment ameliorates inflammatory responses and wound healing in scalded mice［J］. J Ethnopharmacol， 2023，306：116118.

[3] Lin LX， Wang P， Wang YT， et al. Aloe vera and Vitis vinifera improve wound healing in an in vivo rat burn wound model［J］. Mol Med Rep， 2016，13（2）：1070-1076.

[4] 朱雅楠， 杨素清， 崔晓倩， 等. 全蝎软膏的药理作用及临床应用研究进展［J］. 中医药学报， 2023，51（6）：99-104.

[5] 刘娇， 梁潇， 胡涛， 等. 栀续烫伤膏对深Ⅱ度烧伤模型大鼠皮肤的修复作用及机制［J］. 中国药房， 2023，34（11）：1320-1325.

[6] 谢曈，张培华，林珈好. 复方黄龙软膏促急性软组织损伤及烫伤修复的药效研究［J］. 农业生物技术学报， 2024，32（1）： 234-246.

[7] 刘影哲， 刘冰冰， 张洋， 等. 常用虫类药治疗糖尿病的研究［J］. 中国中医基础医学杂志， 2022，28（11）：1901-1907.

[8] Huang L， Liu Y， Sang X， et al. Preparation of Alum⁃borneol⁃PVP drug⁃loaded fibers by electrospinning［J］. Chem Res Chin Univ， 2021， 37： 411-418.

[9] Lv X， Li H， Chen Y， et al. Crocin⁃1 laden thermosensitive chitosan⁃based hydrogel with smart anti⁃inflammatory performance for severe full⁃thickness burn wound therapeutics［J］. Carbohydr Polym， 2024， 345： 122603.

[10] Xu X， Che L， Xu L， et al. Green preparation of anti⁃inflammation an injectable 3D porous hydrogel for speeding up deep second⁃degree scald wound healing［J］. RSC Adv， 2020， 10（59）：36101-36110.

[11] Peña OA， Martin P. Cellular and molecular mechanisms of skin wound healing［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2024，25（8）： 599-616.

[12] Ebrahiminaseri A， Sadeghizadeh M， Moshaii A， et al. Combination treatment of dendrosomal nanocurcumin and low⁃level laser therapy develops proliferation and migration of mouse embryonic fibroblasts and alter TGF⁃β， VEGF， TNF⁃α and IL⁃6 expressions involved in wound healing process［J］. PLoS One， 2021， 16（5）：e0247098.

[13] Gao T， Zhao Y， Zhao Y， et al. Curative effect and mechanisms of radix arnebiae oil on burn wound healing in rats［J］. Planta Med， 2023，89（7）：709-717.

[14] Shi Z， Yao C， Shui Y， et al. Research progress on the mechanism of angiogenesis in wound repair and regeneration［J］. Front Physiol， 2023，14：1284981.

[15] Scopelliti F， Cattani C， Dimartino V， et al. Platelet lysate promotes the expansion of T regulatory cells that favours in vitro wound healing by increasing keratinocyte migration and fibroblast production of extracellular matrix components［J］. Eur J Dermatol， 2020，30（1）：3-11.

基金资助

国家自然科学基金项目(81603418)

国家自然科学基金项目(82074271)

黑龙江省优秀青年人才项目(2020YQ05)

黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(2024yjscx124)