降钙素受体样受体对子痫前期胎盘滋养细胞增殖和侵袭的影响

Effect of calcitonin receptor-like receptor on proliferation and invasion of placental trophoblastic cells in preeclampsia

摘要

目的 探究降钙素受体样受体（CRLR）对子痫前期胎盘滋养细胞增殖和侵袭的影响。 方法 将人绒毛膜滋养层细胞（HTR-8/SVneo细胞）分为NC组、H/R组、H/R+NC-oe组、H/R+CRLR-oe组、H/R+NC-sh组和H/R+CRLR-sh组。NC组HTR-8/SVneo细胞进行48 h的常规培养，其他组除H/R组外，HTR-8/SVneo细胞经qRT-PCR和Western blot验证转染效率后进行48 h缺氧/复氧（H/R）处理。采用CCK-8法检测细胞相对活力，EdU染色检测细胞EdU阳性率，TUNEL染色检测细胞凋亡率（TUNEL阳性率），Transwell法检测细胞侵袭数量。DCFH-DA法测量细胞中ROS浓度，TBA法检测MDA含量，WST-8法检测SOD活性，采用DTNB法检测GSH-Px活性。采用qRT-PCR检测CRLR mRNA水平，采用Western blot检测CRLR、凋亡相关蛋白（Bcl-2、cleaved Caspase-3）、抗凋亡通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt）、侵袭相关蛋白（MMP2和MMP9）表达水平。 结果 与NC组相比，H/R组相对细胞活力、EdU阳性率和侵袭细胞数量降低（P<0.05），TUNEL阳性率升高（P<0.05）；Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白水平降低（P<0.05），cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）；ROS相对荧光强度和MDA水平升高（P<0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P<0.05）；PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平降低（P<0.05）。与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组细胞相对活力、EdU阳性率和侵袭细胞数量升高（P<0.05），TUNEL阳性率降低（P<0.05）；Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白水平升高（P<0.05），cleaved Caspase-3蛋白水平降低（P<0.05）；ROS相对荧光强度和MDA水平降低（P<0.05），SOD和GSH-Px水平升高（P<0.05）；PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平升高（P<0.05）。与H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组细胞相对活力、EdU阳性率和侵袭细胞数量降低（P<0.05），TUNEL阳性率升高（P<0.05）；Bcl-2、MMP2和MMP9蛋白水平降低（P<0.05），cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）；ROS相对荧光强度和MDA水平升高（P<0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P<0.05）；PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平降低（P<0.05）。 结论 上调CRLR可促进子痫前期细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，其机制与激活PI3K/Akt信号通路有关。

Abstract

Objective To explore the effect of calcitonin receptor-like receptor（CRLR） on proliferation and invasion of placental trophoblastic cells in preeclampsia. Methods Human chorionic trophoblast cells（HTR-8/SVneo cells） were divided into NC group， H/R group， H/R+NC-oe group， H/R+CRLR-oe group， H/R+NC-sh group and H/R+CRLR-sh group. HTR-8/SVneo cells in NC group were routinely cultured for 48 h. After verifying transfection efficiency by qRT-PCR and Western blot， HTR-8/SVneo cells in H/R+NC-oe group， H/R+CRLR-oe group， H/R+NC-sh group and H/R+CRLR-sh group were treated with hypoxia/reoxygenation（H/R） for 48 h. The relative cell viability was detected by CCK-8 method， the EdU positive rate of cells was detected by EdU staining， the apoptosis rate（TUNEL positive rate） was detected by TUNEL staining， and the number of cell invasion was detected by Transwell method. Intracellular reactive oxygen species（ROS） concentration was measured using DCFH-DA， malondialdehyde（MDA） content was detected by the thiobarbituric acid（TBA） method， superoxide dismutase（SOD） activity was assayed by WST-8 method， and glutathione peroxidase（GSH-Px） activity was determined by DTNB method. CRLR mRNA level was analyzed by qRT-PCR， and the protein expressions of CRLR， apoptosis-related proteins（Bcl-2， cleaved Caspase-3）， anti-apoptotic pathway proteins（p-PI3K， PI3K， p-Akt， Akt）， and invasion-related proteins（MMP2 and MMP9） were detected by Western blot. Results Compared with NC group， the relative cell viability， EdU positive rate and the number of invasion cells were decreased in H/R group（P<0.05）， the TUNEL positive rate was increased（P<0.05）， the protein expressions of Bcl-2， MMP2 and MMP9 were decreased while cleaved Caspase-3 protein level was increased（all P<0.05）， the relative fluorescence intensity of ROS and MDA level were increased（P<0.05）， SOD and GSH-Px levels were decreased（P<0.05）， and the relative phosphorylation levels of PI3K and Akt proteins were decreased（P<0.05）. Compared with H/R+NC-oe group， the relative cell viability， EdU positive rate and the number of invasion cells were increased in H/R+CRLR-oe group（P<0.05）， the TUNEL positive rate was decreased（P<0.05）， the protein levels of Bcl-2， MMP2 and MMP9 were increased while cleaved Caspase-3 protein level was decreased（all P<0.05）， the relative fluorescence intensity of ROS and MDA level were decreased（P<0.05）， SOD and GSH-Px levels were increased（P<0.05）， and the relative phosphorylation levels of PI3K and Akt proteins were increased（P<0.05）. Compared with H/R+NC-sh group， the relative cell viability， EdU positive rate and the number of invasion cells were decreased in H/R+CRLR-sh group（P<0.05）， the TUNEL positive rate was increased（P<0.05）， the protein levels of Bcl-2， MMP2 and MMP9 were decreased while cleaved Caspase-3 protein level was increased（all P<0.05）， the relative fluorescence intensity of ROS and MDA level were increased（P<0.05）， SOD and GSH-Px levels were decreased（P<0.05）， and the relative levels of PI3K and Akt protein phosphorylation were decreased（P<0.05）. Conclusion Upregulation of CRLR can promote the proliferation and invasion of preeclampsia cells， and inhibit the cell apoptosis， which is related to the activation of the PI3K/Akt signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

降钙素受体样受体 / 子痫前期 / 胎盘滋养细胞 / 增殖 / 侵袭 / 凋亡 / 磷脂酰肌醇3激酶 / 蛋白激酶B

Key words

calcitonin receptor-like receptor / preeclampsia / placental trophoblast / proliferation / invasion / apoptosis / phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K） / protein kinase B

子痫前期（preeclampsia，PE）是妊娠期的主要高血压疾病之一，影响全球2%~8%的妊娠妇女，可能导致一系列严重的并发症，例如肺水肿、器官损伤和难治性高血压，从而导致胎儿和孕妇死亡。妊娠早期滋养细胞的增殖和侵袭对螺旋动脉重塑至关重要，如果滋养细胞增殖和侵袭能力不足，螺旋动脉重塑就会受损，导致胎盘浅着床，从而引起PE^［1］。先前的研究表明，细胞凋亡和氧化应激是PE螺旋动脉重塑受损的重要因素^［2］，针对细胞凋亡和氧化应激可以缓解PE的发展^［3］。PE的发生发展与遗传因素有关，一项对严重PE患者胎盘组织基因表达谱子集进行的加权基因共表达网络分析结果显示，G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR）失调可能在重度PE中发挥作用，其中，降钙素受体样受体（calcitonin receptor-like receptor，CRLR）是一种GPCR，严重PE患者的胎盘组织CRLR表达上调^［4］。CRLR介导胎盘内皮和血管平滑肌的血管舒张^［5］，CRLR也是肾上腺髓质素信号系统的组成部分，该系统调节血管扩张、血管通透性，抑制内皮细胞凋亡和促进血管生成，并且肾上腺髓质素信号在PE病理生理学中起重要作用^［6］。据报道，在氯化钴诱导的人骨肉瘤SOSP-F5M2细胞缺氧微环境下，CRLR的表达增加，CRLR通过与肾上腺髓质素相互作用来抑制缺氧诱导的细胞凋亡^［7］。由于胎盘缺氧是PE进展中的重要病理因素，故推测PE中CRLR的表达升高可能与胎盘缺氧、氧化应激和细胞凋亡有关。本研究通过探讨CRLR对人绒毛膜滋养层细胞系（HTR-8/SVneo）细胞增殖和侵袭的影响和机制，旨在揭示CRLR在PE发生发展中的作用，为PE的诊治提供候选靶标基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司。慢病毒购自苏州吉玛基因公司。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司。CCK-8试剂盒、EdU染色液、TUNEL染色液购自北京索宝科技有限公司。Transwell购自美国Corning公司。活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。EntiLink 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自武汉博欧特生物科技有限公司。SYBR PreMix Ex Taq Ⅱ购自日本Takara公司。抗体购自英国Abcam公司。

1.1.2 实验仪器

BCI-40T三气培养箱购自上海博奥思生物技术有限公司。SpectraMax iD3多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司。IX71荧光显微镜购自日本Olympus公司。CFX96实时PCR检测系统购自美国Bio-Rad公司。

1.1.3 实验细胞

人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/SVneo细胞购自美国ATCC，将HTR-8/SVneo细胞培养于含10% FBS和1%双抗的RPMI 1640培养基中，培养条件为37 ℃、5%CO₂、95%湿度。

1.2 方法

1.2.1 分组及处理

将HTR-8/SVneo细胞分为对照组、过表达慢病毒阴性对照（NC-oe）组、CRLR过表达慢病毒（CRLR-oe）组、shRNA慢病毒阴性对照（NC-sh）组和CRLR shRNA慢病毒（CRLR-sh）组，每组设置6个复孔。对照组细胞不进行转染处理，其他组采用RPMI 1640培养液稀释Lipofectamine 3000和NC-oe、CRLR-oe、NC-sh和CRLR-sh慢病毒，待HTR-8/SVneo细胞培养至80%汇合后，将稀释后的Lipofectamine 3000分别与慢病毒混合，并加入HTR-8/SVneo细胞中，室温孵育48 h。采用qRT-PCR和Western blot验证转染效率。

将HTR-8/SVneo细胞分为阴性对照（NC）组、缺氧/复氧（H/R）组、H/R+NC-oe组、H/R+CRLR-oe组、H/R+NC-sh组和H/R+CRLR-sh组，每组设置6个复孔。NC组HTR-8/SVneo细胞进行48 h的常规培养；其他组除H/R组外HTR-8/SVneo细胞经转染及效率验证后进行H/R处理。H/R处理方法：按照参考文献［8］方法，在三气培养箱中先缺氧培养（5%CO₂、2%O₂、93%N₂）8 h，再常规培养（5%CO₂、20%O₂、75%N₂）16 h，共进行2个循环，总时长48 h。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖

将100 μL HTR-8/SVneo细胞（1×10⁴个/mL）接种到96孔板中，然后进行H/R处理，48 h后加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h，去除上清，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度，其吸光度与活细胞数量正相关。相对细胞活力（OD值）代表检测时间点的存活细胞总数。

1.2.3 EdU染色检测细胞增殖

将100 μL HTR-8/SVneo细胞（1×10⁴个/mL）接种到96孔板中，然后进行H/R处理，48 h后，加入100 μL 50 μmol/L EdU孵育2 h，弃培养基。PBS清洗，加入50 μL 4%多聚甲醛孵育30 min，弃固定液。加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，弃甘氨酸溶液。加入100 μL PBS孵育5 min，弃PBS。加入100 μL 0.5%TritonX-100渗透剂孵育10 min，弃渗透剂，PBS清洗。加入100 μL 1×Apollo染色液孵育30 min，弃染色液。加入100 μL 0.5% TritonX-100渗透剂孵育10 min，弃渗透剂。加入100 μL 1×Hoechst 33342孵育30 min，弃染色液，PBS清洗。抗荧光淬灭封片剂封片后在荧光显微镜下观察EdU阳性细胞的比例。

1.2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡

H/R处理48 h后，收集5×10⁶个细胞，离心，PBS清洗。4%多聚甲醛4 ℃固定30 min。离心收集细胞，PBS清洗，再加入0.2% Triton X-100室温通透20 min。离心收集细胞，PBS清洗，加入50 μL TUNEL反应液孵育30 min。离心后弃TUNEL反应液，0.1% Triton X-100清洗。加入100 μL 5 μg/mL的DAPI染液孵育5 min，加入400 μL PBS，涂片后在荧光显微镜下观察并统计TUNEL阳性率，作为细胞凋亡的观测指标。

1.2.5 Transwell检测细胞侵袭

H/R处理48 h后，将各组细胞饥饿培养12 h，制备无FBS细胞悬液。取200 μL HTR-8/SVneo细胞（5×10⁴个/mL）添加到Matrigel包被的Transwell上室，取800 μL含10%FBS的培养基添加到下室。孵育48 h后擦掉小室底部未侵袭的细胞，采用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色10 min，在显微镜下随机选取5个视野计数侵袭细胞。

1.2.6 氧化应激指标检测

H/R处理48 h后，按照试剂盒说明书，使用DCFH-DA测量细胞中的ROS浓度，并在荧光显微镜下观察细胞，使用ImageJ软件计算平均荧光强度。使用TBA法检测MDA含量，使用WST-8法检测SOD活性，使用DTNB法检测GSH-Px活性。

1.2.7 qRT-PCR检测CRLR基因表达水平

使用TRIzol试剂提取各处理组HTR-8/SVneo细胞总RNA。使用EntiLink 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，使用SYBR PreMix Ex Taq II在PCR系统上进行PCR。PCR条件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40次循环。CRLR引物序列，上游：5′-ATGGAGAAAAAGTGTACCCT-3′，下游：5′-CATGTTCTGTTGCTTGCTGG-3′；GAPDH（内参），上游：5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'，下游：5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3'。采用2^-ΔΔCt 法计算基因相对表达量。

1.2.8 Western blot检测CRLR、凋亡相关蛋白、抗凋亡通路蛋白和侵袭相关蛋白表达水平

使用RIPA缓冲液裂解各处理组HTR-8/SVneo细胞并提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。等浓度的蛋白上样，采用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，然后将膜与CRLR（1∶1 000）、凋亡相关蛋白［Bcl-2（1∶1 000）、cleaved Caspase-3（1∶1 000）］、抗凋亡通路蛋白［磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）（1∶2 000）、p-PI3K（1∶1 000）、蛋白激酶B（Akt）（1∶2 000）、p-Akt（1∶1 000）］、侵袭相关蛋白［基质金属蛋白酶（MMP）2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）］和GAPDH（内参，1∶1 000）一抗于4 ℃孵育过夜，然后与HRP偶联的二抗（1∶1 000）室温孵育1 h。ECL显影，采用Image J软件分析灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0软件分析数据，所有数据均符合正态分布，计量数据表示为均数±标准差（X±S），采用单因素方差分析及Tukey事后检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HTR-8/SVneo细胞转染效率验证

与对照组和NC-oe组相比，CRLR-oe组CRLR mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）；与对照组和NC-sh组相比，CRLR-sh组CRLR mRNA和蛋白水平降低（P<0.05，见图1）。

2.2 CRLR对H/R处理的HTR-8/SVneo细胞增殖的影响

与NC组相比，H/R组CRLR mRNA和蛋白水平升高（P<0.05，见图2），相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05，见图3）；与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组CRLR mRNA和蛋白水平升高（P<0.05，见图2），相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05，见图3）；与H/R组和H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组CRLR mRNA和蛋白水平降低（P<0.05，见图2），相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05，见图3）。

2.3 CRLR对H/R处理的HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

与NC组相比，H/R组TUNEL阳性率和cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05）；与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组TUNEL阳性率和cleaved Caspase-3蛋白水平降低（P<0.05），Bcl-2蛋白水平升高（P<0.05）；与H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组TUNEL阳性率和cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白水平降低（P<0.05，见图4）。

2.4 CRLR对H/R处理的HTR-8/SVneo细胞侵袭的影响

与NC组相比，H/R组侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白水平降低（P<0.05）；与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白水平升高（P<0.05）；与H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组侵袭细胞数量、MMP2和MMP9蛋白水平降低（P<0.05，见图5）。

2.5 CRLR对H/R处理的HTR-8/SVneo细胞氧化应激的影响

与NC组相比，H/R组ROS相对荧光强度和MDA水平升高（P<0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P<0.05）；与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组ROS相对荧光强度和MDA水平降低（P<0.05），SOD和GSH-Px水平升高（P<0.05）；与H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组ROS相对荧光强度和MDA水平升高（P<0.05），SOD和GSH-Px水平降低（P<0.05，见表1和图6）。

2.6 CRLR对H/R处理的HTR-8/SVneo细胞中PI3K/Akt信号通路的影响

与NC组相比，H/R组PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平降低（P<0.05）；与H/R+NC-oe组相比，H/R+CRLR-oe组PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平升高（P<0.05）；

与H/R+NC-sh组相比，H/R+CRLR-sh组PI3K和Akt蛋白磷酸化相对水平降低（P<0.05，见图7）。

3 讨论

PE是妊娠期特有的多系统功能障碍疾病，胎盘滋养细胞功能障碍是导致PE的主要原因，主要是因为滋养细胞的增殖和侵袭能力不足导致母体螺旋动脉重塑失败和浅着床，最终引发母体高血压、蛋白尿及多器官功能损伤^［9，10］。胎盘滋养细胞的增殖、侵袭及抗凋亡能力是维持正常妊娠的关键，而子痫前期患者滋养细胞常表现为细胞周期阻滞、侵袭能力下降及凋亡异常。因此，探索滋养细胞功能调控的分子机制，提高滋养细胞的增殖和侵袭能力并减少凋亡是防治PE的有效策略。CRLR参与调节胎盘内皮和血管平滑肌的血管舒张^［5］、内皮细胞凋亡和血管生成^［6］，在PE病理生理学中起重要作用。其他学者研究表明，严重PE患者的胎盘组织CRLR表达上调^［4］。据报道，在缺氧微环境下CRLR的表达增加，并可抑制缺氧诱导的细胞凋亡^［7］。由于在妊娠早期，胚胎的发育是在一个相对缺氧的环境下进行，而胎盘持续缺氧是PE进展中的重要病理因素^［8］，故推测PE中CRLR的表达升高可能与PE发生发展有关。目前，子痫前期的治疗仍以终止妊娠为主，缺乏有效的靶向干预手段。本研究首次揭示CRLR调控滋养细胞功能的机制，为子痫前期的防治提供了新的分子靶点。

有研究表明，干扰CRLR表达可抑制结直肠癌细胞RKO和HT-29增殖^［11］，说明CRLR可能对结直肠癌细胞的增殖有促进作用。CRLR可能介导了肾上腺髓质素对胶质瘤的促生长作用^［12］。CRLR参与维持造血细胞的增殖能力^［13］。因此，认为CRLR可能在多种疾病中发挥促增殖作用。研究表明，CRLR在PE患者中CRLR表达上调，介导胎盘内皮和血管平滑肌的血管舒张^［5］。另外，在PE患者中，胎盘缺氧通过激活CRLR基因启动子区的缺氧反应元件增加其表达^［6］。本研究结果表明CRLR在H/R处理的HTR-8/SVneo细胞中表达上调，而且上调CRLR可促进H/R处理的HTR-8/SVneo细胞增殖，下调CRLR则抑制了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞增殖。上述结果说明缺氧诱导的CRLR表达上调可能在PE进展中发挥保护作用。

胎盘滋养层细胞的过度凋亡被认为是PE发病机制的主要原因^［14］。PE中，滋养细胞微绒毛丢失和扭曲，内质网扩张，线粒体肿胀，发生凋亡。在PE患者和大鼠PE模型的胎盘中，TUNEL指数增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax表达增加^［14］。在缺氧条件下培养的滋养细胞中观察到较低的Bcl-2表达和较高的Bax^［15］。据报道，CRLR通过与肾上腺髓质素相互作用来抑制缺氧诱导的人骨肉瘤细胞凋亡^［7］。RAMP1缺陷小鼠的造血细胞表现出增强的细胞凋亡^［13］，而RAMP1是与CRLR形成复合物来发挥作用的，说明CRLR对维持造血细胞的存活、抑制细胞凋亡有重要作用。提示CRLR可能具有抗凋亡活性。本研究结果显示上调CRLR抑制了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞凋亡，同时抑制cleaved Caspase-3表达，促进Bcl-2表达，而下调CRLR则诱导了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞凋亡。上述结果说明上调CRLR表达可能有利于减少PE发展中的滋养细胞凋亡。

在正常和无并发症的妊娠中，滋养细胞通过子宫间质侵入螺旋动脉，随后排列并重塑螺旋动脉，因此，滋养细胞侵袭是成功建立流向胎盘的母体血流的因素^［9，16］。越来越多的研究表明，滋养细胞迁移和侵袭不足可能导致PE^［17-19］。据报道，CRLR是一种促进细胞侵袭的基因。在淋巴结转移的结肠癌组织中CRLR的表达明显增加，CRLR表达被抑制后，结肠癌细胞的侵袭明显受限^［11］。CRLR在胶质瘤细胞和内皮细胞中均有表达，其配体肾上腺髓质素可能通过CRLR影响胶质瘤的生长和血管生成等过程，间接增强胶质瘤细胞的侵袭能力^［12］。CRLR与肾上腺髓质素相互作用促进人脐静脉内皮细胞迁移和侵袭^［20］。基质金属蛋白酶已被证明具有蛋白水解活性，与滋养细胞侵袭子宫壁的效率有关^［21］。此外，这些酶的失调与PE有关，MMP-2和MMP-9能够降解胶原蛋白，对侵袭至关重要。最近的研究表明，MMP-2和MMP-9的减少会干扰妊娠早期螺旋动脉的正常重塑，导致PE的初始病理生理变化^{［22，23］}。本研究结果表明上调CRLR促进了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞侵袭，同时上调了MMP-2和MMP-9的表达，而下调CRLR则抑制了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞侵袭。上述结果说明上调CRLR表达可能通过提高滋养细胞的侵袭能力从而缓解螺旋动脉重塑障碍，其机制与上调MMP-2和MMP-9的表达有关。

氧化应激是ROS的产生和清除之间平衡的结果。越来越多的证据表明，氧化应激与PE的发生密切相关，因为人类滋养层的氧化损伤将导致胎盘异常和病理性妊娠^［24］。因此，减少滋养层细胞氧化应激引起的损伤对于缓解PE的发展非常重要^［25］。据报道，受体活性修饰蛋白1（RAMP1）/CRLR复合物对氧化应激诱导的心肌细胞损伤具有保护作用，可抑制因氧化应激导致的一些细胞凋亡相关事件的发生，提示CRLR在细胞应对氧化应激过程中起重要作用^［13］。RAMP1/CRLR复合物对氧化应激诱导的H9c2心肌细胞具有抗凋亡作用^［26］。本研究结果显示上调CRLR抑制了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞ROS生成，减少了氧化产物积累，提高了抗氧化酶活性；而下调CRLR则加重了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞氧化应激。上述结果提示上调CRLR表达可能通过减弱氧化应激来应对PE的发生。

PI3K/Akt信号通路在介导生长因子依赖性滋养细胞生长和侵袭调节中起着关键作用。先前的研究表明，通过抑制PI3K/Akt通路，滋养细胞的增殖和侵袭受到抑制^{［27，28］}。据报道，CRLR可能通过影响Akt的磷酸化在心肌缺血损伤的发病机制中发挥重要作用^［29］。MMP-2和MMP-9是PI3K/Akt信号通路的下游靶蛋白^［30］，PI3K和Akt通过上调MMP-2和MMP-9的表达参与调节滋养细胞侵袭^{［27，31］}。本研究结果显示上调CRLR提高了H/R处理的HTR-8/SVneo细胞PI3K和Akt磷酸化水平；而下调CRLR则抑制了PI3K/Akt信号通路的激活。上述结果说明上调CRLR表达可能通过激活PI3K/Akt信号通路延缓PE进展。

本研究存在以下局限性：①本研究为基于HTR-8/SVneo细胞的体外实验，虽能模拟滋养细胞的增殖、侵袭及凋亡过程，但无法完全重现体内胎盘-母体界面的复杂微环境。此外，H/R处理仅模拟了急性缺血缺氧，与子痫前期的慢性病理过程存在差异，可能导致实验结果与临床实际存在偏差。②尽管本研究证实CRLR调控滋养细胞功能，但未明确CRLR的具体配体及其下游效应分子。此外，CRLR与其他信号通路的串扰机制尚未阐明。③本研究缺乏体内动物实验验证。今后研究的方向主要集中在以下方面：①构建CRLR过表达或敲除的子痫前期动物模型，验证CRLR对胎盘血管重铸、胎儿发育及母体血压的影响。②通过腺相关病毒或小分子激动剂上调CRLR表达，评估其对疾病进程的改善作用，并探索剂量依赖性及长期安全性。③研究CRLR与其他信号通路的串扰机制，明确其在缺氧微环境中的协同调控网络。

综上所述，上调CRLR可促进子痫前期细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，其机制与激活PI3K/Akt信号通路有关。本研究拓展了CRLR在妊娠相关疾病中的功能研究范畴，有望为临床探寻子痫前期的早期诊断指标和治疗新策略提供科学依据，对丰富妊娠并发症的发病机制理论、推动靶向治疗研究具有重要意义。

参考文献

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基金资助

陕西省重点研发计划项目(2021SF-210)