NMDA受体色谱在桂芍镇痫片活性成分筛选中的应用

Application of NMDA receptor chromatography in screening of active ingredients in Guishao Zhenxian tablets

摘要

目的 采用固定化NMDA受体（NMDA-AR）色谱柱筛选桂芍镇痫片的生物活性成分。 方法 使用制备NMDA-AR受体色谱柱（50 mm×4.6 mm，5.0 μm）筛选桂芍镇痫片生物活性成分。 结果 桂芍镇痫片中10个成分即芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷、没食子酸、桂皮酸、黄芩素、汉黄芩素与NMDA-AR有保留行为。 结论 NMDA-AR色谱法可用于桂芍镇痫片生物活性成分筛选。

Abstract

Objective To screen the bioactive components of Guisao Zhenxian tablets using immobilized NMDA receptor（NMDA-AR） chromatographic column. Methods NMDA-AR receptor chromatographic column（50 mm×4.6 mm，5.0 μm） was prepared and used to screen the bioactive components of Guishao Zhenxian tablets. Results A total of 10 components in Guishao Zhenxian tablets， namely paeoniflorin， hydroxypaeoniflorin， benzoyl paeoniflorin， methyl gallate， alibiflorin， gallic paeoniflorin， gallic acid， cinnamic acid，baicalein， and wogonin， had retention behaviors with NMDA-AR chromatographic column. Conclusion NMDA-AR chromatography can be used for screening the bioactive components of Guishao Zhenxian tablets.

Graphical abstract

关键词

桂芍镇痫片 / NMDA-AR / 生物活性成分筛选 / 芍药苷 / 桂皮酸 / 黄芩素 / 高效液相色谱法

Key words

Guishao Zhenxian tablets / NMDA-AR / bioactive ingredient screening / peoniflorin / cinnamic acid / baicalein / HPLC

桂芍镇痫片收载于2020版中国药典一部的中药复方制剂，由桂枝、白芍、党参、半夏（制）、柴胡、黄芩、甘草、生姜、大枣9味药组成，用于治疗各种发作类型的癫痫^［1］。网络药理学研究桂芍镇痫片，筛出127个活性成分和46个相关抗癫痫靶点^［2］。笔者前期采用HPLC法成功测定了其中的13个活性成分即没食子酸、羟基芍药苷、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、黄芩苷、桂皮酸、汉黄芩苷、苯甲酰芍药苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素等^［3，4］。目前，中药活性成分筛选方法主要包括整体动物模型、细胞模型、酶和受体模型、基因芯片、传统生物色谱和计算机模拟等技术；而受体色谱法是基于亲和色谱而提出的一种色谱分离技术，具有高特异性、高靶向性和高分离能力，已发展成为药物分析领域的热点研究方法之一^［4-11］。NMDA为离子型谷氨酸受体，与癫痫后认知功能的损害又有着密切的联系^［12］。因此，本研究通过制备固定化NMDA受体色谱柱，分析芍药镇痫片中13个活性成分即没食子酸、羟基芍药苷、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、黄芩苷、桂皮酸、汉黄芩苷、苯甲酰芍药苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素的保留行为，旨在为中药复方等复杂体系生物活性成分筛选提供方法学借鉴。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

岛津2030plus高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BILON6-180C型台式数控超声波清洗器（上海比朗仪器制造有限公司）；EX1205型电子分析天平（上海赞维衡器有限公司）；NMDA-AR色谱柱（50 mm× 4.6 mm，7 μm，安徽通用生物股份有限公司）。

1.2 主要试剂与试药

大孔硅胶（孔径300 Å，粒径7.0 µm，日本Fuji Silysia化学公司）；娃哈哈净水（杭州娃哈哈启力营养食品有限公司）；其他试剂均为分析纯。没食子酰芍药苷（批号HG003027）、黄芩苷（批号RG158H8）、桂皮酸（批号HA062811）、没食子酸（批号HG230820）、没食子酸甲酯（批号HA063031）、羟基芍药苷（批号HO003023）、汉黄芩苷（批号HW158601）、芍药苷（批号HP003024）、芍药内酯苷（批号HA003021）、甘草酸（批号HA062610）、苯甲酰芍药苷（批号HB003022）、汉黄芩素（批号HW158604）、黄芩素（批号RG158H2），纯度均为≥98%，均购自宝鸡晨光生物科技有限公司。桂芍镇痫片（批号：240912；规格：0.35 g×36片；国药准字Z20083016），购自陕西君碧莎制药有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受体的纯化与受体柱的制备

发酵培养可表达His-tag NMDA-AR的基因工程菌株，IPTG诱导，超声破碎离心后收集上清。两步柱色谱法分离纯化NMDA-AR，SDS-PAGE检测纯度为95%。将His-tag NMDA-AR通过重氮盐反应定向固定于大孔硅胶表面，合成受体色谱固定相，湿法装柱^［7］。

1.3.2 桂芍镇痫片中生物活性成分的筛选

（1）色谱条件：色谱柱（50 mm×4.6 mm，7.0 μm）；流动相：20 mmol/L磷酸溶液（pH=7.4）。记录时间为60 min。流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；检测波长230 nm、254 nm；进样量5 μL。

（2）桂芍镇痫片溶液的制备：取本品10片，除去糖衣后研细，再称取0.1 g粉末于100 mL量瓶中，加75%甲醇适量，超声处理15 min，放凉后，加75%甲醇至刻度，摇匀；再取1 mL于10 mL量瓶，加水至刻度，摇匀，滤过，即得。

（3）工具药（亚硝酸钠）溶液的制备：称取10 mg于100 mL量瓶中，加水使溶解，再加水至刻度，摇匀，滤过，即得^［13］。

（4）13种活性成分溶液的制备：①分别称取没食子酸、没食子酸甲酯、羟基芍药苷、芍药苷适量，加水分别配成100 μg/mL溶液；②称取黄芩苷适量，加甲醇配成0.1 μg/mL溶液；③分别称取没食子酰芍药苷、甘草酸、芍药内酯苷、桂皮酸适量，加甲醇配成100 μg/mL溶液；④称取苯甲酰芍药苷适量，加甲醇配成50 μg/mL溶液；⑤称取汉黄芩苷适量，加甲醇配成40 μg/mL溶液；⑥分别称取黄芩素、汉黄芩素适量，加甲醇配成30 μg/mL溶液。

2 结果

2.1 NMDA-AR色谱柱死体积测定和供试品与NMDA-AR色谱作用

通过工具药测定NMDA-AR色谱柱死体积测定，因为亚硝酸钠与受体色谱柱无保留行为，认为保留时间超过2.239 min有保留行为即与受体有结合作用（见图1A）。 进样结果显示，桂芍镇痫片溶液有多成分与NMDA受体结合（见图1B）。

2.2 各成分与NMDA受体色谱作用

结果发现，供试品在NMDA-AR受体色谱柱上的有保留行为；10个成分即芍药苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、没食子酸甲酯、芍药苷内酯苷、没食子酰芍药苷、没食子酸、桂皮酸、黄芩素、汉黄芩素在NMDA-AR受体色谱柱上有保留行为（见图2），提示10个成分与NMDA-AR可以结合，表明可能是制剂的主要活性成分。

3 讨论

癫痫是一种慢性反复发作性脑功能失调综合征，是由于脑内神经元超同步化放电所引起，癫痫的发生、发展与脑内神经递质失衡有关，谷氨酸是大脑中含量最高的兴奋性神经递质之一，而Ｎ-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体是一种重要的离子型谷氨酸受体，它在突触传递和神经可塑性等生理过程中扮演关键角色^［14］。癫痫发作可导致NMDA受体通道过度激活，加剧癫痫的发展及神经功能障碍^［15-22］。因此，研究该制剂的活性成分与该受体的结合对于阐明抗癫痫的作用具有重要意义。

桂芍镇痫片主要用于治疗各种发作类型的癫痫疾病^［9-11］。前期研究及文献已经报道制剂中有13个活性成分即没食子酸、羟基芍药苷、没食子酸甲酯、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、黄芩苷、桂皮酸、汉黄芩苷、苯甲酰芍药苷、黄芩素、甘草酸、汉黄芩素。为了研究其是否参直接与了抗癫痫作用，笔者选用了NMDA受体色谱法。虽然目前筛选中药活性成分方法有整体动物模型、细胞模型、酶和受体模型、基因芯片、传统生物色谱和计算机模拟、受体色谱法等^［4-11］，但受体色谱具有特异性与高效性等特点。本试验证明了10个活性成分与NMDA受体色谱有结合，说明其可能参与抗癫痫作用。

中药活性成分的筛选可采用液质联用实现活性成分鉴别，虽然此方法所得结果较为可靠，但质谱仪成本昂贵，维护成本高，所以设备操作需要专业操作人员，所得数据需要专业解析的技术人员。本研究采用HPLC法进行受体色谱结合试验筛选出10个活性成分与NMDA受体具有结合作用，使用仪器成本低廉，操作简单，数据分析简单且可靠，无须配备仪器专业操作人员及数据解析专业技术人员。本方法简化了复杂的设备操作与数据分析过程，节省了试验成本。这为研究桂芍镇痫片抗癫痫作用提供了直接依据，为深入研究提供了基础。

总之，通过固定化NMDA-AR受体色谱柱可用于中药复方等复杂体系中生物活性成分的筛选，为复杂体系的生物活性成分筛选提供方法学借鉴，为本制剂活性成分研究提供基础，为进一步的机制研究奠定了理论依据。

参考文献

[1] 中国药典委员会. 中华人民共和国药典：一部 ［S］. 2020年版.北京：中国医药科技出版社，2020：1433.

[2] 赵鑫，黄碧云，吴丹，等.基于网络药理学和分子对接探讨桂芍镇痫片治疗颞叶癫痫的作用机制［J］.山东科学，2023，36（3）：27-37.

[3] 崔小丽，孙宁，赵瑞，等.高效液相色谱法同时测定桂芍镇痫片中13种成分的含量［J］.中南药学，2023，21（11）：3024-3029.

[4] 崔小丽，孙宁，赵瑞，等.基于HPLC的桂芍镇痫片指纹图谱分析方法的建立［J］.山西医科大学学报，2023，54（6）：847-856.

[5] Moaddel R， Cloix J， Ertem G，et al.Multiple receptor liquid chromatographic stationary phases： the co⁃immobilization of nicotinic receptors， γ⁃amino⁃butyric acid receptors， and N⁃methyl D⁃aspartate receptors［J］. Pharmaceutical 7Research，2002，19（1）：104-107.

[6] 刘嘉君，贾晓妮，王静，等.受体色谱：中药靶向活性成分高效筛选技术［J］.世界科学技术-中医药现代化，2018，20（8）：1476-1481.

[7] 张建丰，梁琦，李刚刚，等.固定化蛋白质色谱模型的建立及其在先导化合物筛选中的应用［J］.西北药学杂志，2023，38（5）：37-41.

[8] 赵新锋，李倩，郑晓晖.新药创制中受体色谱的研究及构建［C］//中国化学会.第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集.兰州：中国化学会，2017：1.

[9] 赵新锋，郑晓晖.受体色谱的构建及其在复杂体系活性成分高通量筛选中的应用［C］//重庆市色谱专业委员会，重庆市分析测试学会，甘肃省色谱专业委员会.中国中西部地区第五届色谱学术交流会暨仪器展览会论文集.重庆：重庆市色谱专业委员会，2016：1.

[10] 赵新锋，郑晓晖，樊台平，等.一种高效创新药物开发新策略［C］//中国化学会，中国色谱学会.第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集（第一分册）.西安：中国化学会、中国色谱学会，2015：1.

[11] 高森，白雪，文柳静，等.基于一测多评法桂芍镇痫片中8种成分定量质量控制研究［J］.中草药，2018，49（12）：2883-2889.

[12] 毕翻，姜俊杰，潘恒恒，等.N-甲基-D-天冬氨酸受体参与癫痫发病机制的研究进展［J］.癫痫与神经电生理学杂志，2023，32（1）：37-41.

[13] Zhao X， Fu X， Yuan X， et al. Development and characterization of a selective chromatographic approach to the rapid disco⁃very of ligands binding to muscarinic⁃3 acetylcholine receptor［J］. J Chromatogr A，2021，1653：462443.

[14] Sinyak SD， Amakhin VD， Soboleva BE，et al.Flufenamic acid abolishes epileptiform activity in the entorhinal cortex slices by reducing the temporal summation of glutamatergic responses［J］.BBRC，2024，733（11）：150666.

[15] 刘浩，邹晓毅.抗NMDA受体脑炎患者的脑电生理特点［J］.癫痫与神经电生理学杂志，2020，29（5）：300-305.

[16] Gjerulfsen EC， Krey I， Klöckner C，et al.Spectrum of NMDA receptor variants in neurodevelopmental disorders and epilepsy［J］.Methods Mol Biol，2024，27991：1-11.

[17] Gabrielle M， Angela M， Joseph B，et al.An integrated approach to evaluate the functional effects of disease⁃associated NMDA receptor variants［J］. Neuropharmacology， 2023，240（12）：109703.

[18] Xiaoqing L， Cheng L， Xiaoli Y，et al.The effect of hippocampal NR2B⁃containing NMDA receptors on chronic cognitive dysfunction in rats with temporal lobe epilepsy［J］.Acta Epileptol，2023，5（1）：1.

[19] Monyer H， Burnashev N， Laurie DJ， et al. Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors［J］. Neuron， 1994，12（3）：529-540.

[20] Laurie DJ， Bartke I， Schoepfer R， et al. Regional， developmental and interspecies expression of the four NMDAR2 subunits， examined using monoclonal antibodies［J］. Brain Res Mol Brain Res， 1997，51（1-2）：23-32.

[21] Van Zundert B， Yoshii A， Constantine⁃Paton M. Receptor sharing compartmentalization and trafficking at glutamate synapses： a development proposal［J］.Trends Neurosci，2004， 27 （7）： 428-437.

[22] Jashank P， Fernando JO， Ammar A，et al.Understanding seizures and prognosis of the extreme delta brush pattern in anti⁃N⁃methyl⁃D⁃aspartate（NMDA） receptor encephalitis： a systematic review［J］.Cureus，2021，13（9）：e18154.

基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2024JC-YBMS-603)

陕西省人民医院科技人才支持计划项目(2022JY-61)

陕西省人民医院孵化基金项目(2023YJY-86)