接骨续筋片质量标准提升研究

Quality standard improvement of Jiegu Xujin tablet

摘要

目的 提高接骨续筋片质量控制标准。 方法 采用显微鉴别法对接骨续筋片中蜥蜴进行鉴别；采用薄层色谱法对制剂中穿山龙及骨碎补进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定制剂中柚皮苷的含量，并进行方法学考察。 结果 蜥蜴显微特征专属性强，检出几率高。穿山龙及骨碎补薄层色谱特征斑点清晰，专属性强、耐用性好。柚皮苷在0.038 3~4.787 1 μg范围内线性关系良好，其回归方程为：y=1 723 987.21x-4 337.64，R²=1.00。加样回收率平均为102.2%（n=9），RSD为1.5%，精密度、稳定性、重复性的RSD均小于0.5%。 结论 新建立的显微鉴别、薄层色谱鉴别及含量测定方法，操作简便快捷，准确可靠，重现性好，可用于该制剂的质量评价，为接骨续筋片的质量控制提供了科学依据。

Abstract

Objective To improve the quality standard of Jiegu Xujin tablet. Methods The microscopic identification method was used to identify eremias，the thin-layer chromatography（TLC） method was used to identify Dioscoreae Nipponicae Rhizoma and Drynariae Rhizoma，and high performance liquid chromatography（HPLC） was established to determine the content of naringin in Rhizoma Drynariae. Results The microscopic identification for eremias was strongly specific with good detection probability. The TLC for Dioscoreae Nipponicae Rhizoma and Drynariae Rhizoma showed clear spots and strong specificity with good durability. The linear range of naringin was 0.038 3-4.787 1 μg， and the regression equation was y=1 723 987.21x-4 337.64（R² =1.00）.The average reco⁃very was 102.2%（n=9） with RSD of 1.5%. The RSDs of precision， stability and repeatability were all less than 0.5%. Conclusion The newly established microscopic identification，TLC and HPLC are accurate and reliable with simple operation and good reprodu⁃cibility， and can be used for the quality evaluation， which provides scientific basis for the quality control of Jiegu Xujin tablet.

Graphical abstract

关键词

接骨续筋片 / 标准提升 / 薄层色谱 / 高效液相色谱

Key words

Jiegu Xujin tablet / standard improvement / thin-layer chromatography / high performance liquid chromatography

接骨续筋片是由蜥蜴、骨碎补、穿山龙三味中药材组成的复方制剂，具有活血化瘀、消肿止痛的功效，临床用于软组织损伤、骨折等^［1］。经查询国家食品药品监督管理局网站数据显示，本品共有16个生产企业，16个批准文号。通过函调本研究共收集到5家生产企业提供的21批样品，均为糖衣片。现行标准主要为《卫生部药品标准》中药成方制剂第十一册及9个注册标准。而部标十一册仅有2个理化鉴别项，无含量测定项。9个注册标准由于各标准设置项目、控制指标及制备方法均不一致，难以控制该品种质量。故本研究从性状、鉴别、含量测定等方面进行了研究，从而提高本品的质量标准，为控制其质量提供了科学依据。

1 仪器与试剂

仪器：Olympus BX51显微镜（日本Olympus公司）；LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CAMAG ATS4自动点样仪（瑞士CAMAG公司）；BL-610电子天平（德国赛多利斯公司）；MS-204S电子天平、XSE-105DU电子天平（瑞士梅特勒公司）；LC-350A超声波中药处理机（济宁市中区鲁超仪器厂）；硅胶G薄层板分别购自青岛海洋化工有限公司和德国默克公司。

试剂：色谱乙腈（北京迪马科技有限公司），甲醇、三氯甲烷、石油醚（30~60 ℃）、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、甲酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠、磷钼酸、三氯化铝等均为分析纯，水为超纯水；穿山龙对照品（批号：121378-200401）、薯蓣皂苷元对照品（批号：1539-200001）、骨碎补对照品（批号：1169-200001）、柚皮苷对照品（批号：110722-201312）均来源于中国食品药品检定研究院。方法研究用样品（批号20181201）来自山西仁源堂药业有限公司，处方中各味药材饮片均由该企业提供。含量测定及鉴别用样品分别来自于5个生产企业共21批次，其中，No. 1~6为山西仁源堂药业有限公司生产（6批）；No. 7~9为陕西君寿堂制药有限公司生产（3批）；No.10~14为山西华元医药生物技术有限公司生产（5批）；No. 15~19为通化百信药业有限公司生产（5批）；No.20~21为吉林省七星山药药业有限公司生产（2批）。

2 方法与结果

2.1 性状

接骨续筋片原标准性状描述为：“本品为糖衣片或薄膜衣，除去包衣后显灰褐色，气微，味微苦、涩^［1］。”根据收集到的样品情况，发现不同生产企业的样品片芯颜色略有不同，故将此项修订为：“本品为糖衣片或薄膜衣，除去包衣后显灰棕色至棕褐色，气微，味微苦、涩”。

2.2 蜥蜴显微鉴别

制剂中蜥蜴有一半量是生粉入药，但现行标准中只有一家生产企业制定了蜥蜴的显微鉴别，其余企业均采用茚三酮化学反应来鉴别，考虑到专属性的问题，故将其修订为显微鉴别法，参考文献［2］，具体描述为：“皮肤碎片表面可见棕褐色色素颗粒；肌纤维有波峰状或稍平直的细密横纹；骨碎片不规则块状，表面有裂隙或圆形骨陷窝”（见图1）。

2.3 穿山龙薄层鉴别

供试品溶液的制备：取接骨续筋片10片（小片）或6片（大片），除去包衣，研细，加3 mol/L盐酸溶液30 mL，超声处理20 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，加热回流30 min，放冷，再加三氯甲烷20 mL，加热回流15 min，放冷，置分液漏斗中分取三氯甲烷层，水层用三氯甲烷20 mL提取，合并三氯甲烷液，用1%氢氧化钠溶液20 mL洗涤，弃去碱液，三氯甲烷液蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：另取穿山龙对照药材1.5 g，加水煎煮30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加3 mol/L的盐酸溶液30 mL，同法制成对照药材溶液。再取薯蓣皂苷元对照品，加三氯甲烷制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

阴性供试溶液的制备：按本制剂处方量，称取缺穿山龙的其他药味适量，模拟制剂工艺流程，制备缺穿山龙的阴性对照，按供试品溶液的制备方法制备，即得。

照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验，吸取供试液、对照药材溶液及阴性供试液各10 μL，对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30~60 ℃）-乙酸乙酯（8∶2）为展开剂^［3，4］，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。

结果显示：供试品色谱分离效果好，斑点清晰可辨，且阴性对照无干扰（见图2）。

2.4 骨碎补薄层色谱鉴别

供试品溶液的制备：取本品10片（小片）或6片（大片），除去包衣，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

对照品溶液制备：取骨碎补对照药材2 g，加甲醇30 mL，同法制成对照药材溶液。另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

阴性供试溶液的制备：按本制剂处方量，称取缺骨碎补的其他药味适量，模拟制剂工艺流程，制备缺骨碎补的阴性对照，按供试品溶液的制备方法制备，即得。

照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）为展开剂，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，在105 ℃加热2~3 min，再置紫外光灯（365 nm）下检视。

结果显示：供试品色谱分离效果好，斑点清晰可辨，阴性对照无干扰（见图3）。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱：方法学考察采用自装柱（C₁₈，FUJI填料，4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈-1%乙酸溶液（20∶80）^［8-14］；波长：283 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min。

2.5.2 供试品溶液制备

取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取1 g，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声提取（功率250 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 对照品溶液的制备

精密称取柚皮苷对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL含柚皮苷0.1 mg的溶液，即得。

2.5.4 专属性试验

称取缺骨碎补的阴性样品适量，模拟接骨续筋片制剂工艺流程，制备缺骨碎补的阴性对照，按供试品溶液的制备方法制备，即得阴性对照溶液。精密吸取阴性对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，依法测定。结果表明：供试品色谱分离效果好，且阴性对照无干扰（见图4）。

2.5.5 耐用性考察

按照拟定的方法，采用不同品牌的液相色谱仪（Agilent 1260、Waters e2695-2998）及色谱柱（Alltima C₁₈ 5 μm，4.6 mm×250 mm；AgelaVenusil XBP C₁₈ 5 μm，4.6 mm×250 mm）对同一批样品进行测定，结果同一仪器不同柱子测定结果RSD为0.24%，同一柱子不同仪器测定结果RSD为0.64%，表明耐用性良好，符合要求。

2.5.6 线性关系考察

精密称取柚皮苷对照品，加甲醇制成0.191 5 mg/mL的对照品溶液，分别进样0.2，0.5，1，2，5，10，20，25 μL注入液相色谱仪，依法测定其峰面积。以柚皮苷量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：y=1 723 987.21x-4 337.64，R²=1.00。结果表明，柚皮苷在0.038 3~4.787 1 μg范围内线性关系良好。

2.5.7 精密度试验

取同一供试品（批号20181201）溶液，同一进样量，连续进样6次，按试验条件依法测定柚皮苷的峰面积，结果峰面积RSD为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.5.8 稳定性考察

取同一供试品（批号：20181201）溶液，分别于0，4，8，12，24 h注入液相色谱仪，测定柚皮苷的峰面积，结果峰面积RSD为0.28%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.9 重复性试验

取同一供试品（批号20181201），按拟订含量测定方法，平行制备供试品溶液6份，依法测定，结果平均含量为2.36 mg/g，RSD为0.39%。

2.5.10 准确度试验

采用加样回收法，取上述重复性试验所用的样品（20181201），取0.5 g（9份），精密称定，分别精密加入不同量的柚皮苷对照品，按拟定含量测定方法制备，依法测定，计算回收率，结果平均回收率为102.2%，RSD为1.5%（见表1），符合要求。

2.5.11 样品测定

采用拟定方法对21批接骨续筋片样品进行测定，测定结果见表2。21批次的接骨续筋片样品柚皮苷含量在0.32~2.17 mg/片之间，以上结果均符合拟定限度要求。

2.5.12 含量限度的确定

参照《中国药典》一部骨碎补项下规定，骨碎补含柚皮苷不得少于0.50%^［9］，按处方量折算，本品每片含骨碎补0.333 g（小片）或0.555 g（大片），因骨碎补工艺为水煎煮，含量会有所下降，根据《国家药品标准工作手册》^［13］及相关文献报道^［14］，综合考虑，以样品测定低值为限度（转移率约30%），故暂定限度为：每片含骨碎补以柚皮苷（C₂₇H₃₂O₁₄）计，小片不得少于0.30 mg，大片不得少于0.50 mg。

3 讨论

3.1 穿山龙薄层鉴别展开剂的选择

参考企业的注册标准，分别对展开剂为三氯甲烷-甲醇（10∶1）和石油醚（30~60 ℃）-乙酸乙酯（8∶2）进行考察，结果表明，以后者为展开剂时，色谱分离效果好，斑点清晰可辨，故穿山龙薄层鉴别标准中选用了此展开剂。

3.2 骨碎补薄层鉴别提取方法的选择

参考相关文献^{［3，5-7］}，对骨碎补薄层鉴别的提取溶剂进行了研究，分别采用70%乙醇及甲醇进行考察，结果表明，两种溶剂提取的供试液，经展开后，其色谱行为虽无明显差异，但实验过程中发现，70%乙醇超声提取蒸干后不易溶解，考虑到实验操作的可行性，故骨碎补薄层鉴别标准选用甲醇作为提取溶剂。

3.3 耐用性考察

采用本研究制定的方法，对穿山龙及骨碎补的薄层色谱进行了耐用性考察，结果显示，不同品牌的硅胶G板色谱分离效果均良好，且斑点清晰，说明耐用性好。

3.4 含量测定提取方法及提取溶剂选择

经查阅相关文献^［5-12］，供试液制备方法采用加热回流30 min，超声30，40，50，60 min，分别以30%甲醇，50%甲醇，70%甲醇、甲醇、乙醇作为提取溶剂，进行比较，结果表明：①超声与回流提取含量差异不大，提取溶剂量25 mL与50 mL也无差异。②70%甲醇与甲醇、乙醇提取含量差异较大，70%甲醇为溶剂时，柚皮苷含量最高。③不同超声时间含量无明显差异，故最终选用“70%甲醇25 mL，超声40 min”作为提取方法。

3.5 波长的选择

参考《中国药典》2020年版一部补骨脂含量测定项及相关文献^{［9，14，15］}，采用PDA检测器，测定柚皮苷对照品的紫外吸收光谱，在283 nm处有最大吸收，故选283 nm作为检测波长。

总之，本研究按照中成药质量评价创新模式研究思路，最终修订了接骨续筋片的性状描述，增订了蜥蜴的显微鉴别，增修订了穿山龙及骨碎补的薄层鉴别，建立并统一了骨碎补中柚皮苷的含量测定方法及限度，所建立的方法操作简单、准确可靠，重现性好，可有效控制该产品的质量，并为其质量评价提供了科学依据。

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基金资助

国家药典委员会药品标准提高项目(443)