顶空气相色谱法测定艾曲波帕原料药中残留溶剂

Determination of residual solvents in Eltrombopag Olamine active pharmaceutical ingredients by headspace gas chromatography

摘要

目的 建立同时测定艾曲波帕原料药中8种有机溶剂（甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶）残留量的顶空气相色谱法。 方法 色谱柱为DB-1毛细管色谱柱（30 m×0.53 mm×2.65 μm），程序升温，进样口温度为250 ℃，检测器为火焰离子化检测器，温度为250 ℃，载气为高纯氮气，流速为2.5 mL/min，分流比为10∶1，顶空瓶平衡温度为90 ℃，平衡时间为25 min。对建立的方法进行专属性、线性和范围、检测限和定量限、精密度、重复性、加样回收率、稳定性考察。 结果 艾曲波帕原料药中8种残留溶剂（甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶）在一定浓度范围内显示良好的线性（r>0.999），定量限分别为6.0，7.6，6.2，4.0，1.5，0.76，0.75，3.9 μg/mL；检测限分别为2.0，2.5，2.1，1.3，0.5，0.25，0.25，1.3 μg/mL；平均回收率分别为102.4%，101.7%，101.6%，100.6%，101.4%，98.2%，100.7%和99.9%；RSD值分别为1.9%，1.7%，1.9%，1.7%，2.1%，1.9%，1.5%和1.5%（n=9）；专属性、精密度、重复性、稳定性均符合方法学验证要求。 结论 本研究所建立的顶空气相色谱法适用于艾曲波帕原料药中8种残留溶剂的测定。

Abstract

Objective To establish a headspace gas chromatographic method for the simultaneous determination of eight residual organic solvents（methanol， ethanol，dichloromethane， ethyl acetate， tetrahydrofuran， triethylamine， heptane and pyridine） in Eltrombopag Olamine active pharmaceutical ingredients（API）. Methods The chromatographic column was DB-1 capillary column （30 m×0.53 mm×2.65 μm） with temperature-programmed， the temperature of the injection port was 250 ℃， the detector was flame ionization detector（FID） with the temperature of 250 ℃， the carrier gas was high purity nitrogen gas with the flow rate of 2.5 mL/min， the split ratio was 10∶1， the headspace heating temperature was 90 ℃， and the equilibrium time was 25 min. Specificity， linearity and range， detection limit and quantification limit， precision， repeatability， recovery， stability of the method were validated. Results Each of the eight residual solvents （methanol， ethanol， dichloromethane， ethyl acetate， tetrahydrofuran， triethylamine， heptane and pyridine） had good linearity within a certain concentration range（r>0.999）， the limits of quantitation（LOQ） were 6.0， 7.6， 6.2， 4.0， 1.5， 0.76， 0.75， 3.9 μg/mL， and the limits of detection（LOD） were 2.0， 2.5， 2.1， 1.3， 0.5， 0.25， 0.25， 1.3 μg/mL. The average recoveries were 102.4%， 101.7%， 101.6%， 100.6%， 101.4%， 98.2%， 100.7% and 99.9%， and the RSD values were 1.9%， 1.7%， 1.9%， 1.7%， 2.1%， 1.9%， 1.5% and 1.5%（n=9）， respectively. The specificity， precision， repeatability， and stability met the requirements of method validation. Conclusion The established headspace gas chromatographic method is suitable for the simultaneous determination of eight residual solvents in eltrombopag olamine API.

Graphical abstract

关键词

顶空气相色谱法 / 艾曲波帕原料药 / 残留溶剂 / N-甲基吡咯烷酮 / 正庚烷 / 三乙胺 / 氨水

Key words

headspace gas chromatography / Eltrombopag Olamine API / residual solvents / N-methyl-2-pyrrolidone / heptane / triethylamine / ammonium hydroxide

艾曲波帕（Eltrombopag Olamine）是一种非肽类口服小分子血小板生成素受体激动剂，主要作用于血小板生成素受体跨膜区，激活并增强JAK-STAT3/STAT5、ATK及MAPK信号通路，从而促进巨核细胞增殖、成熟和血小板生成^［1］。临床上，该药物主要用于治疗原发性免疫性血小板减少症，尤其在慢性特发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血、慢性丙型病毒性肝炎导致的血小板减少治疗方面疗效显著。因口服方便、安全有效，艾曲波帕逐渐成为研究热点^［2］。

根据湖北丽益医药科技有限公司提供的合成工艺可知，在艾曲波帕原料药合成和精制过程中，使用了甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶8种有机溶剂，这些溶剂会对人体造成不良影响。根据人用药品技术要求国际协调理事会（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use， ICH）^［3］和2020年版《中国药典》^［4］的相关规定，需对以上8种有机溶剂的残留量进行检测和控制。但是，目前尚未见艾曲波帕原料药中残留溶剂测定的文献报道。本研究拟建立同时测定艾曲波帕原料药中甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶残留量的顶空气相色谱法，以保证该原料药的安全和质量可控。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

安捷伦7890B气相色谱仪（含火焰离子化检测器）和7694E顶空进样器购自美国Agilent公司；XS105DU型电子天平购自梅特勒-赛多利斯科学仪器公司。

艾曲波帕原料药（批号231208、231221和240105）为湖北丽益医药科技有限公司制备；N-甲基吡咯烷酮（NMP，色谱纯）购于上海易恩化学技术有限公司；氨水（优级纯）购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶（色谱纯）购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：毛细管色谱柱DB-1（30 m×0.53 mm×2.65 μm）；程序升温：初始温度40 ℃，维持6 min，以5 ℃/min的速率升温至80 ℃，维持2 min，再以20 ℃/min的速率升温至240 ℃，维持2 min；进样口温度为250 ℃；检测器温度为250 ℃；载气为高纯氮气，流速为2.5 mL/min；分流模式进样，进样体积为1.0 mL，分流比为10∶1；顶空瓶平衡温度为90 ℃，定量环温度为105 ℃，传输线温度为115 ℃，平衡时间为25 min。

1.2.2 溶液配制

（1）空白溶液：N-甲基吡咯烷酮（NMP）-氨水混合溶液（V_NMP∶V_氨水=70∶30）。

（2）混合对照品储备液：精密称取甲醇300 mg、乙醇500 mg、二氯甲烷60 mg、乙酸乙酯500 mg、四氢呋喃72 mg、三乙胺500 mg、正庚烷500 mg和吡啶20 mg，置于200 mL容量瓶中，用NMP稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。

（3）混合对照品溶液：精密量取混合对照品储备液2.0 mL，置20 mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

（4）供试品溶液：取艾曲波帕乙醇胺原料药约0.1 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，精密加入空白溶液2.0 mL，立即密封。

1.2.3 专属性试验

精密量取“1.2.2”项下的空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各2.0 mL，分别置于20 mL顶空瓶中，立即密封，并按照“1.2.1”项下色谱条件进样，记录各色谱图。

1.2.4 线性和范围

精密量取混合对照品储备液1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，20.0 mL，分别置于不同的50 mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的线性溶液。精密量取各线性溶液2.0 mL，分别置于20 mL顶空瓶中，立即密封，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.2.5 检测限和定量限

取“1.2.2”项下混合对照品溶液采用逐级稀释法进样，计算各残留溶剂色谱峰的信噪比，以信噪比3∶1对应的浓度作为检测限，以信噪比10∶1对应的浓度作为定量限。

1.2.6 精密度试验

精密量取“1.2.2”项下的混合对照品溶液2.0 mL，置于20 mL顶空瓶中，立即密封。平行配制6份，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录各色谱图。

1.2.7 重复性试验

按“1.2.2”项下制备艾曲波帕乙醇胺原料药供试品溶液（批号为231208），平行配制6份，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定。

1.2.8 加样回收率试验

精密称取0.1 g艾曲波帕乙醇胺原料药9份（批号为231208），置于20 mL顶空瓶中，分别加入各对照品适量，使之相当于各残留溶剂限度的50%，100%，150%，每组各3份，立即密封。按“1.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以外标法计算各残留溶剂的浓度，计算回收率。

1.2.9 稳定性试验

精密量取“1.2.2”项下的混合对照品溶液2.0 mL，置于20 mL顶空瓶中，立即密封。平行配制6份，在室温放置，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h和30 h，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录各色谱图。

1.2.10 样品测定

按照“1.2.2”项下的方法制备艾曲波帕乙醇胺原料药供试品溶液（批号为231208、231221和240105），采用顶空进样法测定3批样品中各残留溶剂的含量。其限度参照《中国药典》2020年版四部通则0861。

2 结果

2.1 专属性试验

空白溶液对检测无干扰，甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶依次出峰，8种溶剂均达到基线分离（见图1）。结果表明，该方法专属性良好。

2.2 线性和范围

在验证浓度范围内，8种溶剂线性关系良好，相关系数r均大于0.999（见表1）。

2.3 检测限和定量限

8种溶剂的检测限为0.25~2.5 μg/mL，定量限为0.75~7.6 μg/mL（见表2）。结果表明，该方法检测灵敏度高，能准确检测上述8种溶剂的含量。

2.4 精密度试验

甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶峰面积的RSD分别为2.1%，1.8%，2.0%，1.3%，2.5%，2.4%，2.9%，3.7%，RSD值均小于5.0%，结果表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

乙醇峰面积的RSD值为2.1%，其他溶剂未检出，表明本方法重复性好。

2.6 加样回收率试验

甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷、吡啶的平均回收率分别为102.4%，101.7%，101.6%，100.6%，101.4%，98.2%，100.7%和99.9%；RSD值分别为1.9%，1.7%，1.9%，1.7%，2.1%，1.9%，1.5%和1.5%（见表3）。结果表明，以上8种溶剂的平均回收率均符合药典规定，该方法准确度高。

2.7 稳定性试验

混合对照品溶液在6个时间点测得的结果基本一致，峰面积的RSD分别为2.5%，2.4%，2.7%，1.6%，3.1%，2.9%，3.2%，3.8%，结果表明，混合对照品溶液在30 h内稳定。

2.8 样品测定

3批样品中乙醇的检出量为0.013%~0.021%，其他溶剂均未检出（见表4）。根据湖北丽益医药科技有限公司提供的艾曲波帕合成工艺可知，乙醇为最后使用的溶剂，故存在微量残留，其残留量低于2020年版《中国药典》规定的限度。

3 讨论

在艾曲波帕原料药制备工艺中，使用了8种有机溶剂，但目前尚未见有关艾曲波帕原料药中残留溶剂测定的文献报道。故本研究根据艾曲波帕原料药和残留溶剂的理化性质，对其测定方法从进样方式、色谱柱、溶样溶剂、顶空瓶平衡温度和时间方面进行了优化。

3.1 进样方式的选择

目前残留溶剂测定多采用顶空进样法，该方法干净、快速，可大大减少溶解样品的溶剂和样品本身对色谱系统的干扰和污染。本研究中各待测残留溶剂沸点较低，故选择采用顶空进样。

3.2 色谱柱的选择

本研究预试验分别考察了非极性毛细管色谱柱DB-1（30 m×0.53 mm×2.63 μm）、中等极性毛细管色谱柱DB-624（30 m×0.53 mm×3 μm）和强极性毛细管色谱柱DB-WAX（30 m×0.53 mm×1.00 μm）的性能。三乙胺为碱性物质，易与中等极性和强极性色谱柱中的极性基团作用，在DB-624和DB-WAX毛细管色谱柱条件下峰型拖尾严重，无法与正庚烷达到基线分离，而在DB-1毛细管色谱柱条件下峰型较好，分离度符合要求，故选用DB-1毛细管色谱柱。

3.3 溶剂的选择

3.3.1 基于改善正庚烷检验重现性的溶剂选择

目前溶剂残留测定常用的溶剂为水、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）。然而，待测残留溶剂中的正庚烷为疏水性非极性溶剂，与水、DMF、DMSO均不互溶，难以均匀地分散于上述溶剂体系中，测定误差较大。在DMF和DMSO中加入适量异丙醇，可一定程度上提高正庚烷的溶解性，但异丙醇干扰待测溶剂二氯甲烷的测定，故水、DMF和DMSO均不适合作为本方法的溶剂。经查阅文献^［5］，NMP沸点比DMF和DMSO更高，且与正庚烷互溶，因此选择NMP作为本方法的溶剂。

3.3.2 基于改善三乙胺回收率的溶剂选择

当采用NMP做溶剂时，待测残留溶剂中的三乙胺加样回收率不合格，但不加样时，其回收率符合要求。艾曲波帕原料药为乙醇胺盐，其结构中含有羧基，三乙胺可能与其反应，生成三乙胺盐，从而导致三乙胺加样回收率不合格。在NMP中加入适量NaOH溶液，三乙胺的加样回收率得到改善，但检测图谱中出现了新的杂质峰。可能因为NMP在高温强碱条件下易分解，NMP在顶空瓶平衡过程中可能发生了分解，从而产生新的杂质。

经查阅文献^［6］，在NMP中加入碱性相对弱的氨水，既可改善三乙胺的回收率又不会引起NMP水解。故在NMP中加入一定量的氨水，配制NMP-氨水混合溶液（V_NMP∶V_氨水=70∶30）作为溶剂进行试验。试验结果表明，三乙胺加样回收率符合要求，且未出现新的杂质峰，因此选择NMP-氨水混合溶液（V_NMP∶V_氨水=70∶30）作为本方法的溶剂。

3.4 顶空瓶平衡温度和平衡时间的选择

顶空条件筛选采用单因素考察方法。平衡时间30 min，考察顶空瓶平衡温度80，85，90，95，100 ℃，结果表明，平衡温度越高，吡啶峰面积越大，但当平衡温度达到90 ℃后，继续升高平衡温度，吡啶峰面积基本不变。考虑到NMP在碱性条件下温度越高越容易水解，故选择90 ℃作为顶空瓶平衡温度。

顶空瓶平衡温度90 ℃，考察平衡时间15，20，25，30 min。试验结果表明，平衡时间越长，吡啶峰面积越大，但当平衡时间达到25 min后，继续延长平衡时间，吡啶峰面积基本不变。考虑到NMP在碱性条件下反应时间越长水解程度越高，故选择25 min作为平衡时间。

综上，本研究成功建立了同时测定艾曲波帕原料药中甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、正庚烷和吡啶残留量的顶空气相色谱法，有效解决了三乙胺峰型差、回收率低和正庚烷检测重现性差等问题。经方法学验证，该方法专属性强、灵敏度高、测定结果准确稳定。该方法不仅可用于艾曲波帕原料药中残留溶剂的质量控制，也可为含有酸根药物中碱性残留溶剂的测定提供借鉴。

参考文献

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(32300641)

山西省应用基础研究面上项目(202103021224238)

山西省留学人员科技活动择优资助项目(20230024)

山西省回国留学人员科研资助项目(2022-118)