一个Smith⁃Kingsmore综合征MTOR基因遗传变异分析

Analysis of MTOR genetic variations in Smith⁃Kingsmore syndrome

摘要

目的 研究MTOR基因c.4445G>C（p.R1482P）变异在史密斯-金斯莫综合征（Smith-Kingsmore syndrome， SKS）中的致病作用，并探讨其遗传学意义。 方法 收集SKS患儿及其父母的外周血样本，进行全外显子组测序（whole exome sequencing， WES）筛查致病基因，并采用Sanger测序进行验证。结合生物信息学分析预测突变的致病性，并评估其蛋白结构变化。 结果 WES测序发现先证者MTOR基因存在c.4445G>C（p.R1482P）杂合突变，Sanger测序证实该突变为新发突变。生物信息学分析显示该变异可能破坏mTOR蛋白的结构与功能，符合致病性突变标准（PS2+PM2_Supporting+PS4_Supporting+PP3_Mo⁃derate）。　结论　 MTOR基因c.4445G>C（p.R1482P）突变可能是SKS的致病因素。本研究发现的突变扩展了SKS的变异谱，并为临床遗传咨询和早期诊断提供了新的证据。

Abstract

Objective To investigate the pathogenic role of MTOR gene c.4445G>C（p.R1482P） variant in Smith-Kingsmore syndrome（SKS） and explore its genetic significance. Methods Peripheral blood samples of the proband with SKS and their parents were collected to screen the causative genes by whole exome sequencing（WES）， and validated by Sanger sequencing. Bioinformatics analysis was combined to predict the pathogenicity of the mutations and assess their protein structural changes. Results WES sequencing identified a c.4445G>C（p.R1482P） heterozygous mutation in the MTOR gene of the proband， and Sanger sequencing confirmed the mutation as de novo. Bioinformatics analysis showed that the mutation may disrupt the structure and function of the mTOR protein and meets the criteria for a pathogenic mutation（PS2+PM2_Supporting+PS4_Supporting+PP3_Moderate）. Conclusion The MTOR gene c.4445G>C（p.R1482P） mutation may be a pathogenic factor of SKS. The mutations identified in this study extend the spectrum of variants in SKS and provide new evidence for clinical genetic counseling and early diagnosis.

Graphical abstract

关键词

史密斯-金斯莫综合征（SKS） / 全外显子测序（WES） / MTOR基因 / 错义突变 / Sanger测序 / 显性遗传

Key words

Smith-Kinsmore syndrome （SKS） / whole exome sequencing（WES） / MTOR gene / missense mutation / Sanger sequencing / dominant

Smith-Kingsmore综合征（SKS）是一种罕见的常染色体显性遗传病，由MTOR基因突变导致，其主要临床表现包括智力障碍、巨脑畸形、癫痫、特征面容以及运动和语言发育迟缓^［1，2］。Smith等^［3］在2013年首次报道MTOR基因变异会导致一种大脑过度生长伴智力障碍综合征，并将其命名SKS。MTOR基因编码哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），该蛋白在PI3K/Akt/mTOR信号通路中起关键作用，调控细胞生长、代谢、自噬和蛋白合成。既往研究发现，SKS相关MTOR突变主要集中在激酶结构域和FAT结构域^［2，4］。本研究采用WES技术，对1例SKS患儿进行致病基因筛查，并通过Sanger测序验证突变。结合生物信息学分析，探讨MTOR基因c.4445G>C （p.R1482P）新发突变致SKS患儿的遗传学病因，以期提高临床医师对SKS的认识，为临床诊断和遗传咨询提供新的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

患儿，4岁5个月，男，因其癫痫，智力低下，大头畸形，睡眠障碍和吐字不清于2024年5月来运城妇幼保健院儿保科就诊。患者的父母和其姐姐无临床表型，父母非近亲结婚且双方家族成员内无类似表型。该研究经运城市妇幼保健医院伦理委员会批准（YC⁃FYBJ2024035），患者和家属均签署知情同意书。

1.2 实验室检查和治疗

1.2.1 一般资料

患儿有癫痫症状，患儿抽搐发作形式为意识丧失、双眼向右侧凝视、四肢松软、双手握拳持续30ｓ后自行缓解，每月发作2~3次。患儿运动、认知及语言均落后，患儿8月龄会坐，13月龄会爬，1岁6月龄会走。患儿系母亲第2胎第2产，足月剖宫产出生，出生体质量3.1 kg，头围39.1 cm，否认缺氧病史、生后窒息。患儿父母体健，非近亲婚配，否认有类似疾病家族史。父母否认接触有毒有害物质及放射线、母亲怀孕期间没有感冒咳嗽等原因而服用药物，孕中后期多次产检胎儿彩色超声均提示头围大于胎龄。

1.2.2 体格检查

患儿，4岁5个月，身高107 cm，体质量17.9 kg，头围50.5 cm，特殊面容（前额略突出、双眼眼距宽、鼻梁凹陷、人中平滑），营养中等，四肢肌力正常，肌张力稍低，未见异常姿势，生理反射存在，病理反射未引出。可独走，不会跑，仅能说几个简单字汇，仅能听从简单指令，复杂指令理解差。

1.2.3 辅助检查

颅脑MRI平扫示：松果体区异常信号，囊肿；双侧额顶叶白质少许异常信号，考虑为局部髓鞘化不良；双侧脑室旁及半卵圆中心多发血管周围间隙；双侧脑室形态欠规则，考虑为先天发育不全；左侧颞部脑外间隙增宽；垂体柄右偏；蝶窦少许炎症，双侧下鼻甲黏膜增厚；腺样体增厚。患儿睁闭眼试验：α抑制不完全。婴幼儿智能发育测试示：中度落后，发育商68。脑电图示：异常儿童脑电图，基本节律8~9 Hz，10~70 μV脑波，波形、节律、调幅均可，两侧对称。所有记录导联可见有多量低压快活动。两侧各导联屡见有尖慢复合波爆发，时左时右，以左侧中央为著。彩超，胸部DR摄影，12导联心电图，结果无异常。实验室检查：血常规、尿常规、生化、甲状腺、肾上腺和便常规结果无异常。

1.2.4 治疗方案

住院期间静脉输注抗癫痫药物左乙拉西坦和丙戊酸钠，偶然出现惊厥，予抗惊厥治疗，口服苯巴比妥治疗下偶有惊厥发作，患儿偶有抽搐发作，经调整抗癫痫药物剂量后一般情况良好，无发热、无呕吐无抽搐，复查肝功能等指标正常，予以出院。

1.3 分子遗传学检查

1.3.1 样本收集及DNA抽提

根据患儿临床特征及辅助检查高度怀疑遗传学疾病可能，经患儿监护人知情同意后抽取患儿及父母EDTA抗凝外周血各两管，每管各2~3 mL。采用外周血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取DNA，按说明书操作。DNA的浓度及纯度质控标准为DNA浓度>30 ng/μL，总量>5 μg，A260/A280比值范围在1.8~2.0之间，-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 WES测序及基因突变分析

将患儿的EDTA抗凝2 mL外周血送至深圳安吉康尔科技有限公司，使用Qiagen公司 QIAamp DNA Mini试剂盒，从全血中提取基因组DNA并构建DNA文库，用捕获芯片将目标区域的DNA片段进行富集后再借助高通量WES测序平台进行测序。然后运用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）软件与hg19比对得到所有变异位点，再用SOAPsnp和Genome Analysis Toolkit（GATK）软件对其中的SNP、InDel位点进行鉴别。再通过ANNOVAR 软件对所有的SNV和INDEL进行注释，同时参考dbSNP147、HapMap、ESP6500和千人基因组数据库对变异位点行进一步筛选。测序结果与基因组GRCh37标准序列进行比对分析获得基因突变情况。查询ClinVar和HGMD数据库有无该突变的致病性报道。采用PROVEAN、PolyPhen2、Mutation Taster和SIFT在线预测工具对错义变异进行致病性预测、保守性预测和蛋白功能预测。利用PCR和Sanger测序验证对患儿及其父母的相应致病基因位点进行共分离验证。测序平均深度为116×，大于20×的reads达到97%以上。

1.3.3 Sanger测序验证

引物序列使用Primer Premier 6.0软件设计，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。序列覆盖MTOR基因外显子上的突变位点及其侧翼序列（上游引物：5′-GTGAAGGCCT-TCCTACTTAGCA-3′，下游引物：5′-ATGGACACCAACAAGGACGAC-3′），使用Hot Start DNA polymerdse对目标区域进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×Mix 20 μL，基因组DNA（20 ng/μL）1 μL，上下引物（10 pmol/μL）各1 μL，补水至40 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性4 min，然后95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环后于72 ℃延伸4 min，产物长度为274 bp。PCR产物纯化后采用ABI BigDye3.1测序试剂盒，在ABI3130基因测序仪（美国ABI）上对产物直接进行测序，测序结果与标准序列进行比对分析。

1.3.4 分子对接及蛋白保守性预测

使用PyMol进行分子对接的可视化，该工具不仅能够渲染高质量的三维分子结构，还能通过多种视图和展示方式深入分析分子间的相互作用；运用UGENE软件对目标蛋白质的保守性进行预测，涉及到对多序列比对的分析，以识别在不同物种中保守的氨基酸残基。

2 结果

2.1 患儿及其父母的基因突变结果

WES发现患儿基因MTOR在第30号外显子处存在c.4445G>C杂合突变，即在基因编码区第4445位核苷酸处的鸟嘌呤（G）突变为胞嘧啶（C），但患者父亲（Ⅱ-1）、母亲（Ⅱ-2）和姐姐（Ⅲ-1）均未发生该突变（见图2）。该位点可能为患儿自发体细胞突变。

2.2 突变位点致病性分析预测结果

先证者存在MTOR：c.4445G>C（p.R1482P）杂合突变，突变分析其基因为错义突变，使MTOR基因cDNA的外显子4445位点G核苷酸突变为C核苷酸，即由精氨酸变成脯氨酸，可能影响蛋白功能（见图3）；ClinVar和OMIM数据库均仅见1例该位点报道。经dbSNV_ADA、dbSNV_RF、mmsplice以及Spidex-Zscore软件的预测分值提示MTOR基因c.4445G>C变异为致病变异（PS2+PM2_Supporting+PS4_Supporting+PP3_Moderate）。该位点在国内未见相关报道。

2.3 蛋白结构域结果

MTOR的结构域主要包括F594S和C606R两个人类核心区域，此外还涵盖FAT和FATC结构域（见图4）。在研究中，重点关注的变异位点（标记为*）集中在激酶区域及其邻近的调控区域。其中，R1482P是本次研究的关键位点之一，位于激酶区域，可能影响蛋白的酶活性和结构稳定性。其他与SKS相关的变异还包括E1442L、R1482C、C1483Y、I1973F等，这些突变主要分布在激酶区域及调控区。

2.4 蛋白保守性分析结果

MTOR c.4445G>C在人、家鼠、沟鼠、原鸡、斑马鱼等物种中高度保守（见图5）。

3 讨论

SKS是一种罕见的常染色体显性遗传病，由MTOR基因的杂合突变引起。该疾病的主要临床特征包括智力发育迟滞、巨脑畸形、癫痫、特征性面容、语言和运动发育迟缓^［5］。近年来的研究表明，MTOR基因在PI3K/Akt/mTOR信号通路中发挥核心作用，该信号通路的异常激活可能是SKS发病的关键机制^［6］。MTOR基因位于1p36染色体区域，全长约156 kb。mTOR蛋白由2 549个氨基酸组成，分子量约为300 kDa。它主要由以下结构域组成：HEAT重复结构域（负责蛋白-蛋白相互作用）、FAT结构域（维持蛋白稳定性）、FRB结构域（雷帕霉素结合区域）、激酶结构域（负责信号转导）以及FATC结构域（调控激酶活性）^［7］。mTOR蛋白主要通过两种蛋白复合体mTORC1和mTORC2发挥生理功能，其中mTORC1主要调控细胞生长和代谢，而mTORC2则涉及细胞存活和细胞骨架动态变化^［8］。

在SKS患者中，MTOR基因的突变大多位于FAT区、激酶结构域或FRB结构域，导致mTORC1/2复合物异常激活，进而影响神经发育、细胞增殖和代谢调控^［9］。Liu等^［10］报告73例SKS患者，有26个突变体，主要位于mTOR蛋白的FRAP、ATM、TRAP（FAT）和激酶（KD）结构域。至今已报道101例SKS患者30个致病突变位点，主要集中在MTOR基因的特定区域，尤其是与mTOR蛋白功能相关的关键结构域，并且表现多为错义突变，部分突变位点表现出“功能获得”（gain-of-function， GOF），即增强了mTORC1/2的活性，导致过度的神经元增殖和分化异常^［11］。Besterman等^［11］通过结构分析发现，某些突变（如Q2524K）破坏了FAT和KD结构域中的α螺旋结构，确认其为致病变异。Liu等^［10］则体外构建了5种突变体，发现它们均增加了mTOR的活性，其中R1480-C1483突变表现出最高活性，G2464V最低。此外，所有突变体都通过用含有高葡萄糖、氨基酸和血清的完整培养基重新刺激而完全激活，与WT相似。研究显示，大部分致病性MTOR突变（包括c.5395G>A/p.Glu1799Lys）会破坏脂肪结构域中的α螺旋堆积，造成蛋白功能获益^［11-14］。FAT结构域突变还可改变蛋白的空间结构，增强其与下游信号分子的结合能力，从而引发信号通路的异常激活^［15］。此外，mTOR信号通路的过度激活已被证实与神经发育障碍、癫痫和巨脑畸形密切相关^［16］。本研究发现的c.4445G>C（p.R1482P）突变位于FAT结构域α螺旋核心附近。FAT区通过与mLST8及Raptor/Rictor等结合，调控mTORC1/2的组装与空间稳定性。进一步采用PyMOL软件进行蛋白结构建模，R1482P替代将引发局部构象扰动，降低FAT区与下游TSC2或Akt间的结合亲和力。因此，该突变可能通过增强mTOR自激活或降低其负调控，造成mTORC1/2持续激活，从而扰乱皮层神经元增殖与迁移进程。

MTOR基因的c.4445G>C（p.R1482P）突变可能影响MTOR蛋白的结构和功能，从而影响其在mTORC1和mTORC2复合物中的组装、激酶活性或底物结合。其发病机制也可能涉及多基因的复杂相互作用^［17］。具体来说，这个突变可能干扰MTOR与调节蛋白（如raptor、rictor）或底物（如4E-BP1、S6K1）的相互作用，影响下游信号传导，进而调控细胞的生长和自噬过程。此外，突变也可能影响MTOR与上游调控路径（如PI3K/AKT）的关系，导致通路的紊乱。这一突变还可能扰乱其他信号通路（如MAPK、Wnt）的交叉调控。研究上，利用全外显子组测序、RNA-seq和ChIP-seq等方法，有助于识别与MTOR互作的关键基因，如PIK3CA、AKT1、TSC1/2、RHEB和DEPDC5，有助于深入理解SKS的遗传机制和开发新疗法。这些基因的突变或调控异常可能共同影响疾病表现，但需要进一步验证。

目前，SKS的治疗主要以对症治疗为主，针对癫痫、智力发育迟滞和运动障碍等核心症状进行干预。mTOR信号通路异常激活是SKS发病的关键机制，因此mTOR抑制剂（如雷帕霉素及其衍生物依维莫司）被认为是潜在的治疗策略^［18］。已有研究表明，雷帕霉素可通过抑制mTORC1活性，改善SKS患者的癫痫发作和神经认知功能^［19］。虽然雷帕霉素、西罗莫司和依维莫司等mTOR抑制剂已应用于临床，但其长期效果、安全性和副作用尚不明确，可能引发代谢异常^［20］、免疫抑制^［21］、生长发育问题^［22］及其他不良反应^［23］。基因治疗是一种具有巨大潜力的SKS治疗方法，旨在纠正MTOR基因的突变或引入功能正常的MTOR基因拷贝，未来有望实现治愈。作为替代或辅助治疗，基因治疗（如CRISPR-Cas9）和干细胞治疗也显示出潜在的应用前景^［24］，前者旨在修正突变，后者则利用干细胞的再生能力改善症状^［25］。此外，GLP-1受体激动剂和中医药等也被探索用于相关症状的缓解。虽然基因治疗在其他遗传疾病中的应用已显示出潜力，但针对SKS的基因治疗目前仍处于早期研究阶段，尚未开展临床试验。然而，随着CRISPR-Cas9等基因编辑技术的不断进步，基因治疗未来有望为SKS患者提供一种潜在的根本性治疗方案。未来的研究应集中于开发更安全有效的基因和干细胞疗法，评估其长期效果，并结合多种治疗方式，提供更全面的治疗方案，从而改善SKS患者的生活质量。本研究中，先证者表现出典型临床特征，住院期间，给予抗癫痫药物治疗后，癫痫发作有所减少。考虑到mTOR过度激活的机制，随后尝试低剂量雷帕霉素治疗，患者的病情进一步改善。

鉴于SKS作为一种遗传疾病，其发生频率在不同地域和人群中存在差异，国外此疾病的发病率相对较高，而在国内则相对罕见。因此，建立针对该疾病的基因诊断与早期筛查策略，应以“技术与临床需求的紧密结合”为核心原则，采取“突变谱分析、技术方案优化以及临床验证”的循环流程。结合高通量测序、生物信息学分析以及POCT等先进技术，打造标准化、易于推广的筛查体系。未来，应进一步整合单细胞测序技术，用于解析不同组织中的特异性突变，同时结合人工智能辅助诊断，以提升变异解读的效率。这样将推动筛查技术朝着“高精度、快速、低成本”的方向发展，为SKS患者的早期干预提供坚实的技术基础。结合基因型-表型的关联信息指导个体化治疗，可根据突变类型的不同，预测治疗反应。例如，携带截短突变的患者通常对mTOR抑制剂表现出良好的敏感性，而错义突变患者可能需要联合药物疗法以获得更佳的治疗效果。对于具有获得性功能突变的病例，可以采用反义寡核苷酸（ASO）技术，设计靶向干预策略。同时，利用依维莫司等药物对与MTOR突变相关的通路在体外的实验数据进行分析，有助于开发更具针对性的药物，从而依据突变类型制定个性化治疗方案。

综上，本研究采用全外显子组测序（WES）结合Sanger测序，在1例SKS患儿中鉴定出MTOR基因的c.4445G>C（p.R1482P）错义突变，并通过生物信息学分析及蛋白结构预测，证实该突变具有潜在的致病作用。此外，研究表明该突变可能通过影响mTORC1/2信号通路的调控，从而引发神经发育方面的异常。这些研究结果为SKS的早期诊断和分子层面的治疗策略提供了新的思路，为遗传咨询及个体化治疗方案的制定奠定一定的理论基础。

参考文献

[1] Poole RL， Curry PDK， Marcinkute R， et al. Delineating the Smith⁃Kingsmore syndrome phenotype： Investigation of 16 patients with the MTOR c.5395G>A p.（Glu1799Lys） missense variant［J］. Am J Med Genet A，2021，185（8）：2445-2454.

[2] Ozdemir Y， Cag M， Dundar M， et al. Two pathogenic variants in two ultra rare syndromes； Smith⁃Kingsmore syndrome and rubinstein taybi syndrome type2［J］. Int J Innovative Res Med Sci， 2022，7（2）：100-106.

[3] Smith LD， Saunders CJ， Dinwiddie DL， et al. Exome sequencing reveals de novo germline mutation of the mammalian target of rapamycin（MTOR） in apatient with megalencephaly and intractable seizures［J］. J Genomes Exomes，2013，2：63-72..

[4] Li Q， Li Z， Luo T， et al. Targeting the PI3K/AKT/mTOR and RAF/MEK/ERK pathways for cancer therapy［J］. Mol Biomed， 2022，3（1）：47.

[5] Carli D， Ferrero GB， Fusillo A， et al. A new case of Smith⁃Kingsmore syndrome with somatic MTOR pathogenic variant expands the phenotypic spectrum to lateralized overgrowth［J］. Clin Genet，2021， 99（5）：719-723.

[6] Gordo G， Tenorio J， Arias P， et al. mTOR mutations in Smith⁃Kingsmore syndrome： four additional patients and a review［J］. Clin Genet，2018，93（4）：762-775.

[7] Rostamzadeh D， Yousefi M， Haghshenas MR， et al. mTOR signaling pathway as a master regulator of memory CD8⁺ T⁃cells， Th17， and NK cells development and their functional properties［J］. J Cell Physiol，2019，234（8）：12353-12368.

[8] Fu W， Wu G. Targeting mTOR for anti⁃aging and anti⁃cancer therapy［J］. Molecules，2023，28（7）：3157.

[9] Szwed A， Kim E， Jacinto E. Regulation and metabolic functions of mTORC1 and mTORC2［J］. Physiol Rev，2021，101（3）：1371-1426.

[10] Liu AC， Shen Y， Serbinski C， et al.Clinical and functional stu⁃dies of MTOR variants in Smith⁃Kingsmore syndrome reveal deficits of circadian rhythm and sleep⁃wake behavior［J］. HGG Adv， 2024，5（4）：33-49.

[11] Besterman AD， Althoff T， Elfferich P，et al.Functional and structural analyses of novel Smith⁃Kingsmore syndrome⁃associated MTOR variants reveal potential new mechanisms and predictors of pathogenicity［J］. PLoS Genetics，2021，17（7）：e1009651.

[12] Grabiner BC， Nardi V， Birsoy K，et al.A diverse array of cancer⁃associated MTOR mutations are hyperactivating and can predict rapamycin sensitivity［J］. Cancer Discov，2014，4（5）：554-563.

[13] Møller RS， Weckhuysen S， Chipaux M，et al. Germline and somatic mutations in the MTOR gene in focal cortical dysplasia and epilepsy［J］. Neurol Genet，2016，2（6）：118-129.

[14] Mirzaa GM， Campbell CD， Solovieff N， et al.Association of MTOR mutations with developmental brain disorders， including megalencephaly， focal cortical dysplasia， and pigmentary mosai⁃cism［J］.JAMA Neurol，2016，73（7）：836-845.

[15] Li Y， Cheng Y， Zhou Y， et al. High fat diet⁃induced obesity leads to depressive and anxiety⁃like behaviors in mice via AMPK/mTOR⁃mediated autophagy［J］. Exp Neurol，2022，348：113949.

[16] Ryther RC， Wong M. Mammalian target of rapamycin （mTOR） inhibition： potential for antiseizure， antiepileptogenic， and epileptostatic therapy［J］. Curr Neurol Neurosci Rep，2012，12（4）：410-418.

[17] Rodríguez⁃García ME， Cotrina⁃Vinagre FJ， Bellusci M， et al. A novel de novo MTOR gain⁃of⁃function variant in a patient with Smith⁃Kingsmore syndrome and antiphospholipid syndrome［J］. Eur J Hum Genet， 2019， 27（9）： 1369-1378.

[18] Cunningham JT， Rodgers JT， Arlow DH，et al.mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1⁃PGC⁃1alpha transcriptional complex［J］. Nature，2007，450（7170）：736-740.

[19] Rastogi R， Jiang Z， Ahmad N，et al.Rapamycin induces mitogen⁃activated protein（MAP） kinase phosphatase⁃1 （MKP⁃1） expression through activation of protein kinase B and mitogen⁃activated protein kinase kinase pathways［J］. J Biol Chem，2013，288（47）：33966-33977.

[20] Mulder FVM， Peeters EFHI， Westerink J， et al. The long⁃term effect of mTOR inhibition on lipid and glucose metabolism in tuberous sclerosis complex： data from the Dutch TSC Registry ［J］. Orphanet J Rare Dis，2022，17（1）：252.

[21] Wei X， Weber S， Yin D， et al. Pharmacodynamic effect of mTOR inhibition⁃based immunosuppressive therapy on T⁃ and B⁃cell subsets after renal transplantation［J］. Transplant Direct， 2024， 10（7）： e1666.

[22] Kranz B， Wingen AM， Vester U， et al. Long⁃term side effects of treatment with mTOR inhibitors in children after renal Transplantation［J］. Pediat Nephrol， 2013， 28（8）： 1293-1298.

[23] Sadowski K， Kotulska K， Jóźwiak S. Management of side effects of mTOR inhibitors in tuberous sclerosis patients［J］. Pharmacol Rep， 2016， 68（3）： 536-542.

[24] Rodríguez⁃Merchán EC， De Pablo⁃Moreno JA， Liras A. Gene therapy in hemophilia： recent advances［J］. Inte J Mol Sci， 2021， 22（14）： 7647.

[25] Isali I， Wong TR， Hijaz A. Stem cell and neural progenitor cell therapy for neurogenic bladder⁃Where are we in 2023？［J］. Curr Bladder Dysfunct Rep， 2024， 19（2）： 203-210.