抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白单链抗体库的构建

Construction of single chain antibody library against spike S protein of COVID-19 mutant JN. 1

摘要

目的 构建抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白的单链抗体库。 方法 新冠病毒变异株刺突S蛋白抗原免疫Balb/c小鼠，提取脾脏RNA，PCR扩增出单链抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），重叠延伸PCR构建scFv基因，将其插入噬菌体载体pCANTAB5E构建重组质粒，转入E.coli TG1感受态细胞，建立噬菌体展示pCANTAB5E-scFv抗体库。经培养获得初级噬菌体抗体库并测定其库容，随机挑选出单克隆抗体库进行PCR鉴定，进行多轮扩增与淘选，选择抗原亲和力最强的克隆进行测序分析和ELISA鉴定。 结果 经琼脂糖电泳发现在250~500 bp之间出现目的条带，VH和VL片段样本长度分别为360 bp和339 bp，与预期长度相符；重叠延伸PCR构建scFv长度与预期片段792 bp大小相符。菌落PCR扩增鉴定重组率为90%，初级噬菌体抗体库库容为5×10¹² cfu，经过4轮筛选富集后抗体库库容为2×10^-6 cfu。重组质粒测序结果显示，scFv大小为792 bp，共编码264个氨基酸，通过VBASE2数据库分析抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白单链抗体VH和VL基因序列都存在3个互补决定区（CDR）和4个骨架区（FR）。经ELISA检测后，筛选出3株阳性克隆噬菌体。 结论 本研究成功制备新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白单链抗体库，为进一步研究感染新冠病毒变异株JN.1的诊断和靶向生物治疗奠定基础。

Abstract

Objective To construct a single chain antibody library against spike S protein of COVID-19 variant JN.1. Methods Balb/c mice were immunized with the spike S protein antigen of the novel coronavirus variant， and then spleen RNA was extracted. Heavy chain variable region（VH） and light chain variable region（VL） genes of the single chain antibody were amplified by PCR， and the scFv gene was constructed by overlapping extension PCR. The scFv gene was inserted into the phage vector pCANTAB5E to construct a recombinant plasmid， and then the recombinant plasmid was transferred into E. coli TG1 competent cells to establish a phage display pCANTAB5E scFv antibody library. The primary phage antibody library was obtained after culture， and its capacity was determined. The monoclonal antibody library was randomly selected for PCR identification， followed by multiple rounds of amplification and selection. The clone with the strongest antigen affinity was selected for sequencing analysis and ELISA signature. Result The target band was observed at 250-500 bp in the gel electrophoresis. The VH and VL fragment samples were consistent with the expected lengths of 360 bp and 339 bp， respectively. The length of the scFv constructed by overlapping extension PCR was consistent with the expected fragment size of 792 bp. The recombination rate identified by colony PCR amplification was 90%， and the capacity of primary phage antibody library was 5×10¹² cfu. After 4 rounds of screening and enrichment， the storage capacity reached 2×10^-6 cfu. The sequencing results of the recombinant plasmid showed that scFv was 792 bp and encoded 264 amino acids. Through VBASE2 database analysis， the VH and VL gene sequences of the single chain antibody against the spike S protein of COVID-19 variant JN. 1 had three complementary determining regions and four skeleton regions. Three positive cloned bacteriophages were screened by ELISA method. Conclusion The single chain antibody library of spike S protein of COVID-19 variant JN.1 is successfully prepared in this study， which lay the foundation for further research on the diagnosis and targeted biological therapy of COVID-19 variant JN.1 infection.

Graphical abstract

关键词

JN.1变异株 / 刺突蛋白（S蛋白） / 单链抗体（scFv） / 抗体库构建 / 噬菌体展示技术 / 高通量筛选 / 中和抗体

Key words

SARS-CoV-2 variant JN.1 / spike S protein / single-chain antibody（scFV） / antibody library construction / phage display technology / high-throughput screening / neutralizing antibody

严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的COVID-19疫情，已对人类生命健康造成严重影响。然而目前尚缺乏针对SARS-CoV-2的特效药物。SARS-CoV-2进入细胞是依靠病毒表面刺突蛋白（spike protien，S）与人血管紧张素转化酶2（human angiotensin converting enzyme 2，hACE2）相互作用介导的^［1，2］。S蛋白是SARS-CoV-2吸附、融合和穿入宿主细胞内最重要的结构蛋白，故S蛋白是研制针对冠状病毒抑制剂、疫苗及抗体的优选靶标^［3］。

目前，对抗新冠病毒刺突S蛋白抗体的研究主要是多克隆抗体和单克隆抗体^［4，5］。由于人体免疫系统对单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）恒定区的识别会导致人抗鼠抗体反应，故其实际应用受到限制，目前主要用于疾病的诊断^［6］。然而，针对新冠病毒刺突S蛋白的单链抗体的研究报道并不多见。单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）是通过一段柔性短肽（linker）将抗体质量链可变区（variable region of heavy chain， VH）和轻链可变区（variable region of light chain， VL）连接起来的抗体，保留了抗体与抗原特异性结合位点，同时具有免疫原性低、特异性高、分子量小、渗透性好、半衰期长、能够进行大规模生产等特点^［7］。因此，本研究通过构建针对抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白的单链抗体库，为开发高效、特异的JN.1变异株检测与诊断工具提供了新的单链抗体技术路径。

1 材料与方法

1.1 感受态细胞与实验动物

SPF级Balb/c小鼠，6~8周龄，体质量18~22 g， 购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物使用许可证号SCXK（京）2024-0001，适应性喂养7 d，严格遵循动物实验伦理福利原则，经贵州中医药大学实验动物伦理审查委员会审批（2024F01）；E.coli TG1由义翘神州科技股份有限公司提供。

1.2 主要仪器

酶标仪（型号：Multiskan Fc）、台式冷冻离心机（型号：X4R Pro）购自美国Thermo公司；紫外-可见分光光度计（型号：UV756）购自中国上海佑科仪器公司；PCR仪（批号：A300）购自中国杭州朗基公司；电动移液器（型号：26310）购自德国Brand公司；核酸蛋白检测仪型号：HD-21-1）购自中国上海青浦沪西仪器厂。

1.3 主要试剂

新冠病毒变异株重组JN.1刺突S蛋白（批号：40589-V08H59）购自义翘神州科技股份有限公司；完全弗氏佐剂（批号：F5881）购自美国Sigma公司；不完全弗氏佐剂（批号：263910）购自美国BD公司；TriPure Isolation Reagent试剂购自瑞士Roche公司；反转录试剂盒、NotⅠ酶和 SfiⅠ酶、噬菌体载体pCANTAB5E、Anti-M13酶标二抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、反转录试剂盒购自义翘神州科技股份有限公司；13%蛋白标准（批号：26610）购自美国Thermo公司；7.5%蛋白标准（批号：26614）购自美国Thermo公司；辣根酶标记兔抗小鼠IgG（批号：315-035-047）购自美国Jackson公司；新冠病毒变异株重组JN.1刺突S蛋白阳性血清和阴性血清，由本实验室制备低温保存。

1.4 JN.1刺突S蛋白免疫动物

新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白免疫接种小鼠，免疫原剂量为50 μg/只。首次免疫将S蛋白免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合，制成乳化剂进行腹部皮下多点注射接种；第2次和第3次免疫接种使用弗氏不完全佐剂和S蛋白等体积混匀进行免疫接种。于末次免疫1周后，取小鼠尾静脉采血50~60 μL，4 ℃静置过夜后经4 000 r/min，4 ℃离心15 min，分离血清进行ELISA效价检测。每次免疫间隔时间为2周。

1.5 ELISA检测免疫血清抗体效价

1.5.1 包被抗原最佳工作浓度的确定

参照王由森等^［8］采用方阵滴定进行包被抗原最佳工作浓度的确定，略有改动。用0.05 mol/L碳酸盐（pH=9.6）将新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白稀释成为20，10，5，1 μg/mL 4个浓度包被酶标板，将实验室制备保存的阳性血清和阴性血清按1∶10，1∶100、1∶1 000、1∶10 000和1∶100 000梯度稀释，将辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG用封闭液按1∶8 000稀释，用酶标仪测定OD₄₉₀值。每个效价3次重复，计算平均值。阳性血清OD₄₉₀值（P）、阴性血清OD₄₉₀值（N）比值最大的抗原稀释浓度为最佳工作浓度。

1.5.2 免疫血清抗体效价

以最佳工作浓度的JN.1刺突S蛋白作为抗原包被96孔板酶标板，200 µL/孔，含1%~5% BSA的PBS作为封闭液，4 ℃下包被过夜后，用0.05% Tween-20的PBS（PBST）作为洗涤液，200 μL /孔洗板2次，叩干酶标板，以200 μL/孔封闭液封闭酶标板，室温封闭1 h；用洗涤液按100 μL/孔洗板2次，叩干。免疫小鼠血清按1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600和1∶51 200稀释后作为一抗进行加样，200 μL/孔。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（二抗）（1∶5 000），以200 μL/孔，室温下共同孵育2 h；洗涤液以200 μL/孔洗板5次，叩干，每孔加入100 μL显色液3，3'，5，5'-四甲基联苯二胺（TMB），室温放置12 min后， 每孔加入50 μL终止液（2 mol/L硫酸）终止反应，用酶标仪测OD₄₅₀值。参照倪畅^［9］判断方法，P/N≥2.1的小鼠血清为阳性。本研究优先选择阳性且效价最高的小鼠用于构建噬菌体抗体库。

1.6 扩增抗体的VL和VH

利用TriPure Isolation Reagent试剂盒提取小鼠脾脏RNA，用反转录试剂盒反转录获得cDNA。引用犹桃元等^［10］扩增抗新型冠状病毒S蛋白scFv重组基因的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）引物和程序。通过PCR技术扩增抗体的VL和VH可变区。参照琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒说明书回收VH和VL基因片段。

1.7 重叠延伸PCR扩增scFv、pCANTAB5E-scFv载体的构建及双酶切鉴定

参照犹桃元等^［10］方法扩增抗新型冠状病毒S蛋白scFv基因的引物。将胶回收的VH和VL基因片段采用重叠延伸PCR技术将VL和VH拼接成scFv，NotⅠ酶和SfiⅠ酶切scFv和pCANTAB5E后回收目的片段，T4连接酶连接构建pCANTAB5E-scFv，转入E. coli TG1感受态细胞，涂于SOB-AG上（含有50 mg/L氨苄青霉素、20 g/L葡萄糖）琼脂板上，37 ℃培养过夜。挑取单菌落抽提pCANTAB5E-scFv质粒，按照SfiⅠ酶和NotⅠ酶酶切说明书方法进行双酶切鉴定。

1.8 scFv基因噬菌体抗体库的构建及滴度测定

用2×YT-AG液体培养基洗脱琼脂板上细菌，培养至OD₆₀₀=0.4~0.6，向菌液中加入2×10¹⁰ pfu辅助噬菌体M13KO7，在37 ℃振荡培养1 h后离心，用含100 μg/mL氨苄青霉素培养液10 mL重悬沉淀，37 ℃振荡培养过夜后离心，上清即为噬菌体抗体库。用微孔滤膜（孔径0.45 μm）过滤后，向100 μL的TG1菌液（OD₆₀₀=1）中加入5 μL适当稀释的噬菌体抗体库静置15 min，涂布于琼脂板上，37 ℃培养过夜。参照犹桃元等^［10］扩增抗新型冠状病毒S蛋白scFv基因的引物和程序，以F-Sfi Ⅰ和R-Not Ⅰ为引物进行转化子菌液PCR鉴定，随机挑取单个菌落进行PCR扩增鉴定重组率，并按照PCR条带结果计算噬菌体抗体库的转化成功率；根据库容公式：库容=10×稀释倍数×对应稀释倍数的噬菌斑数×菌体抗体库的体积。

1.9 噬菌体抗体库富集筛选

将JN.1刺突S蛋白作为抗原包被在24孔培养板上，加入原始抗体库进行反应，随后用洗脱液将与抗原结合的噬菌体洗脱下来，收集洗脱的噬菌体，按1∶200接种至对数期E. coli TG1菌液中，进行下一轮感染，经过2~4轮的吸附、洗脱和扩增循环，筛选出阳性抗体的噬菌体文库。其中4轮筛选抗原浓度分别为10，5，2.5，1.25 µg/mL。选择抗原亲合力最强的克隆进行测序，序列通过NCBI-BLAST分析VH和VL的同源性。VBASE2数据库（http：//www.vbase2.org/vbase2.php）在线分析VH和VL的框架区（framework region，FR）和抗原互补决定区（complementarity-determining region，CDR）。

1.10 噬菌体单克隆进行ELISA鉴定

以最佳工作浓度的JN.1刺突S蛋白抗原包被酶标板，富集筛选到的重组噬菌体M13KO7作为一抗，HRP-anti-M13作为二抗（1∶2 500），用含1%BSA的PBS溶液作为空白对照，以空噬菌体的孔作为阴性对照，采用ELISA法分析噬菌体表达抗体，选取阳性克隆OD₄₉₀值（P）与阴性对照OD₄₉₀值（N）比值大于2.1的阳性孔对应的重组噬菌体菌液用于制备抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白单链抗体的研究。每个样本平行设置3个复孔。

2 结果

2.1 包被抗原最佳工作浓度的确定

当刺突S蛋白抗原（Ag）的浓度为1 μg/mL，阳性血清OD₄₉₀值0.385，而阴性血清OD₄₉₀值为0.01，P/N最大，故以最佳工作浓度的JN.1刺突S蛋白抗原（1 μg/mL）包被酶标板（见表1）。

2.2 免疫血清抗体效价检测结果

免疫后小鼠抗体效价达到了1∶25 600（见表2），免疫效果良好，可用于后期构建单链抗体库。

2.3 PCR扩增VH、VL和scFv基因结果及pCANTAB5E-scFv转化子的酶切鉴定

经琼脂糖凝胶电泳发现VH、VL基因长度均在250~500 bp范围内（见图1），分别与预期360 bp和339 bp相符。将VH和VL通过重叠延伸PCR技术连接为scFv，经琼脂糖凝胶电泳发现scFv片段在750~1 000 bp之间出现一条明显条带（见图2），与预期片段792 bp大小相符。酶切pCANTAB5E-scFv转化子，电泳后在750~1 000 bp之间出现一条带（见图3），与预期片段792 bp大小相符。

2.4 scFv基因噬菌体抗体库的构建及滴度测定

随机挑取10个单菌落，共有9个单克隆有目的片段插入，则噬菌体抗体库的转化率为90%（见图4），本次试验构建的噬菌体抗体库库容为5×10¹² cfu。

2.5 噬菌体单链抗体库的富集筛选

以重组JN.1刺突S蛋白抗原对噬菌体单链抗体库进行4轮富集筛选。第1轮的出入库比为1.5×10^-8，到第4轮时，变成2×10^-6，对比第1轮，比率提高133倍（见表3）。

2.6 scFv基因的序列分析

scFv基因长792 bp，其中VH序列360 bp，编码120个氨基酸；VL长度为339 bp，编码113个氨基酸。两者之间的柔性连接肽片段长93 bp，编码31个氨基酸。NCBI -BLAST分析VH同源序列均为鼠Ig的重链可变区基因，VL同源序列均为鼠Ig轻链可变区基因，同源性均达80%以上。VBASE2数据库（http：//www.vbase2.org/vbase2.php）在线分析VH和VL发现两者各含有4个FR和3个CDR （见图5和图6）。

2.7 ELISA检测噬菌体抗体结果

scFv-1、scFv-2和scFv-5克隆的P/N值大于2.1，判为阳性。与空噬菌体比较，scFv-1、scFv-2和scFv-5的P/N值明显升高（P<0.001，见图7），因此选取效价高的scFv-1、scFv-2、scFv-5用于后续验证实验。

3 讨论

SARS-CoV-2的主要流行变体为重组XBB谱系的后代，包括XBB.1.5、XBB.1.16和EG.5.1，JN.1（BA.2.86.1.1）变体起源于Omicron变体的BA.2.86.1，JN.1变体的特征在于其刺突蛋白S上的一个关键突变，这一变化显著影响了JN.1与ACE-2受体的结合能力^［11］。构建单链抗体库时，选择JN.1刺突蛋白，可筛选出对变异株具有高效中和能力的抗体，克服因突变带来的免疫逃逸问题。

mAb和scFv等在病毒性疾病的诊断和防治中备受关注。然而scFv作为第3代抗体基因工程抗体，具有分子质量小、穿透力强、特异性强、异原性低、操作简单、纯度高等优点，更是值得推广^［12］。在本研究中，采用新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾脏提取总RNA，反转录得到cDNA，扩增抗新型冠状病毒S蛋白scFv重组基因的VH和VL，通过重叠延伸PCR技术连接为scFv，结果发现在750~1 000 bp之间出现一条明显条带，与预期片段792 bp大小相符。scFv保留了抗体与抗原特异性的结合位点，为进一步研究该抗体靶向生物治疗奠定实验基础。

噬菌体展示技术（phage display technology，PDT）是一种利用噬菌体展示技术进行筛选的方法。利用噬菌体展示技术，通过多轮淘选，可快速从大量抗体变体中筛选出高亲和力、高特异性的抗JN.1刺突蛋白抗体^［13］。pCANTAB5E是一种专门用于scFv噬菌体展示的噬菌粒载体，主要用于构建重组scFv和表达抗体基因。PCR扩增出scFv基因后，将scFv插入噬菌体载体pCANTAB5E，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒。重组质粒构建成功后，将其转入E. coli TG1感受态细胞。E. coli TG1感受态细胞来源于大肠杆菌K-12菌株，是目前生长速度最快的克隆用大肠杆菌菌株之一，主要用于噬菌体展示。本研究在培养过程中将其涂布于含有氨苄青霉素的SOB-AG琼脂板，只有成功转化了带有该抗性基因质粒的E. coli TG1细胞才能生长。构建scFv基因噬菌体抗体库后进行富集筛选，此为噬菌体展示技术的核心步骤，能够从巨大而多样性的抗体库中富集出对目标抗原具有高亲和力的特异性抗体克隆。构建抗新冠病毒变异株JN.1刺突S蛋白的噬菌体单链抗体库（scFv库），突破了传统抗体研发框架，相比传统杂交瘤技术，直接利用体外分子进化快速捕获针对JN.1特有突变的高亲和力抗体。另外，JN.1的快速传播和免疫逃逸能力显著增强对现有疫苗的有效性提出了挑战。因此，构建针对JN.1的单链抗体库，有助于开发新一代广谱疫苗和免疫疗法，以应对不断变异的新冠病毒。

综上，本研究成功构建抗JN.1刺突S蛋白的噬菌体scFv抗体库，这不仅是应对当前变异株的“技术疫苗”，更是面向未来冠状病毒威胁的“抗体战略储备平台”，兼具科学前沿性、技术突破性与全球公共卫生意义。

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基金资助

贵州省科技计划项目(黔科合支撑［2020］4Y187号)