基于iTRAQ定量蛋白质组学对肉芽肿性乳腺炎的机制研究

Study on the pathogenesis of granulomatous mastitis based on iTRAQ quantitative proteomics

摘要

目的 通过放射性核素标记相对与绝对定量（iTRAQ）蛋白质组学技术，探讨肉芽肿性乳腺炎的发病机制。　方法选取2021年1—12月西安交通大学第二附属医院乳腺疾病诊疗中心确诊为肉芽肿性乳腺炎的乳腺组织为肉芽肿性乳腺炎组（n=12），取同时期因乳腺良性疾病行手术治疗患者的正常乳腺组织为对照组（n=12），通过iTRAQ定量蛋白质组学探究两组间的差异蛋白，利用KEGG数据库对差异蛋白的相关信号通路进行分析，并利用免疫组化对相关信号通路的关键蛋白进行检验。 结果 肉芽肿性乳腺炎组与对照组比较，共鉴定出3 257种差异蛋白，其中显著下调蛋白931种，显著上调蛋白2 326种，差异蛋白的通路富集分析主要集中在补体和凝血级联反应、核糖体、代谢通路、碳代谢、氧化磷酸化、黏着斑、脂肪酸降解、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等。免疫组化结果显示，肉芽肿性乳腺炎组磷酸化S6核糖体蛋白、酰基辅酶A合成酶长链蛋白1的表达水平均高于对照组（P<0.05），而衰变加速因子、过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达水平低于对照组（P<0.05），黏着斑激酶的表达水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。 结论 肉芽肿性乳腺炎的发生可能与补体和凝血级联反应、核糖体、代谢通路、碳代谢、氧化磷酸化、黏着斑、脂肪酸降解、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路等有关。

Abstract

Objective To explore the pathogenesis of granulomatous mastitis through isobaric tags for relative and absolute quantitation（iTRAQ）-based proteomics. Methods Breast tissues from patients diagnosed with granulomatous mastitis in the comprehensive breast care center in the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University from January to December 2021 were selected as granulomatous mastitis group（n=12）. Normal breast tissues from patients who underwent surgery for benign breast diseases during the same period were taken as control group（n=12）. iTRAQ proteomics was used to identify differentially expressed proteins between the two groups. The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） database was utilized to analyze the relevant signaling pathways of DEPs， and immunohistochemistry was employed to verify the key proteins of the relevant signaling pathways. Results Compared with control group， a total of 3 257 DEPs were identified in granulomatous mastitis group， including 931 significantly down-regulated proteins and 2 326 significantly up-regulated proteins. Pathway enrichment analysis of these differential proteins mainly focused on complement and coagulation cascades， ribosome function， metabolic pathways， carbon metabolism， oxidative phosphorylation， focal adhesion， fatty acid degradation， and the peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR） signaling pathway. Immunohistochemical results showed that the expression levels of phosphorylated S6 ribosomal protein and acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 in granulomatous mastitis group were higher than those in control group（P<0.05）， while the expression levels of decay-accelerating factor and peroxisome proliferator-activated receptor γ were lower than those in control group（P<0.05）. There was no significant diffe⁃rence in the expression level of focal adhesion kinase between granulomatous mastitis group and control group（P>0.05）. Conclusion The pathogenesis of granulomatous mastitis may be associated with the complement and coagulation cascades， ribosomal function， metabolic pathways， carbon metabolism， oxidative phosphorylation， focal adhesion， fatty acid degradation， and the peroxisome proli⁃ferator-activated receptor signaling pathways， and so on.

Graphical abstract

关键词

iTRAQ蛋白质组学 / 肉芽肿性乳腺炎 / 通路分析 / 磷酸化S6核糖体蛋白 / 酰基辅酶A合成酶长链蛋白1 / 衰变加速因子 / 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

Key words

iTRAQ proteomic / granulomatous mastitis / pathway analysis / phosphorylated S6 ribosomal protein / acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 / decay-accelerating factor / peroxisome proliferator-activated receptor gamma

肉芽肿性乳腺炎（granulomatous mastitis，GM）是非哺乳期乳腺炎的一种，以往临床并不多见，但近年来发病率明显上升，有学者统计其发病率已占全乳腺疾病的6.02%。GM主要表现为乳腺肿块、疼痛、起病突然，数天后皮肤发红伴小脓肿形成，破溃后脓液不多，但红肿破溃常迁延不愈^［1］。临床上常采用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等药物治疗GM，也可在病灶缩小、无明显急性炎症后行手术治疗，中医、中药治疗GM也一定疗效，但截至目前GM还没有统一的治疗方案，归因于其发病机制仍不清楚^［2］。

研究发现，GM的病理机制与自身免疫反应、非结核分枝杆菌或其他病原体感染、乳管阻塞引发的炎症反应、激素（雌激素、泌乳素等）分泌异常、乳房外伤、使用影响激素水平或免疫系统的药物等有关^［3］。随着对GM研究的深入，越来越多的分子生物学技术用于GM发病机制的探索，例如全外显子测序、微生物群落分析等^［4，5］。放射性核素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白质组学技术作为一种新兴的蛋白质组学研究方法，具有更高的扫描速度和检测灵敏度，能够更全面地揭示蛋白质表达变化，因此本研究采用iTRAQ技术对GM在蛋白水平进行分析，并采用免疫组化对发现的信号通路的关键蛋白进行验证，旨在初步探索GM的发病机制。

1 对象与方法

1.1 标本收集及分组

肉芽肿性乳腺炎组（GM组）的12例乳腺组织标本来自2021年1-12月西安交通大学第二附属医院乳腺疾病诊疗中心经穿刺活检确诊为肉芽肿性乳腺炎的患者，所有患者为初诊，未经任何药物治疗。同时选取12例因乳房良性肿瘤行手术治疗的患者的正常乳腺组织为对照组。对有生物重复的比较而言，在生物重复不配对的情况下，其中每组中的4例标本用于蛋白质组学分析；利用G*Power软件计算样本量（设置统计功效为0.8、显著性水平0.05），确定8例组织用于免疫组化检测。本研究已获西安交通大学第二附属医院伦理学委员批准（2017-1056）。

1.2 材料

蛋白酶抑制剂购自德国默克集团，胰蛋白酶购自上海普洛麦格生物制品有限公司，碘乙酰胺（iodoacetamide，IAM）、尿素、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、四乙基溴化铵（tetraethyl ammonium bromide，TEAB）均购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）购自卡迈舒（上海）生物科技有限公司，丙酮（杭州汉诺化工有限公司）。衰变加速因子（decay⁃ accelerating factor，DAF）抗体、磷酸化S6核糖体蛋白（phospho-S6 ribosoma，p-S6）抗体、黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）抗体、酰基辅酶A合成酶长链蛋白1（acyl-CoA synthetase long chain 1，ACSL1）抗体、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）γ抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质鉴定、质检及质谱分析

称取适量GM组织及正常乳腺组织，加入Cocktail，加入终浓度10 mmol/L的DTT；研磨仪破碎裂解，离心15 min，取上清；再次加入DTT，水浴1 h；加入终浓度55 mmol/L的IAM，暗室放置45 min；加入冷丙酮，离心15 min弃上清；风干沉淀，加入适量无SDS L3，离心后取上清，上清为蛋白溶液。每样品取10 μg蛋白溶液加入上样缓冲液混匀、加热，离心后取上清，加入12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中，电泳150 min；电泳结束后，将胶放入快速染脱仪器，取出胶图扫描。另取100 μg蛋白溶液加入离心管中，稀释后加入酶液，胰蛋白酶与底物蛋白按质量比1∶20加入酶液，低速离心后孵育4 h，取出消化好的肽段液进行除盐后冷冻抽干。

1.3.2 肽段标记、分离

用TEAB溶解肽段样品，并加入到对应iTRAQ标签试剂中。采用LC-20AD液相系统，取混合后的20 μg样本，分离柱对样品进行液相分离。用流动相A复溶抽干的肽段样品并进样，以4 μL/min的流速梯度洗脱。在214 nm波长下监测洗脱峰并每3.15 min收集一个组分，结合色谱洗脱峰图得到20个组分，然后冷冻抽干。

1.3.3 高效液相及质谱分析

将抽干的肽段样品用流动相A复溶，离心后取上清进样，通过UltiMate 3000 UHPLC进行分离。样品进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱串联，以300 nL/min流速通过梯度溶液进行分离。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪进行DDA模式检测。

1.3.4 生物信息学分析相关富集通路

原始质谱数据转成MGF格式，MGF文件经过鉴定软件Mascot和选好的蛋白质序列数据库比对搜索得到最终的蛋白鉴定结果。ITRAQ数据的定量采用华大基因自主研发的IQuant软件，首先在谱图/肽段水平进行1% FDR的过滤，从而获得显著性鉴定的谱图和肽段列表。接着基于“简约原则”，利用肽段进行蛋白组装，并产生一系列的蛋白组。根据定量结果进行两组间差异倍数（fold change， FC）和T-test显著性P值计算，差异蛋白需以FC>1.2和P<0.05两个条件筛选。在差异蛋白的KEGG通路分析中，通过显著差异蛋白和作为背景的全体鉴定蛋白相比，利用超几何检验找出显著富集的通路。

1.3.5 免疫组化检测各通路关键蛋白的表达

组织置于10%中性福尔马固定24 h，经脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋、切片。依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脱蜡，然后用梯度乙醇进行水化，最后用蒸馏水冲洗。切片放入pH 6.0的柠檬酸缓冲液中，在高压锅中煮沸2 min后自然冷却。用3%过氧化氢-甲醇溶液孵育切片，阻断内源性过氧化物酶的活性，切片加入用PBS缓冲液稀释后的一抗（ACSL1抗体1∶500、DAF抗体1∶1 200、FAK抗体1∶800、PPARγ抗体1∶500、p-S6抗体1∶400），4 ℃冰箱中过夜。常规冲洗切片后，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min。3，3'-二氨基联苯胺显色液显色，最后用苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片，光镜观察，用Leica-Q550CW系统采集图像。每张切片随机选6个×400视野，以Image-Pro Plus 6.0软件评估染色强度与阳性细胞数。染色强度：无染色0分，轻度黄染1分，中度黄染2分，重度黄染3分。阳性细胞数百分比：无染0分，0<阳性细胞数≤10%为1分，10%<阳性细胞数≤50%为2分，50%<阳性细胞数≤80% 为3分，80%<阳性细胞数≤100%为4分。两者评分相乘得免疫组化评分（immunohistochemical score，IHS），范围0~12分。

1.3.6 统计学方法

应用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差（X±S）表示，两组间蛋白差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定及定量分析差异蛋白

与对照组相比，GM组共鉴定出36 020条肽段和5 780个蛋白质，将鉴定出的肽段和蛋白质进行iTRAQ定量分析，以FC>1.2和P<0.05两个条件筛选差异蛋白，GM组共鉴定出3 257个差异蛋白，与对照组比较，GM组显著下调931个蛋白，显著上调2 326个蛋白（见图1）。

2.2 KEGG通路分析差异蛋白

对差异蛋白进行KEGG信号通路分析，结果显示，其主要富集于补体和凝血级联反应（complement and coagulation cascades）、核糖体（ribosome）、代谢通路（metabolic pathways）、碳代谢（carbon metabolism）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、黏着斑（focal adhesion）、脂肪酸降解（fatty acid degradation）、PPAR信号通路（PPAR signaling pathway）等（见表1，图2）。

2.3 免疫组化检测各通路关键蛋白的表达

免疫组化结果显示：GM组ACSL1、p-S6的表达水平均高于对照组（P<0.05），而DAF、PPARγ的表达水平低于对照组（P<0.05）；与对照组相比，GM组FAK的表达水平差异无统计学意义（P>0.05，见图3）。

3 讨论

既往研究表明，多种因素参与了GM的病理过程，例如抗胰蛋白酶缺乏、吸烟、棒状杆菌感染、妊娠、哺乳、高催乳素血症、自身免疫紊乱等。然而GM发生发展的分子机制仍未明确。本研究利用TRAQ定量的蛋白质组学发现，GM的发生与补体和凝血级联反应、核糖体、代谢通路、碳代谢、氧化磷酸化、黏着斑、脂肪酸降解、PPAR信号通路等可能有关。

DAF是一种补体膜蛋白，抑制补体激活并阻止C3和C5转化酶的形成，减轻补体诱导的损伤，是补体调控蛋白家族中的一种重要的同源限制因子^［6］。本研究表明，GM组织中DAF的表达明显降低，意味着DAF抑制补体激活的作用减弱，进而导致补体系统过度激活，启动炎症反应，损伤乳腺组织细胞，致使肉芽肿形成^［7］。此外，凝血级联反应的激活也可改变血管内微环境，使血流减慢、组织缺氧，利于炎症细胞黏附聚集，加重损伤与炎症，为肉芽肿形成创造条件^［8］。既往多数研究主要聚焦于DAF在全身性疾病或其他组织器官疾病中对补体系统的调控作用，但关于GM组织中DAF表达及功能的研究尚属空白。本研究明确了DAF在GM中的表达变化，为揭示补体系统异常激活在GM发病及肉芽肿形成中的作用机制提供了实验依据，也为后续深入探索GM中DAF的具体调控机制奠定了基础。

P-S6蛋白主要在翻译水平对蛋白质合成进行调节，它是核糖体小亚基40S的组成成分，其磷酸化状态与mRNA的翻译效率密切相关。p-S6是核糖体生物合成过程中的信号转导分子，信号通路的激活使S6蛋白磷酸化^［9］。在本研究中，GM组织中p-S6的水平明显升高。GM形成过程中，核糖体可能大量合成免疫相关蛋白，比如细胞因子、抗体等。此外，部分GM与细菌感染有关，如分枝杆菌等^［3］。细菌内的核糖体也是细菌生长、繁殖和致病的基础^［10］。核糖体与内质网关系密切，核糖体合成的蛋白质进入内质网进行加工折叠，GM时内质网应激被激活，影响蛋白质的正确折叠，也激活炎症信号通路^［11］。既往关于p-S6蛋白的研究多集中于肿瘤发生、细胞增殖以及代谢调控等领域，其在GM中的作用尚不明确。而本研究拓展了p-S6蛋白功能的研究范畴，初步揭示了其在免疫炎症病理过程中的作用。

代谢通路指细胞内一系列酶促反应，使生物体获取能量、合成生物大分子，碳代谢是其重要部分。在GM中，炎症细胞在病变部位聚集，需要能量维持吞噬病原体、分泌细胞因子等功能。炎症环境下，细胞对葡萄糖的摄取和利用可能增加。碳代谢中间产物可为GM的组织修复、细胞增殖等提供物质基础^［12］。同时，碳代谢产物也参与细胞信号传导，比如，乙酰辅酶A是碳代谢产生的重要分子，可调节基因表达、影响炎症相关基因转录^［13］。且GM的发生可能与微生物有关，微生物的碳代谢会与宿主细胞相互影响，微生物消耗碳源产生酸性代谢产物，影响乳腺细胞碳代谢，加剧炎症反应^［14］。氧化磷酸化及脂肪酸降解均是细胞产生能量的方式，主要发生在线粒体。在GM组织中，炎症反应产生的活性氧可能会损伤线粒体，氧化磷酸化的效率降低，细胞可能会更多地依赖脂肪酸降解来提供能量^［15］。ACSL1是脂肪酸代谢的关键酶，能催化长链脂肪酸与辅酶A结合，参与脂肪酸代谢、能量代谢等，ACSL1是ACSL家族中研究最深入的酶，主要表达于高度氧化的组织^［16］。本研究显示，GM组织中ACSL1的表达升高，提示脂肪酸的代谢出现异常。既往GM的研究聚焦于炎症因子、免疫细胞等免疫相关机制，对代谢通路的作用关注较少。本研究初步发现碳代谢、氧化磷酸化、脂肪酸降解等多维度代谢过程与GM的病理有关，并通过检测ACSL1的表达变化，为深入理解脂肪酸代谢在GM病变进展中的作用提供了新线索，也为从代谢调控角度探索GM的潜在干预靶点开辟了新方向，拓展了GM发病机制的研究范畴。

黏着斑是细胞与细胞外基质之间的连接结构，在细胞的黏附、迁移和信号传导等过程中起重要作用，FAK蛋白是细胞黏附过程中的关键分子，也是黏着斑的核心信号分子^［17］。炎症细胞表面的整合素可能通过黏着斑与细胞外基质形成稳定的连接，使炎性细胞迁移到乳腺组织的炎症区域。同时，异常的黏着斑可能使炎症细胞持续激活，释放更多的炎症介质。GM时黏着斑无法正常调节细胞与细胞外基质的相互作用，可能会出现组织过度纤维化或组织再生不足，导致乳腺出现瘢痕样改变^［18］。本研究中，与对照组相比，GM组FAK的表达水平无明显差异，提示黏着斑相关的信号传导机制可能未通过FAK的表达变化直接参与GM的病理生理过程，或存在其他代偿通路，具体机制有待进一步探究。

PPAR是一类核受体，调节细胞分化、代谢以及炎症反应等。PPAR的靶基因涉及脂肪酸代谢、葡萄糖代谢等^［19］。在GM中，PPAR可能通过调节脂肪酸的降解、葡萄糖转运蛋白的表达，影响细胞对能量的利用。PPARγ的活化可以抑制核因子-κB及下游多种炎性因子的转录，在本研究中，PPARγ的表达减少，意味着炎症反应的激活，因此开发针对PPARγ通路的药物可能为GM的治疗提供新的策略^［20］。关于PPARγ的研究多聚焦于代谢性疾病，如2型糖尿病及其他炎症性疾病（关节炎等），本研究初步证实了PPARγ在炎症性疾病中抗炎作用的共性，为药物的跨疾病应用提供了新思路。目前，一些PPAR激动剂已被用于治疗2型糖尿病，且在其他炎症性疾病的治疗中也显示出一定的疗效^［21］。这些激动剂有望通过抑制炎症反应、调节细胞代谢和促进组织修复来改善GM。

虽然本研究初步采用蛋白质组学对GM的机制进行探讨，但存在一些局限性。首先，未来需要进一步扩大样本量验证这些发现。其次，虽然本研究鉴定出了大量差异蛋白，但生物样本中的蛋白质浓度动态范围极宽，跨越多个数量级，不同蛋白质的表达量差异很大，基于蛋白组学检测的局限性，对表达量极低的蛋白质，其定量的准确性仍然有待提高。而蛋白质组学与基因组学、转录组学、代谢组学的联合应用能解决这些不足，蛋白质组学提供蛋白质的表达、修饰和功能，与其他组学提供的基因序列信息、转录水平信息、代谢物的变化相整合，可以更全面地了解GM的病理过程。

综上所述，本研究采用iTRAQ蛋白质组学及免疫组化初步分析了GM的病理机制，发现GM的发生可能与补体和凝血级联反应、核糖体、代谢通路、碳代谢、氧化磷酸化、黏着斑、脂肪酸降解、PPAR信号通路等机制有关，本研究有助于进一步探究GM的发生机制。

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基金资助

陕西省重点研发计划项目(2017SF-250)