VCAM1对创伤性股骨头坏死患者来源骨髓间充质干细胞血管生成能力的影响

Effect of VCAM1 on angiogenic capacity of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from patients with trauma-induced osteonecrosis of femoral head

摘要

目的 探讨血管细胞黏附分子1（VCAM1）在创伤性股骨头坏死患者来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的表达及其对血管生成能力的影响。 方法 因髋部创伤治疗后发生股骨头坏死的14例患者纳入坏死组，同期单纯股骨颈骨折的6例患者纳入对照组，获取骨髓组织后使用密度梯度离心法提取两组患者来源的BMSCs，流式细胞术检测BMSCs的细胞表面标志物和VCAM1表达，油红O染色、茜素红S染色和阿利新蓝染色检测多向分化潜能，体外血管形成实验评估血管生成。将坏死组患者来源的BMSCs分为VCAM1组和NC组，分别使用慢病毒载体转染VCAM1或对照空载体，通过qRT-PCR和Western blot检测BMSCs中VCAM1的mRNA和蛋白水平，体外血管形成实验评估血管生成能力。对VCAM1组和NC组BMSCs行RNA测序并检测差异表达基因，对差异表达基因进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。 结果 所提取的BMSCs均呈长梭形并呈放射状排列，表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR，且具有成骨分化、成脂分化和成软骨分化潜能。与对照组相比，坏死组BMSCs细胞表面的VCAM1显著下调（P<0.05），所形成血管网络中的交叉点和总分支长度均显著减少（P<0.05）。与NC组相比，VCAM1组所形成血管网络中的交叉点和总分支长度均显著增加（P<0.05），多种生长因子（PGF， FGF14， HBEGF， NGF， IGFBP3）显著上调（P<0.05）。KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因参与了细胞外基质受体相互作用，黏着斑，磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激信号通路和细胞因子与细胞因子受体的相互作用。 结论 创伤性股骨头坏死患者来源BMSCs中VCAM1表达水平下调，并与其血管生成能力降低密切相关。过表达VCAM1可显著增强其促血管生成功能。

Abstract

Objective To investigate the expression of vascular cell adhesion molecule 1（VCAM1） in bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs） derived from patients with trauma-induced osteonecrosis of femoral head and the effect on the angiogenic capa-city. Methods Fourteen patients who developed osteonecrosis of the femoral head after treatment for hip trauma were enrolled in necrosis group. In the same period， six patients with simple femoral neck fractures were chosen as control group. BMSCs were extracted using density gradient centrifugation from bone marrow of patients in both two groups. Cell surface markers and VCAM1 expression in BMSCs were detected by flow cytometry. Multidirectional differentiation potential of BMSCs was detected by oil red O staining， Alizarin red S staining and Alizarin blue staining. Angiogenesis was assessed by in vitro tube formation assay. BMSCs from patients in necrosis group were divided into VCAM1 group and NC group， and transfected with VCAM1-expressing lentiviral vectors and control empty vectors， respectively. VCAM1 mRNA and protein levels were measured by qRT-PCR and Western blot， respectively， and the angiogenic capacity was evaluated by in vitro tube formation assays. RNA sequencing was performed on BMSCs in VCAM1 group and NC group， and differentially expressed genes（DEGs） were detected. The DEGs were analyzed by gene ontology（GO） function enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment. Results The extracted BMSCs were all long shuttle-shaped and arranged in a radial pattern. The BMSCs were positive for CD73， CD90 and CD105， but negative for CD34， CD45， CD11b， CD19 and HLA-DR. The BMSCs had good capacity for osteogenic differentiation， lipogenic differentiation and chondrogenic differentiation. Compared with control group， VCAM1 was significantly downregulated on the cell surface of BMSCs in necrosis group（P<0.05）， and both the junctions and total branch lengths in the formed vascular network were significantly reduced（P<0.05）. Compared with NC group， the junctions and total branch lengths in the formed vascular network significantly increased in VCAM1 group（P<0.05）， and multiple growth factors（PGF， FGF14， HBEGF， NGF， IGFBP3） were significantly upregulated（P<0.05）. The results of KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs were involved in ECM-receptor interaction， focal adhesion， PI3K-Akt signaling pathway and cytokine-cytokine receptor interaction. Conclusion VCAM1 expression is downregulated in BMSCs derived from patients with trauma-induced osteonecrosis of the femoral head， and is closely associated with the reduced angiogenic capacity. Overexpression of VCAM1 can significantly enhance the pro-angiogenic function of these cells.

Graphical abstract

关键词

创伤性股骨头坏死 / 骨髓间充质干细胞 / 血管细胞黏附分子1 / 血管生成 / 基因工程 / 转录组学

Key words

trauma-induced osteonecrosis of femoral head / bone marrow mesenchymal stem cells / vascular cell adhesion mo⁃lecule-1 / angiogenesis / genetic engineering / transcriptome

股骨头坏死是由于不同病因导致股骨头血液供应中断或受损，引起软骨下骨变性、坏死，继而造成股骨头塌陷，最终导致髋关节退行性破坏性改变的一种病理过程^［1，2］。根据病因可以将股骨头坏死分为创伤性和非创伤性两大类，创伤性股骨头坏死通常由股骨颈骨折和髋关节脱位导致局部血管损伤引起骨坏死，而血液供应不足是导致骨坏死的主要原因^［2］。因此开发鉴定与血管生成相关的治疗靶点将对治疗创伤性股骨头坏死带来更多希望。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种来源于中胚层的成体干细胞，存在于体内多种组织中，如骨髓、脂肪、脐血、脐带、胎盘、羊水等^［3］。MSCs具有自我更新和多向分化的能力，并且由于MSCs具有异质性，在多种疾病的发展中起着非常重要的作用。血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1），又称CD106，是于1989年首次发现的一种内皮细胞表面糖蛋白^［4］。VCAM1除了介导白细胞与内皮之间的滚动、牢固黏附以及白细胞迁移之外，还在内皮细胞上广泛表达，可反映细胞的成血管能力^［5］。可溶性VCAM1已被证明介导大鼠角膜血管生成，并且可溶性VCAM1/α4整合素途径在炎症刺激诱导的血管生成中起重要作用^［6，7］。最近的研究表明，胎盘绒毛膜来源的MSCs中的VCAM1具有良好的血管生成旁分泌活性，对下肢缺血具有良好的治疗效果^［8］。

因此本研究通过探讨VCAM1在创伤性股骨头坏死患者来源的骨髓MSCs（bone marrow MSCs， BMSCs）中的表达及其对血管生成能力的影响及相关机制，为创伤性股骨头坏死中影响血管生成的分子机制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 纳入患者和样本

选取2021年6月至2022年6月我院收治的因髋部创伤治疗后发生股骨头坏死的14例患者纳入坏死组，所有患者在入院后均进行了双髋关节X线和磁共振成像（magnetic resonance imaging， MRI）检查，并满足股骨头坏死的诊断标准^［9］。患者在过去6个月内没有接受任何药物治疗，没有其他关节疾病、自身免疫性疾病、全身性炎症、恶性或慢性疾病。同期发生单纯股骨颈骨折的6例患者纳入对照组，所有患者在行人工髋关节置换术中获取骨髓组织。所有患者对该研究方案知情同意并签署相关知情同意书。该研究获得郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会批准（伦理批号：202170）。

1.2 主要试剂

人脐静脉内皮细胞EA.hy926和DMEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，MSC无血清培养基购自北京友康生物科技股份有限公司，OPTI-MEM培养基购自美国赛默飞世尔科技有限公司，Ficoll分离液、茜素红S染液、油红O染液和阿利新蓝染液均购自北京索莱宝科技有限公司，流式细胞术抗体购自美国Biolegend公司，Matrigel基质胶购自美国Corning公司，过表达慢病毒载体由上海吉凯基因公司代为合成设计，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自美国赛默飞世尔科技有限公司，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，PCR引物由北京擎科生物科技股份有限公司代为合成设计，GAPDH抗体购自美国Bioworld Technology公司，VCAM1抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IgG购自英国Abcam公司，Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂盒购自上海雅酶生物医药科技有限公司。

1.3 主要仪器

细胞恒温培养箱购自香港力康生物医疗科技控股有限公司，CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，倒置显微镜及成像系统购自德国Carl Zeiss公司，梯度PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司，快速实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.4 BMSCs的分离和培养

使用密度梯度离心法分离骨髓样本中的BMSCs。取骨髓液5 mL和PBS缓冲液1∶1稀释混匀，室温1 500 r/min离心10 min。弃去脂肪层，将已经稀释的骨髓液缓慢加到等体积Ficoll分离液（1.077 g/mL）上面，室温2 500 r/min离心30 min。吸取界面处白膜状细胞层的单个核细胞，用PBS缓冲液混悬后1 500 r/min离心10 min。弃掉上清后PBS缓冲液洗涤2次，使用MSC无血清培养基重悬细胞，置于5％CO₂和37 ℃的条件下培养。单纯股骨颈骨折患者骨髓来源的BMSCs设置为对照组，股骨头坏死患者骨髓来源的BMSCs设置为坏死组。后续通过流式细胞术检测两组患者来源BMSCs的细胞表面标志物和VCAM1表达；油红O染色、茜素红S染色和阿利新蓝染色检测多向分化潜能；体外血管形成实验评估血管生成。

1.5 流式细胞术检测细胞表面标志物

通过流式细胞术检测坏死组和对照组患者来源BMSCs的细胞表面标志物和VCAM1（CD106）表达。BMSCs使用PBS缓冲液洗涤两次后重悬，加入4 µL相应抗体常温避光孵育15 min。PBS缓冲液洗涤后使用CytoFLEX流式细胞仪检测，流式细胞术数据使用CytExpert软件（美国Beckman Coulter公司）分析。所使用的流式细胞术抗体如下：藻红蛋白（phycoerythrin， PE）荧光标记的CD90和CD106，别藻蓝蛋白（allophycocyanin， APC）荧光标记的CD73和CD105，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）荧光标记的CD14，CD19，CD34，CD45和HLA-DR。

1.6 茜素红S染色检测BMSCs的成骨分化能力

在24孔板中接种BMSCs（2×10⁴/孔），当细胞达到80％~90％的汇合度时，更换为成骨诱导培养基开始进行成骨分化诱导，每3 d更换一次成骨诱导培养基。诱导14 d后加入适量茜素红S染色液，37 ℃烘箱孵育30 min，蒸馏水充分洗涤后在显微镜下观察拍照。

1.7 油红O染色检测BMSCs的成脂分化能力

在24孔板中接种BMSCs（2×10⁴/孔），当细胞达到80％~90％的汇合度时，更换为成脂诱导培养基开始进行成脂分化诱导。诱导顺序为：0~3 d成脂诱导培养基，3~5 d为10％胰岛素DMEM培养基，5~7 d成脂诱导培养基，7~8 d加入10％胰岛素DMEM培养基，8~10 d成脂诱导培养基。

诱导后使用PBS缓冲液清洗两次后加入ORO Fixative固定30 min，弃去固定液后60%异丙醇浸洗5 min，弃异丙醇后加入ORO Stain浸染20 min，水洗2~5次后加入Mayer苏木素染色液复染核2 min，水洗2~5次后加入ORO Buffer 1 min，弃去后加入蒸馏水覆盖细胞并在显微镜下观察拍照。

1.8 阿利新蓝染色检测BMSCs的成软骨分化能力

BMSCs（5×10⁵）在1 500 r/min下离心5 min获得细胞团，然后在成软骨培养基中培养21 d。诱导后的细胞团固定在4%甲醛中，在乙醇中脱水并包埋在石蜡块中，切片后用阿利新蓝染色评估软骨分化。

1.9 体外Matrigel血管形成实验

首先通过体外Matrigel血管形成实验检测坏死组和对照组患者来源BMSCs的血管生成能力。然后将坏死组患者来源的BMSCs分为VCAM1组和阴性对照（negative control， NC）组，分别使用慢病毒载体转染VCAM1或空载体后再次通过体外Matrigel血管形成实验检测其血管生成能力。人脐静脉内皮细胞EA.hy926使用DMEM高糖培养基在5％CO₂和37 ℃的条件下培养。将Matrigel基质胶置于4 ℃过夜融化，在预冷的48孔板中每孔加入150 µL基质胶，置于37 ℃恒温培养箱中30 min使基质胶凝固。然后在基质胶包被的48孔板中接种EA.hy926和BMSCs（1∶1）共培养。细胞在5％CO₂和37 ℃的条件下培养6 h后在显微镜下观察血管形成情况，并使用Image J软件配合 Angiogenesis Analyzer插件对血管网络定量分析。提取交叉点数（个）和总分支长度（像素），由于图像未进行空间标尺校准，分支长度以像素表示，用于反映组间相对差异而非绝对物理距离。

1.10 稳定过表达VCAM1的BMSCs的构建

将坏死组患者来源的BMSCs分为VCAM1组和NC组，使用慢病毒载体对VCAM1组BMSCs进行基因转染以过表达VCAM1，NC组转染对照空载体。将BMSCs（5×10⁵/孔）接种到6孔板中，37 ℃培养24 h至细胞汇合度达到20%~30％时进行转染。弃掉旧培养基后更换为OPTI-MEM培养基。VCAM1组加入HiTransG A感染增强液40 µL+慢病毒15 µL，NC组加入HiTransG A感染增强液40 µL+对照慢病毒15 µL。37 ℃培养16 h后更换为MSC无血清培养基继续培养，感染后约72 h荧光显微镜下观察感染效率。待细胞融合度为70%~80％时加入2 µg/mL嘌呤霉素继续培养以筛选稳定过表达VCAM1的BMSCs。

1.11 实时定量PCR检测VCAM1的mRNA表达

Trizol法提取VCAM1组和NC组BMSCs内的总RNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒从1 μg总RNA中合成cDNA。然后使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒构建PCR体系，在7500 Fast Dx Real-Time PCR系统中启动PCR程序：95 ℃预变性5 min，然后以95 ℃ 15 s，56 ℃ 34 s，72 ℃ 45 s，循环40次。以β-actin为参照，采用相对标准曲线法（2^-ΔΔCt ）测定RNA的相对表达量。PCR所使用的引物序列如下：VCAM1 F： 5′- GGACCACATCTACGCTGACA-3′， R： 5′-TTGACTGTGATCGGCTTCCC-3′； β⁃actin， F：5′-TCACCATGGATGATGATATCGC-3′， R： 5′-ATAGGAATCCT⁃TCTGACCCATGC-3′。

1.12 Western blot检测VCAM1的蛋白表达

提取VCAM1组和NC组BMSCs中的总蛋白后定量测定蛋白浓度，将各组中等量的蛋白质在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，并将其转移至聚偏二氟乙烯膜上。室温下使用50 g/L的脱脂牛奶和含Tween20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液将膜封闭2 h，分别滴加一抗（GAPDH，1∶5 000；VCAM1，1∶1 000）室温孵育1 h并4 ℃孵育过夜。次日使用HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，每次10 min洗脱3次。使用Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂盒显影曝光并拍照保存。使用Image J软件统计条带灰度值。

1.13 RNA测序及生物信息学分析

为探究VCAM1在BMSCs中调控血管生成能力的分子机制，对NC组和VCAM1组的BMSCs进行了RNA测序分析，旨在筛选与VCAM1表达变化相关的差异表达基因（differentially expressed genes， DEGs），并进一步明确其参与的生物学功能和信号通路。首先提取NC组和VCAM1组BMSCs中的总RNA，去除rRNA，用乙醇沉淀法纯化无rRNA的残留物。应用非接触式全自动超声波破碎仪，将RNA打断成100~300 bp之间，反转录合成cDNA并构建文库。利用T4 DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端，进行文库片段筛选。采用Illumina高通量测序平台，2×150 bp双端测序策略对文库进行测序。

对上述所得两组之间的RNA测序原始数据进行差异表达分析，设置|log₂（FC）|>1，校正后P<0.05，筛选出两组之间的DEGs。将DEGs上传至DAVID在线数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.14 统计学分析

使用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。采用Shapiro-Wilk正态性检验评估数据是否符合正态分布。对于符合正态分布的连续变量数据，以均值±标准差（X±S）表示，两组间比较采用独立样本t检验。分类变量数据的两组间比较采用χ²检验。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入患者的一般资料

坏死组共纳入因髋部创伤治疗后发生股骨头坏死的患者14例（男8例，女6例），年龄（64.86±3.66）岁。对照组纳入单纯股骨颈骨折的患者6例（男2例，女4例），年龄（67.33±2.07）岁。两组患者年龄和性别之间的差异无统计学意义（P>0.05）。创伤性股骨头坏死患者的典型影像学图像见图1。

2.2 两组患者来源BMSCs的一般特征

流式细胞术结果显示，所提取的BMSCs细胞表面均表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR（见图2A）。所提取的原代BMSCs培养后均呈长梭形、放射状排列并贴壁生长，两组BMSCs的形态、大小均一，无明显差异（见图2B）。两组BMSCs经过成软骨分化诱导后通过阿利新蓝染色均观察到酸性蛋白多糖（见图2C）；成脂分化诱导后通过油红O染色均观察到脂滴形成（见图2D）；成骨分化诱导后通过茜素红S染色均观察到矿化结节形成（见图2E）。

2.3 两组患者来源BMSCs中VCAM1的表达

流式细胞术结果显示，与对照组相比，坏死组BMSCs细胞表面的CD106显著下调（见图3）。

2.4 两组患者来源BMSCs的促血管生成能力

体外Matrigel血管形成实验结果显示，人脐静脉内皮细胞EA.hy926与BMSCs共培养6 h后血管网络形成达到顶峰（见图4A）。与对照组相比，坏死组所形成血管网络中的交叉点和总分支长度均显著减少（见图4B）。

2.5 VCAM1对BMSCs促血管生成能力的影响

使用慢病毒载体特异性过表达了创伤性股骨头坏死患者来源BMSCs中的VCAM1，分为VCAM1组和NC组。qRT-PCR和WB的结果显示，与NC组相比，VCAM1组中VCAM1的mRNA和蛋白表达均显著上调（见图5）。此外，与NC组相比，VCAM1组所形成血管网络中的交叉点数量和总分支长度也显著增加（见图5）。

2.6 VCAM1过表达引起的BMSCs差异表达分析

NC组和VCAM1组BMSCs RNA-seq的差异表达分析结果显示，与NC组相比，VCAM1组BMSCs中共有305个基因上调和315个基因下调（见图6）。此外，与NC组相比，VCAM1组BMSCs中的多种生长因子如胎盘生长因子（placenta growth factor， PGF）、成纤维细胞生长因子14（fibroblast growth factor 14， FGF14）、肝素结合型EGF样生长因子（heparin-binding EGF-like growth factor， HBEGF）、神经生长因子（nerve growth factor， NGF）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein 3， IGFBP3）显著上调（见图6）。

2.7 差异表达基因的GO功能与KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果提示差异表达基因参与了细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction），雌激素信号通路（estrogen signaling pathway），黏着斑（focal adhesion），磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）和细胞因子与细胞因子受体的相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）等信号通路（见图7A）。GO功能富集分析结果显示，差异表达基因在生物过程方面主要富集于信号转导（signal transduction），细胞群体增殖的正向调节（positive regulation of cell population proliferation），以及ERK1和ERK2级联的正向调节（positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade）等；在细胞成分方面主要富集于细胞外间隙（extracellular space），胞外区（extracellular region）和含胶原蛋白的细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）等；在分子功能方面主要富集于信号受体结合（signaling receptor binding），细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）和结构分子活性（structural molecule activity）等（见图7B）。

3 讨论

血管生成对于骨骼发育、重塑和再生过程中的成骨至关重要，促进血管生成可能有助于股骨头坏死的预防和早期治疗^［2］。虽然研究报道了一些基因^［10］和非编码RNA^［11］参与了股骨头坏死中的血管生成过程，但对血管生成特定分子的研究依旧较少。此外，BMSCs在股骨头坏死的发病机制中起主导作用，例如其成骨/成脂分化稳态的破坏能够导致糖皮质激素诱导的股骨头骨坏死^［12］。因此本研究聚焦于VCAM1在创伤性股骨头坏死患者来源BMSCs中的表达及其对血管生成能力的影响。与单纯股骨颈骨折患者相比，股骨头坏死患者的BMSCs中VCAM1表达显著下调，并且血管生成能力明显降低。进一步通过VCAM1的过表达实验，验证了VCAM1在BMSCs血管生成中的关键作用，并通过转录组学分析揭示了其可能的调控机制。

本研究首先对两组患者来源的BMSCs进行了表型及分化能力鉴定。考虑到坏死组和对照组可能存在受伤时间差异等因素，这可能会影响BMSCs的一系列生物学特性。因此为了尽可能减少对实验结果的影响，我们首先匹配了患者的年龄、性别及基础疾病，以减少潜在的个体差异。其次，对照组选择了需要行人工髋关节置换术的股骨颈骨折患者，这些患者的BMSCs已暴露于骨折微环境，而非完全健康个体来源，以尽可能贴近临床现实情况。最后，检测对比两组BMSCs的生物学特性，结果显示两组BMSCs均符合MSC的典型表型，未见明显异常。与对照组相比，坏死组患者来源BMSCs的VCAM1（CD106）表达水平显著降低。进一步的体外血管形成实验表明，坏死组BMSCs在与人脐静脉内皮细胞共培养时，所形成的血管网络结构较对照组明显减少，表现在血管分支数和交叉点数显著降低。以上结果提示，VCAM1的下调可能导致BMSCs促血管生成能力的下降，从而影响股骨头坏死区域的新生血管形成。

VCAM1作为一种细胞黏附分子，除了调控白细胞与内皮细胞的相互作用外，已被证实参与多种疾病的血管生成过程。VCAM1从细胞表面裂解后以可溶性VCAM1释放到血液中，而胃癌患者的血清可溶性VCAM1水平显著高于正常人^［13］。Sano等^［14］在胰腺导管腺癌中形成的血栓中同样检测到高表达的VCAM1，使用VCAM1抗体对胰腺导管腺癌小鼠模型进行治疗后显著抑制了肿瘤生长和肿瘤血管生成。本研究在创伤性股骨头坏死患者BMSCs中观察到VCAM1表达的下降，提示其可能是股骨头坏死血管生成障碍的重要调控因子之一。

本研究结果显示过表达VCAM1后，BMSCs的血管生成能力显著增强。为了进一步探索VCAM1如何影响BMSCs的促血管生成能力，本研究进行了转录组测序分析。结果显示，过表达VCAM1的BMSCs中多种与血管生成相关的生长因子显著上调，包括PGF、FGF14、HBEGF、NGF和IGFBP3。PGF是血管内皮生长因子家族的一员，已被证明能够促进成人病理性血管生成^［15］。除了在内皮细胞中诱导自身的信号传导外，PGF还通过与VEGF协同作用促进血管生成过程^［16］。NGF在生理和病理血管生成中起重要作用，NGF不仅可以促进后肢缺血小鼠模型中的血管生成，还可以诱导缺血肢体的骨骼肌纤维重塑^［17］。HBEGF属于表皮生长因子家族，是体外和体内血管生成的有效诱导剂，其表达同样驱动多种肿瘤疾病的血管生成^{［18，19］}。另外，IGFBP3通过控制胰岛素样生长因子的生物利用度促进内皮细胞中细胞迁移和血管生成^［20］。这些证据支持了本研究的结果，即过表达VCAM1的BMSCs可能通过表达多种生长因子促进血管生成。

KEGG通路富集分析结果提示差异表达基因参与了细胞外基质受体相互作用，雌激素信号通路，黏着斑，PI3K-Akt信号通路和细胞因子与细胞因子受体的相互作用。内皮细胞、多种血管生成细胞因子与细胞外基质环境之间发生动态相互作用，细胞外基质和生长因子共同激活黏着斑通路，黏着斑激酶进一步激活PI3K-Akt信号通路^{［21，22］}。而PI3k/Akt通路已被证明与血管生成、氧化应激和缺血病理生理条件下MSCs的存活有关，多种预处理的MSCs都激活了PI3k/Akt通路从而调节细胞增殖、分化、凋亡和迁移^［23］。这些结果提示VCAM1可能通过这些信号途径介导BMSCs的促血管生成功能。这一发现为VCAM1在股骨头坏死中的功能提供了新的机制解释，也为未来的基因治疗策略提供了潜在靶点。

尽管本研究初步揭示了VCAM1在创伤性股骨头坏死中的潜在作用，但仍存在一定局限性。首先，本研究主要基于体外实验，未来应在动物模型中验证VCAM1修饰的BMSCs是否可促进血管新生并改善股骨头坏死的病理进程。其次，VCAM1的下调可能受转录因子或微环境信号调控，未来可通过CRISPR/Cas9等技术进一步研究其上游调控机制。最后，本研究仅纳入14例创伤性股骨头坏死患者和6例对照患者，未来可扩大样本量，并进一步匹配受伤时间，以提高研究的广泛适用性。

综上所述，本研究发现VCAM1在创伤性股骨头坏死患者BMSCs中表达下调，并导致血管生成能力下降。过表达VCAM1可恢复BMSCs的促血管生成能力，且其作用可能通过调节多种生长因子及PI3K-Akt等信号通路实现。这一发现为创伤性股骨头坏死的治疗提供了潜在的基因靶点，并为BMSCs的血管再生治疗策略提供了新的思路。

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基金资助

河南省医学科技攻关项目(242102310112)

河南省医学科技攻关项目(222102310349)