基于UPLC-Q-TOF-MS技术的银杏叶药材化学成分分析

Analysis of chemical components of Ginkgo Biloba leaves based on UPLC-Q-TOF-MS technology

摘要

目的 建立超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）方法，对银杏叶药材的化学成分进行快速分析与鉴定。 方法 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱，体积流量0.4 mL/min。根据精确质荷比和二级碎片离子信息，结合对照品和文献数据鉴定银杏叶药材中化学成分。 结果 银杏叶药材共鉴定出199个化学成分，包括有机酸类、氨基酸类、酚类、二肽类、脂类等，其中新指认出9个二肽类成分，9个氨基酸类成分，8个有机酸类成分和1个酯类成分。 结论 建立的UPLC-Q-TOF-MS方法灵敏度高、准确高效，能够全面、快速地分析和鉴定银杏叶药材中的化学成分。

Abstract

Objective To establish ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectro⁃metry（UPLC-Q-TOF-MS） for identifying the chemical components in Ginkgo Biloba. Methods Separation was performed on an ACQUITY UPLC BEH C₁₈ column（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm） using a mobile phase of 0.1% formic acid in water and acetonitrile under gradient elution at a flow rate of 0.4 mL/min. Chemical constituents were identified based on accurate mass measurements， MS/MS fragment ions， reference standards， and literature data. Results A total of 199 chemical constituents were identified， including organic acids， amino acids， phenolics， dipeptides， lipids， and others. Among them， nine dipeptides， nine amino acids， eight organic acids， and one ester were newly characterized. Conclusion The established UPLC-Q-TOF-MS method is highly sensitive， accurate and efficient， and can comprehensively and rapidly analyze and identify the chemical components in Ginkgo Biloba leaves.

Graphical abstract

关键词

UPLC-Q-TOF-MS / 银杏叶 / 化学成分 / 裂解途径 / 成分鉴定 / 中药成分

Key words

ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry / Ginkgo Biloba leaves / chemical composition / cleavage pathway / ingredient identification / ingredients of traditional Chinese medicine

银杏（Gingko biloba L.）是我国特有的一种珍贵树种，被誉为“活化石”和“植物界的熊猫”，属于银杏科银杏属植物。它是银杏科现存唯一的孑遗植物，在我国60多个县市分布，其叶产量占世界总产量的70%左右^［1］。银杏叶主要含有黄酮类和萜烯内酯类化合物，具有多种药理作用，如扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子、抗氧化、抗病毒、抑菌消炎、增强记忆和认知能力、抗衰老等^［2］。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技术可通过高效液相色谱实现对样品中各种化合物的高效分离，而飞行时间质谱则提供准确的分子质量和详细的二级质谱碎片信息，从而可以精确鉴定化合物的结构。此外，该技术还能够通过保留时间、精确分子量与二级质谱碎片离子信息等数据，结合成分数据库和相关文献，对复杂中药中的化学成分进行快速鉴定，为阐释复方的物质基础，进一步阐明其活性成分提供参考^［3-9］。故本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技术，对银杏叶药材的化学成分进行快速全面分析与鉴定，并阐明部分化合物可能的裂解途径，为后续银杏叶的活性成分及质量控制指标研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪、Xevo G2-XS Q-TOF/MS四极杆飞行时间质谱仪、ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）均购自美国Waters公司；ME204E型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；YP2002N型百分之一电子分析天平（上海菁海仪器有限公司）；KQ-800DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；Option R7 ultra AN超纯水系统（英国ELGA Lab Waters公司）；DZTW型电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；SY-5000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

银杏叶药材购买于山西益源大药房，经检查符合《中国药典》2020年版银杏叶项下的规定。槲皮素对照品（批号：YY90083，质量分数≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司，杨梅素对照品（批号：PS001011，质量分数≥98%）、柚皮素对照品（批号：PS010691，质量分数≥98%）、山奈素对照品（批号：PS0207-0025，质量分数≥98%）均购于成都普思生物有限公司，芹菜素对照品（批号：YJ-141108，质量分数≥98%）购于江苏永健医药有限公司，异鼠李素对照品（批号：110860-200608，质量分数≥98%）购于中国药品生物制品有限公司，芦丁（批号HR17513B1，质量分数≥98%）购于宝鸡市辰光生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司，LOT 230418）；甲酸（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司，20221001527）。

1.3 色谱及质谱条件

色谱条件：色谱柱Waters Acquity UPLC T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相为0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B），梯度洗脱：0~5 min 15% B，5~5.5 min 15%~18% B，5.5~10.5 min 18% B，10.5~11 min 18%~21% B，11~16 min 21% B，16~21 min 21%~35% B，21~30 min 35%~95% B，30~30.5 min 95%~15%，30.5~33 min 15% B；柱温40 ℃；进样量3 µL；流速0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式，检测模式为IDA，喷雾电压（IS）为+5 500 V、-4 500 V；离子源温度（TEMP）为500 ℃；气帘气（CUR）为30 psi；雾化气（GS1）和辅助气（GS2）分别为55 psi和50 psi；去簇电压（DP）为60 V。

1.4 溶液的制备

1.4.1 供试品溶液的制备

取银杏叶粉末10 g，加70%乙醇50 mL，加热回流提取1 h，将提取液浓缩至约40 mL后，过0.22 μm微孔滤膜后，即得。

1.4.2 对照品溶液的制备

分别取芹菜素、杨梅素、柚皮素、山奈素、异鼠李素、槲皮素、芦丁对照品适量，加甲醇制备成1.0 mg/mL的混合对照品储备液。取混合对照品储备液200 µL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容制成浓度分别为0.04 mg/mL混合对照品溶液。

1.4.3 空白溶液的制备

取70%乙醇溶液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.5 化学成分鉴定

质谱数据通过UNIFI软件处理，与化合物库中对照品图谱中已知成分的相对保留时间、准分子离子等进行比较，依据各对照品MS²碎片离子信息进一步确认。对于无对照品的化合物，依据一级质谱的分子离子质荷比与TCMSP专属数据库进行比对，前期推测再参考文献报道和二级质谱中相同成分的碎片离子信息进行匹配分析。

2 结果

2.1 化学成分鉴定

通过UPLC-Q-TOF-MS在正负离子模式下对银杏叶药材的化学成分进行定性分析，得到正负离子的质谱总离子流图（见图1），质谱数据与对照品图谱比较，并结合参考文献^［4-20］及二级质谱，共鉴定出银杏叶药材199个化学成分，其中新指认出9个二肽类成分，9个氨基酸类成分，8个有机酸类成分和1个酯类成分（见表1）。

2.2 化合物裂解规律

银杏叶中主要含有黄酮类和萜内酯类成分，所以本研究通过MS图谱数据信息，对黄酮类和萜内酯类成分的裂解规律进行总结。

2.2.1 黄酮类

本次研究共鉴定出26个黄酮类成分，如芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素等。该类化合物主要裂解方式包括取代基羟基、甲氧基等的断裂，母核C环开环断裂。黄酮类化合物的母核结构较为稳定，在质谱中常出现分子离子峰［M+H］⁺或［M-H］^-，其结构中羟基的位置和数量对裂解行为有重要影响^［13-15］。

例如，槲皮素^［10］（C₁₅H₁₀O₇）中3-OH和5-OH的存在使其在裂解过程中容易失去水分子，形成［M-H-H_₂O］^-等碎片离子，准分子离子峰m/z 303.049 9［M+H］⁺，根据二级质谱数据分析，基峰离子［M+H］⁺丢失H₂O形成碎片离子峰m/z 285.037 4，或丢失CO形成碎片离子峰m/z 275.042 3，碎片离子峰进一步失去C₆H₅O₂得到碎片离子峰165.017 8［M+H-CO-C₆H₅O₂］⁺，在此离子峰的基础上丢掉一分子H₂O，得到碎片离子峰153.017 8［M+H-CO-C₆H₅O₂-H₂O］⁺。

2.2.2 萜内酯类

本次研究共鉴定出12个萜内酯类。萜内酯类化合物的裂解途径具有一定特点，内酯环在质谱中容易发生开裂，产生相应的碎片离子。例如，银杏内酯A（C₂₀H₂₄O₉）在裂解过程中，内酯环断裂可形成［M-H-CO₂］^-等碎片离子。萜内酯类化合物的侧链结构也会影响其裂解行为，如银杏内酯B（C₂₀H₂₄O₉）的侧链结构在裂解时会产生一些特征碎片离子^{［15，16］}。银杏内酯A一级质谱图显示m/z 409.149 3，为分子离子峰［M-H］^-，二级质谱中有m/z 405.149 8，391.136 4，373.130 1，363.144 1，345.133 8，299.127 6，255.137 4，253.122 2，分别对应离子峰［M-H+HCOOH］^-、［M-H-2CO］^-、［M-H-2CO-CO₂］^-、［M-H-2COCO₂-H₂O］^-、［M-H-2CO-2CO₂-H₂O］^-、［M-H-2CO₂］^-、［M-H-2CO-H₂O］^-、［M-H-2CO-COH₂O］^-，与文献资料报道的离子碎片一致^［11］。

3 讨论

本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对银杏叶提取物化学成分进行整体分析。以银杏叶为研究对象，用70%乙醇作为提取溶剂，从银杏叶提取物中共鉴定出199个化学成分，包括黄酮类、内酯类、有机酸类、氨基酸类、酚类、二肽类、脂类、酯类、糖类、异黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、黄酮烷类、萘酮类、双黄酮类等多种类型。其中新指认出9个二肽类成分，9个氨基酸类成分，8个有机酸类成分和1个酯类成分。

银杏叶具有扩张血管、改善脑循环、抗氧化、抑菌消炎、增强记忆和认知能力等作用，可通过抗炎、神经保护等作用发挥其抗缺血的作用^［21］；可通过减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等炎症相关因子的生成和释放，减轻神经组织的损伤^［22-24］；可通过调节免疫、抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤新生血管生成和抑制环氧合酶2表达发挥抗肿瘤作用^［25-30］。本研究新指认的二肽类成分具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、免疫调节等作用^［31-35］，缬氨酸等氨基酸类成分具有提高机体免疫力、维持机体正常代谢、抗氧化等作用^［36-39］，苹果酸等有机酸类成分具有消除疲劳、改善胃肠道功能、抗氧化、抗炎、改善心脑血管疾病等作用^［40-44］。因此，本研究推断新指认的缬氨酸、苹果酸等成分，可能为银杏叶中的活性成分，但这些成分均为初级代谢物。

目前对中药活性成分的研究只关注次级代谢物，而初级代谢物在中药中的含量远高于次级代谢物，应提高对这些初级代谢物的关注度，以全面评价中药中的活性成分。通过本次研究，后续对银杏叶中新指认出的二肽类、氨基酸类、有机酸类等初级代谢物进行相应的活性评价，可丰富银杏叶的活性成分群，为充分寻找银杏叶的活性成分及质量控制指标奠定基础。

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