EGR3通过β⁃catenin/MMP通路抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭

EGR3 inhibits breast cancer cell migration and invasion by β-catenin/MMP pathway

摘要

目的 基于β-catenin/MMP通路探讨早期生长反应因子3（EGR3）对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制。　方法使用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测EGR3在不同的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和HCC-1937）和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中的表达。选择EGR3表达最低的细胞为研究对象，分为空载体（Empty）组、EGR3组和EGR3+Wnt3a组，分别转染空载质粒、EGR3过表达载体、EGR3过表达载体质粒并添加50 μg/mL β- catenin信号通路激活剂Wnt3a。未行转染处理的细胞命名为假处理（mock）组。划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭；Western blot检测神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基质金属蛋白酶-7（MMP-7）、MMP-9、β-连环蛋白（β-catenin）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表达。 结果 与MCF-10A细胞相比，乳腺癌细胞中EGR3的表达显著降低（P<0.05），且MDA-MB-231细胞中的表达量最低。与mock组相比，EGR3组EGR3表达升高（P<0.05），细胞迁移和侵袭能力，以及N-cadherin、Vimentin、MMP-7、MMP-9、β-catenin和GSK-3β水平均降低（P<0.05），而E-cadherin水平升高（P<0.05）；与EGR3组相比，EGR3+Wnt3a组EGR3表达（P<0.05），细胞迁移和侵袭能力，以及N-cadherin、Vimentin、MMP-7、MMP-9、β-catenin和GSK-3β水平均升高（P<0.05），而E-cadherin水平降低（P<0.05）。 结论 EGR3通过抑制β- catenin/MMP通路的激活阻碍乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

Abstract

Objective To investigate the effect and its mechanism of early growth response factor 3（EGR3） on the migration and invasion of breast cancer cells based on the β-catenin/MMP pathway. Methods Real-time quantitative PCR（qPCR） and Western blot were used to detect EGR3 expression in different breast cancer cell lines（MDA-MB-231， MDA-MB-453， MCF-7 and HCC-1937） and human normal breast epithelial cell line MCF-10A. The cells with the lowest EGR3 expression were chosen as the research subjects. The cells were transfected with empty vector， EGR3 overexpression vector， and EGR3 overexpression vector plasmid+50 μg/mL β- catenin signaling pathway activator Wnt3a in empty group， EGR3 group， and EGR3+Wnt3a group， respectively. The MDA-MB-231 cells without transfection treatment were named as mock group. Scratch test and Transwell assays were used to detect cell migration and invasion； Western blot was used to detect the expressions of N-cadherin， E-cadherin， Vimentin， matrix metalloproteinase-7（MMP-7）， MMP-9， β-catenin and glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）. Results Compared with MCF-10A cells， EGR3 expression in breast cancer cells was reduced（P<0.05）， and the expression in MDA-MB-231 cells was the lowest. Compared with mock group， EGR3 expression was increased in EGR3 group（P<0.05）， the cell migration and invasion abilities，and the levels of N-cadherin， Vimentin， MMP-7， MMP-9， β-catenin， and GSK-3β were reduced（P<0.05），and E-cadherin level was increased（P<0.05）. Compared with EGR3 group， EGR3 expression was reduced in EGR3+Wnt3a group（P<0.05）， the cell migration and invasion abilities，and the levels of N-cadherin， Vimentin， MMP-7， MMP-9， β-catenin， and GSK-3β were increased（P<0.05）， and E-cadherin level was reduced（P<0.05）. Conclusion EGR3 can inhibit the migration and invasion of breast cancer cells by inhibiting the activation of β-catenin/MMP pathway.

Graphical abstract

关键词

EGR3 / 乳腺癌细胞 / 基质金属蛋白酶 / β-连环蛋白 / Wnt3a / 迁移 / 侵袭

Key words

EGR3 / breast cancer cells / MMP / β-catenin / Wnt3a / migration / invasion

乳腺癌（breast cancer，BC）是全世界女性中最常见的恶性肿瘤之一^［1］。尽管BC患者的预后得到改善，并且根治性手术以及辅助治疗取得了进展，但该疾病仍然容易复发，并且持续保持着较高的死亡率^［2］。BC远处转移（如至肺、骨、肝、脑）是导致其高死亡率的主要原因之一^［3］。攻克这一难题的关键在于阐明BC发病机制并发现新的治疗靶点，尽管相关研究正在进行，但需求仍迫切。早期生长反应因子3（early growth response 3，EGR3）是一种早期转录因子，其经典功能主要与神经发育相关^［4］。然而，EGR3也在多种肿瘤中表达，其水平可受多种因素调控^［5］。且近年研究发现其在肿瘤发生发展中扮演重要角色。例如，在胃癌中，EGR3表达下调与患者预后不良相关^［6］。在前列腺癌细胞中，EGR3可阻断EMT过程，抑制细胞迁移和侵袭^［7］。此外，EGR3促进乳腺癌对他莫西芬的耐药性^［5］。另外，现有的证据已表明EGR3在乳腺癌组织中表达下调^［8］，然而，EGR3在乳腺癌进展中的作用及分子机制仍不明确。本实验通过探究EGR3对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响以及相关机制，为乳腺癌的治疗提供理论机制和潜在的靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂

乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和HCC-1937）和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；β-catenin信号通路激活剂Wnt3a购自美国Peprotech公司；Trizol试剂和M-MLV逆转录试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；EGR3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-7、MMP-9、β-catenin和GSK-3β抗体及IgG-HRP二抗购自美国Abcam公司；EGR3过表达载体质粒及空载体购自云舟生物科技（广州）股份有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；SYBR Premix Ex Taq II检测试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PVDF膜、ECL发光试剂、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司。

1.2 细胞培养和分组处理

本研究中使用的所有细胞系均在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，将细胞培养在37 ℃、5％CO₂、湿润培养箱中。

将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行常规培养至达到约70%~80%汇合度。将EGR3过表达载体质粒、空载质粒以及Lipofectamine 2000试剂分别用无血清的RPMI 1640培养基稀释，混合后室温孵育20 min形成转染复合物，随后加入细胞培养基中。转染5 h后，更换为含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基，以此将细胞分为EGR3组和空载体（empty）组。未行转染处理的MDA-MB-231细胞命名为假处理（Mock）组。为了研究Wnt3a的影响，在更换转染EGR3过表达质粒细胞的完全培养基中添加50 μg/mL Wnt3a，命名为EGR3+Wnt3a组。在转染及相应处理后48 h，收集所有组别的MDA-MB-231细胞，用于后续实验分析。

1.3 qPCR检测EGR3 mRNA表达

使用TRIzol分离出乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和HCC-1937）和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中的总RNA，然后使用M-MLV逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II进行qPCR，包括 95 ℃ 30 s的预变性，随后进行40个循环，每个循环包含95 ℃ 5 s变性和 60 ℃ 30 s退火/延伸。EGR3基因的相对表达水平通过2^-ΔΔCt 法计算。引物序列如下：①EGR3正向引物：5'-ATGACCGGCAAACTCGCCG-3'，反向引物：5'-ATCCTCAGGCGCAGGTGGT-3'；②GAPDH正向引物：5'-GACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，反向引物：5'-TTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'。

1.4 划痕实验分析MDA-MB-231细胞迁移

MDA-MB-231细胞接种至24孔板上，37 ℃继续培养，待细胞生长至汇合后，使用无菌枪头于单层细胞上进行划痕，采用PBS洗去细胞及碎片，然后在RPMI 1640培养基中孵育24 h，拍照记录开始（0 h）和结束（24 h）时划痕距离，统计各组MDA-MB-231细胞划痕愈合率（%）。

1.5 Transwell实验分析MDA-MB-231细胞侵袭

将2×10⁵细胞接种到涂有Matrigel的8 μm Transwell小室的顶部，下部室装有600 μL RPMI 1640培养液，其中添加了10％FBS。24 h后，细胞经固定和染色，计算侵袭细胞数。

1.6 Western blot检测蛋白表达

使用RIPA裂解液处理乳腺癌细胞系和人正常乳腺上皮细胞系，提取总蛋白，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭后，将PVDF膜与一抗［EGR3抗体（1∶2 000）、E-cadherin抗体（1∶1 000）、N-cadherin抗体（1∶8 000）、Vimentin抗体（1∶1 000）、MMP-7抗体（1∶1 000）、MMP-9抗体（1∶8 000）、β-catenin抗体（1∶8 000）、GSK-3β抗体（1∶1 000）或GAPDH（1∶10 000）］抗体孵育，随后和二抗孵育，并使用ECL试剂进行检测。使用FluroChem E成像仪对Western印迹进行可视化，使用Quality One软件计算相应蛋白质表达的变化。

1.7 统计学分析

计量资料以均数±标准差（X±S）表示，用SPSS 21.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析或SNK-q检验分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGR3在乳腺癌细胞中呈低表达

与人正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，在乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7和HCC-1937细胞中EGR3 mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05，见图1），并且在MDA-MB-231细胞中的基础表达量最低，因此后续实验选择MDA-MB-231细胞作为研究对象。

2.2 EGR3在MDA-MB-231细胞中的转染效率

与mock组相比，EGR3组MDA-MB-231细胞中EGR3 mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）；mock组和empty组间EGR3的表达差异无统计学意义（P>0.05，见图2）。

2.3 过表达EGR3对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

与mock组相比，EGR3组MDA-MB-231细胞划痕愈合率明显降低（P<0.05）；mock组和empty组间MDA-MB-231细胞划痕愈合率差异无统计学意义（P>0.05）；与EGR3组相比，EGR3+Wnt3a组MDA-MB-231细胞划痕愈合率明显升高（P<0.05，见图3）。

2.4 过表达EGR3对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

与mock组相比，EGR3组侵袭细胞数显著减少（P<0.05）；mock组和empty组比较，侵袭细胞数差异无统计学意义（P>0.05）；与EGR3组相比，EGR3+Wnt3a组侵袭细胞数显著增多（P<0.05，见图4）。

2.5 过表达EGR3对MDA-MB-231细胞EMT过程的影响

与mock组相比，EGR3组MDA-MB-231细胞中N-cadherin和Vimentin的表达明显降低（P<0.05），E-cadherin的表达明显升高（P<0.05）；mock组和empty组间E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达差异无统计学意义（P>0.05）；与EGR3组相比，EGR3+Wnt3a组MDA-MB-231细胞中N-cadherin和Vimentin的表达明显升高（P<0.05），E-cadherin的表达明显降低（P<0.05，见图5）。

2.6 过表达EGR3对MDA-MB-231细胞中β-catenin/ MMP通路激活的影响

如图6所示，与mock组相比，EGR3组MDA-MB-231细胞中β-catenin、GSK-3β、MMP-7和MMP-9的表达明显降低（P<0.05）；mock组和empty组间β- catenin、GSK-3β、MMP-7和MMP-9的表达差异无统计学意义（P>0.05）；与EGR3组相比，EGR3+Wnt3a组MDA-MB-231细胞中β-catenin、GSK-3β、MMP-7和MMP-9的表达明显升高（P<0.05）。

3 讨论

最近研究表明，EGR3在多种类型癌症中异常表达，在恶性肿瘤中主要发挥抑癌的作用^［9］。例如，沉默EGR3可逆转miR-210抑制剂对HepG2和HepG2.2.15细胞的抗肿瘤作用^［10］。在MGMT基因甲基化的神经胶质瘤患者中，观察到EGR3的表达水平较高，并且这种高表达与不良的生存预后显著相关。值得注意的是，EGR3可能还参与了肿瘤细胞的迁移过程。因此，EGR3的表达水平或许可以作为MGMT甲基化患者的一个潜在预后标志物^［9］。基因芯片分析确定了一个含有富AU元件的基因EGR3作为非小细胞肺癌中KH型剪接调节蛋白的下游效应子，进一步发现miR-23a降低EGR3的表达，从而抑制非小细胞肺癌细胞的迁移^［11］。另外已有研究指出EGR3参与乳腺癌的发展。周杰等^［8］发现EGR3在乳腺癌组织中的表达显著低于正常对照。本研究发现EGR3在乳腺癌细胞系中的表达显著下调。也有研究显示EGR3能诱导乳腺癌细胞凋亡^［5］，且EGR3调控乳腺癌细胞中雌激素信号通路^［12］。基于此背景，本研究重点探究了EGR3对乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和EMT功能的影响。尽管已有证据表明EGR3抑制雌激素介导的侵袭^［13］，但本研究首次发现过表达EGR3，即使在不依赖雌激素的条件下，也能够有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭和EMT的发生。这拓展了EGR3在乳腺癌中作用机制的认识，不仅证实了其抑制侵袭的作用，更揭示了EGR3在抑制细胞迁移、侵袭及诱导EMT这一关键转移步骤中的广泛功能。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是主要的蛋白酶家族之一，与肿瘤的发生、肿瘤微环境、血管生成、细胞迁移、侵袭及转移等过程密切相关^［14］。MMP的主要作用是裂解和水解细胞外基质底物蛋白和细胞间黏附分子，增加细胞运动性、迁移和侵袭能力^［15］。Wnt通路能够调控细胞的增殖和分化，其中，β-catenin通路是这一通路中最为关键且被广泛研究的一个分支^［16］。已经发现，β- catenin途径在多种癌症中均被异常激活^［17-19］。有趣的是，MMP-7是一种分泌的锌和钙依赖性内肽酶，是β-catenin信号传导下游最重要的靶基因之一，其表达与胰腺癌、结肠癌、脑癌和乳腺癌的不良预后有关^{［20，21］}。此外，有研究显示，MMP-9的近端启动子序列中，人与小鼠之间的β-catenin结合基序是保守的，β-catenin/MMP-9调控轴与肿瘤的侵袭性、转移和耐药性相关^［22］。且已有证据表明β- catenin/MMP-9通路能促进入乳腺癌细胞迁移和侵袭^［23］。然而是否EGR3通过β-catenin/MMP通路调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭还未报道。本实验结果显示，过表达EGR3可以降低β-catenin、GSK-3β、MMP-7和MMP-9蛋白水平，而β-catenin信号通路特异性激活剂Wnt3a能够有效逆转过表达EGR3对β- catenin、GSK-3β、MMP-7和MMP-9蛋白表达的抑制影响。以上结果说明EGR3可通过抑制β-catenin/MMP通路激活来抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。

本研究主要基于体外细胞模型，且仅选取了有限乳腺癌细胞系，可能难以完全代表体内复杂的肿瘤微环境及不同亚型特性。加之结果未经动物模型验证，缺乏体内数据支持，故关于EGR3通过β- catenin/MMP通路抑制乳腺癌细胞迁移侵袭的结论，尚需体内实验进一步确证。未来研究将构建动物模型以模拟体内环境，并扩大实验范围纳入更多亚型细胞系，以增强结论的普适性与可靠性。同时，亦将探索EGR3与其他信号通路的交互作用及其在乳腺癌治疗中的潜在价值。这些深入探索有望为乳腺癌的早期诊断、治疗及预后评估提供新思路。

综上，EGR3在乳腺癌细胞中表达下调，其过表达可通过失活β-catenin/MMP通路抑制细胞迁移侵袭，提示EGR3有望成为新型治疗靶标，对乳腺癌的临床诊治具有重要意义。

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基金资助

希思科-恒瑞肿瘤研究基金项目(Y-HR2018-362)