酸枣仁汤对GAD65相关癫痫的治疗效果

Therapeutic effect of Suanzaoren decoction on GAD65⁃related epilepsy

摘要

目的 探讨酸枣仁汤对谷氨酸脱羧酶65（GAD65）相关癫痫的抗癫痫作用及其机制。 方法 取70只小鼠，10只作为对照组，60只作为造模组。造模组小鼠经尾静脉注射鼠源GAD65单克隆抗体（100 μg/mL，0.1 mL/只），连续3 d。之后，每日腹腔注射戊四氮（PTZ，10 mg/kg），连续7 d，诱导癫痫发作并评价癫痫发作潜伏期与等级。取模型制备成功小鼠，随机分为模型组、阳性药组（苯妥英钠，100 mg/kg）、酸枣仁汤低、中、高剂量组（10，25，50 g/kg），每组10只。阳性药组以10 mg/mL苯妥英钠溶液灌胃；酸枣仁汤低、中、高剂量组小鼠分别以生药浓度为1，2.5，5 kg/L的酸枣仁汤灌胃；模型组和对照组以等体积生理盐水灌胃；给药28 d。给药第1，7，14，21，28天，通过Racine分级标准评估治疗效果。末次行为学观察结束，将小鼠颈椎脱臼处死，取颞叶皮层组织。通过试剂盒检测大脑颞叶皮层中γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸（Glu）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与IL-10含量；通过Western blot检测GAD65、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）与Bcl-2相关X（Bax）蛋白表达。 结果 与对照组相比，造模组小鼠均出现3级以上的癫痫症状。与模型组相比，阳性药组小鼠自给药第1天，癫痫发作潜伏期明显延长（P<0.05），发作等级明显降低（P<0.05）；酸枣仁汤中、高剂量组自给药第7天，癫痫发作潜伏期明显延长（P<0.05），发作等级明显降低（P<0.05），而酸枣仁汤低剂量组给药期，癫痫发作潜伏期和等级都未见明显变化。此外，与对照组相比，模型组小鼠大脑颞叶皮层中GABA含量和IL-10减少（P<0.05），Glu含量和IL-6、TNF-α水平增加（P<0.05），GAD65、Bcl-2蛋白表达明显减少（P<0.05），NLRP3、p-NF-κB、Bax蛋白表达明显增加（P<0.05）。与模型组相比，酸枣仁汤中、高剂量组小鼠大脑颞叶皮层中GABA和IL-10含量明显增加（P<0.05），Glu和IL-6、TNF-α含量明显减少（P<0.05），GAD65、Bcl-2蛋白表达明显增加（P<0.05），NLRP3、p-NF-κB、Bax蛋白表达明显减少（P<0.05）。 结论 酸枣仁汤对癫痫存在明显的治疗作用，其机制可能与提高GAD65蛋白表达、促进Glu向GABA转化有关，也可能与抑制炎症反应相关。

Abstract

Objective To investigate the antiepileptic effect of Suanzaoren decoction（SZRD） for glutamate decarboxylase-65（GAD65） associated epilepsy and its underlying mechanism. Methods Seventy mice were randomly divided into control group（n=10） and model group（n=60）. The mice in model group were intravenously injected with murine GAD65 monoclonal antibody（100 μg/mL， 0.1 mL） daily for 3 d. Then， these mice were intraperitoneally injected with pentylenetetrazol（PTZ， 10 mg/kg） daily for 7 d to induce seizures. After the evaluation of seizure latency and severity， the mice with epileptic symptoms were randomly divided into five groups： model group， positive control group（phenytoin sodium， 100 mg/kg）， and Suanzaoren decoction（SZRD） low（10 g/kg）， medium（25 g/kg）， and high（50 g/kg） groups， with 10 mice in each group. The mice in positive control group were orally administrated with phenytoin sodium solution（10 mg/mL）， while the mice in SZRD groups were treated with SZRD solution at the crude drug concentrations of 1， 2.5， 5 kg/L， respectively. The mice in model group and control group received saline. The treatment lasted 28 d. At days 1， 7， 14，21， 28 of the treatment， the antiepileptic efficacy was assessed using the Racine seizure-severity scale. After the last behavior test， the mice were sacrificed to collect temporal cortex tissues. The contents of cytokines such as γ-aminobutyric acid（GABA）， glutamate（Glu）， interleukin-6（IL-6）， tumor necrosis factor-α（TNF-α）， and interleukin-10（IL-10） in the temporal cortex tissues were detected by kits， while the protein expressions of GAD65， nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）， phosphorylated nuclear factor κB（p-NF-κB）， B-cell lymphoma-2（Bcl-2）， and Bcl-2-associated X（Bax） were detected by Western blot. Results Compared with control group， the mice in model group exhibited epileptic symptoms above Racine stage 3. Compared with model group， the mice showed a prolonged seizure latency and reduced seizure severity from day 7 in positive control group（P<0.05）， and the mice in medium and high SZRD groups showed antiepileptic effects similar to that of positive control group（P<0.05）， whereas the mice showed no any improvement. Compared with control group， the mice in model group showed decreased contents of GABA and IL-10（P<0.05）， increased contents of Glu， IL-6， and TNF-α（P<0.05）， downregulated expressions of GAD65 and Bcl-2 proteins（P<0.05）， and elevated expressions of NLRP3， p-NF-κB， and Bax proteins（P<0.05）. Compared with model group， the mice in medium and high SZRD groups showed increased contents of GABA and IL-10（P<0.05）， decreased contents of Glu， IL-6， and TNF-α（P<0.05）， upregulated expressions of GAD65 and Bcl-2 proteins（P<0.05）， and downregulated expressions of NLRP3， p-NF-κB， Bax proteins（P<0.05）. Conclusion SZRD exerts a pronounced antiepileptic effect， which may be related to the upregulated GAD65 expression and the conversion of glutamate to GABA， and also related to the suppression of inflammation.

Graphical abstract

关键词

酸枣仁汤 / 癫痫 / GAD-65 / γ-氨基丁酸 / 谷氨酸 / 炎症反应

Key words

Suanzaoren decoction / epilepsy / GAD-65 / γ-aminobutyric acid / glutamate / inflammatory response

流行病学调查数据显示，我国癫痫患者总数约为1 000万例。尽管目前临床可用抗癫痫药物已达20余种，但治疗现状仍面临诸多挑战。深入探索新型治疗策略和完善预防体系具有重要的临床价值和社会意义^［1］。中医学理论认为，癫痫病机在脑，因痰浊交阻、血瘀留滞，逢风引发气机失调，清窍蒙蔽，致原神失控，神机失用^［2］。因此，中医临床上癫痫主要以涤痰息风、开窍安神药物治疗。酸枣仁汤出自张仲景《金匮要略》，属安神类中药方剂，具有滋阴养血、安神益智之效。已有临床研究显示，酸枣仁汤联合丙戊酸钠能够明显提高单药治疗的外伤性癫痫效果^［3］。然而，现阶段尚未有关于安神类中药方剂治疗癫痫的非临床研究。谷氨酸脱羧酶65（glutamate decarboxylase 65， GAD65）通常存在于细胞末端突触小泡中，主要以脱羧酶辅酶无活性形式存在，在体内能够催化兴奋性神经递质Glu生成抑制性神经递质GABA，诱发癫痫发生^［4］。本研究拟制备GAD65相关癫痫模型，探索安神类中药方剂酸枣仁汤治疗效果，研究其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级C57BL/6J小鼠，6周龄，体质量18~20 g，雄性，共70只，由新疆医科大学动物实验中心提供，入组后饲养于新疆医科大学SPF级实验动物房。本实验经新疆医科大学动物伦理委员会审批，伦理编号：IACUC230903。

1.2 实验试剂与仪器

兔源抗小鼠GAD65抗体（英国abcam公司）；鼠源单克隆GAD65抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；戊四氮（Pentylenetetrazol， PTZ）、苯妥英钠（美国MCE公司）；γ-氨基丁酸（4-aminobutyric acid， GABA）试剂盒、谷氨酸（glutamic acid， Glu）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；抗小鼠白细胞介素-6（interleukin-6， IL-6）试剂盒、抗小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）试剂盒、抗小鼠IL-10试剂盒（杭州联科生物公司）。兔抗鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）蛋白抗体、NF-κB蛋白抗体、磷酸化核因子κB（phosphor-nuclear factor kappa B， p-NF-κB）蛋白抗体、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）蛋白抗体、Bcl-2相关X（Bcl-2-associated X， Bax）蛋白抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（北京博奥森生物科技公司）。

旋转蒸发仪（上海贤德公司）；尾静脉注射可视仪（河南智科公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；电泳套装（美国Bio-Rad公司）；化学发光成像仪（上海天能公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 酸枣仁汤制备

参考张仲景《金匮要略·血痹虚劳脉证并治》第六篇中关于酸枣仁汤原方，综合考虑人与动物剂量换算等多方面因素进行剂量加减，最终选用药材及治疗剂量如下：酸枣仁（炒）30 g、知母6 g、茯苓6 g、川芎9 g、甘草（炙）3 g。煎煮前清洗、浸泡20 min，加入清水煎煮20 min，过滤收集药液，药渣中继续加入清水煎煮20 min，收集药液。通过旋转蒸发仪将药液浓缩至酸枣仁生药浓度为1，2.5，5 g/mL作为低、中、高剂量组药液，分装后放入-20 ℃备用。

1.3.2 模型制备与试验流程

70只检疫合格小鼠，选取10只作为对照组，其余60只作为造模组，用于构建GAD65抗体相关的自身免疫性癫痫模型^［5］。第1~3天（抗体诱导阶段）：造模组小鼠经尾静脉注射鼠源GAD65单克隆抗体（100 μg/mL，0.1 mL/只），连续3 d。第4~10天（PTZ点燃阶段）：自第4天起，每日上午9：00~10：00腹腔注射戊四氮（PTZ，10 mg/kg），连续7 d，诱导癫痫发作。对照组：同期给予等体积生理盐水。每日PTZ注射后30 min内，采用Racine分级标准评估小鼠癫痫发作行为，筛选模型成功的小鼠用于后续实验。

根据行为学评估结果选取模型制备成功小鼠，以发作潜伏期为主要指标，将造模组小鼠随机分为模型组、阳性药组（100 mg/kg），酸枣仁汤低剂量组（10 g/kg），酸枣仁汤中剂量组（25 g/kg），酸枣仁汤高剂量组（50 g/kg），每组10只。阳性药组以10 mg/mL苯妥英钠溶液灌胃，酸枣仁汤低、中、高剂量组小鼠以生药浓度为1，2.5，5 kg/L的酸枣仁汤灌胃，模型组小鼠以生理盐水灌胃，连续给药28 d，灌胃体积10 mL/kg，给药时间为每日8：00-9：00。每日给药后1 h，腹腔注射PTZ（10 mg/kg）造模。

给药第1，7，14，21，28天，各组小鼠再次尾静脉注射GAD65抗体（100 μg/mL，0.1 mL），随后腹腔注射PTZ（10 mg/kg），观察30 min内的癫痫发作行为。末次行为学观察结束，将所有小鼠颈椎脱臼处死，取颞叶皮层组织用于蛋白表达和细胞因子含量检测。

1.3.3 癫痫发作行为学评估

参考Racine分级标准^［6］，将癫痫发作分为6个等级。0级：无任何症状；1级：动物出现鼓腮、胡须抖动，面部间断性抽搐；2级：动物口角流涎，节律性点头，背部毛湿润，全身阵挛性抽动；3级：2级基础上出现上肢站立性抖动情况；4级：后肢直立，全身阵挛性抽搐；5级：出现反复跌倒，抽搐频繁，全身肌肉强直。根据动物反应情况，在对应评级基础上进行0.5级增加。连续5 d出现3级及以上癫痫行为视为模型构建成功。

1.3.4 ELISA法检测颞叶皮层组织中GABA、Glu、IL-6、TNF-α与IL-10含量

取小鼠颞叶皮层组织，加入PBS，机械匀浆后离心，收集上清液。参考试剂盒说明书要求加入样品或检测试剂，在要求的条件下孵育对应的时间，通过酶标仪在特定波长下检测样品吸光度值，通过标准曲线计算各个细胞因子含量。

1.3.5 Western blot检测颞叶皮层组织中GAD65、NLRP3、p-NF-κB、Bax与Bcl-2蛋白表达

取小鼠颞叶皮层组织，加入裂解液，机械匀浆后离心，收集上清液，加入上样缓冲液混合，煮沸后制备成检测样品。取SDS-PAGE凝胶，每孔加入等量蛋白样品（15~30 μg），开启凝胶电泳，待上样缓冲液到达底部，停止电泳。通过湿法转膜，经4%小牛血清封闭后，加入兔抗鼠GAD65蛋白抗体（1∶1 000）、NLPR3蛋白抗体（1∶1 000）、NF-κB蛋白抗体（1∶1 000）、p-NF-κB蛋白抗体（1∶1 000）、Bax蛋白抗体（1∶1 000）、Bcl-2蛋白抗体（1∶1 000）及β-actin蛋白抗体（1∶2 000）。4 ℃孵育12 h，洗去膜表面抗体，加入辣根过氧化酶偶联山羊抗兔IgG（H+L）抗体（1∶5 000），室温孵育2 h，洗去表面抗体，滴加化学发光液，显影仪中获得各个蛋白条带。

1.3.6 统计学分析

本研究结果分析通过SPSS 23.0软件进行，以均数±标准差（X±S）表示，组间重复测量指标比较采用重复测量方差（repeated measures ANOVA）分析，组间单次测量指标比较采用单因素方差（one way ANOVA）分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸枣仁汤对癫痫发作潜伏期及发作等级的影响

对照组动物没有构建癫痫模型，未出现任何癫痫症状，发作潜伏期记录为最大观察时间30 min，癫痫等级为0。模型构建过程中，共53只小鼠判定为模型构建成功。取所有模型构建成功小鼠，剔除体质量最轻的3只，最终入组50只，按癫痫发作潜伏期随机分组，每组10只，并保证组间动物体质量与发作等级无明显差异。

给药期间，模型组小鼠持续出现癫痫症状。与模型组相比，阳性药组第1天给药后，小鼠即出现明显的癫痫发作潜伏期延长（P<0.05，见表1），癫痫发作等级降低（P<0.05，见表2），低、中、高剂量组及阳性药组，从第1天到第28天，癫痫发作潜伏期渐增。这说明给药次数越多，癫痫发作潜伏期延长的效果越明显，且给药次数越多，效果越好。与模型组相比，第1天给药后，酸枣仁汤各剂量组都未表现出发作潜伏期延长与发作等级降低作用，但持续给药至第7天，酸枣仁汤高、中剂量组癫痫发作潜伏期都明显延长（P<0.05），且癫痫发作等级明显降低（P<0.05），但酸枣仁汤低剂量组却没有明显变化（见表1、表2）。

2.2 酸枣仁汤对小鼠颞叶皮层中GABA和Glu含量的影响

与对照组相比，模型组小鼠颞叶皮层组织中GABA含量明显减少（P<0.05），Glu含量明显增加（P<0.05，见表3）。与模型组相比，阳性药组GABA含量没有明显变化，Glu含量明显减少（P<0.05）；酸枣仁汤中剂量组与酸枣仁汤高剂量组GABA含量明显增加（P<0.05），Glu含量明显减少（P<0.05）；酸枣仁汤低剂量组GABA含量没有明显变化（见表3）。

2.3 酸枣仁汤对小鼠颞叶皮层组织中炎性细胞因子含量的影响

与对照组相比，模型组小鼠颞叶皮层组织中IL-6与TNF-α含量明显减少（P<0.05），IL-10含量明显增加（P<0.05，见表4）。与模型组相比，阳性药组、酸枣仁汤中、高剂量组小鼠颞叶皮层组织中IL-6和TNF-α含量明显增加（P<0.05），IL-10含量明显减少（P<0.05），但酸枣仁汤低剂量组各炎性细胞因子含量没有明显变化（见表4）。

2.4 酸枣仁汤对GAD65、NLRP3、p-NF-κB、Bax与Bcl-2蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组GAD65蛋白表达明显减少（P<0.05），NLRP3、p-NF-κB、Bax蛋白表达明显增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表达明显减少（P<0.05，见图1）。与模型组相比，阳性药组和酸枣仁汤低剂量组GAD65表达没有明显变化，酸枣仁汤中、高剂量组GAD65表达明显增加（P<0.05）。此外，与模型组相比，阳性药组、酸枣仁汤中、高剂量组NLRP3、p-NF-κB、Bax蛋白表达明显减少（P<0.05），Bcl-2蛋白表达明显增加（P<0.05），但酸枣仁汤低剂量组没有明显变化（见图1）。

3 讨论

癫痫是由大脑神经元群的异常同步放电引发的中枢神经系统疾病^［1］。其发病机制众多，通常被分为结构性、遗传性、感染性、免疫性等多种类型^［7］。目前研究显示，约20%难治性癫痫属于自身免疫性^［8］，而现有治疗方案对这些患者的疗效仍不理想。中医药治疗癫痫多靶点、多效应的优势展现出独特的治疗效果。

临床研究表明，GAD65抗体在众多自身免疫性癫痫患者脑脊液中明显升高^［9］。为深入探究GAD65抗体在癫痫发病中的作用，本研究创新性地采用GAD65抗体联合低剂量PTZ，（10 mg/kg）构建癫痫模型。与传统的PTZ致痫模型（30~40 mg/kg）^{［10，11］}相比，该联合干预方案不仅成功诱导小鼠出现典型的癫痫发作行为，且模型构建效率显著提高。值得注意的是，GAD65抗体的引入大幅降低了PTZ的致痫阈值，提示其可能通过影响神经元兴奋性，增强中枢神经系统对PTZ的敏感性。进一步的分子机制研究表明，模型组小鼠脑组织中GAD65蛋白表达显著下调，导致其催化活性受限，进而引发神经递质稳态失衡——抑制性递质GABA水平降低，而兴奋性递质Glu含量升高。这一发现为阐明GAD65抗体介导的癫痫发生机制提供了重要实验依据。然而，由于实验设计限制，本研究未设立单独PTZ处理组作为对照，因此尚不能完全排除PTZ本身对GAD65表达的影响。这一科学问题有待后续研究通过设置更完善的对照组来进一步阐明。

本研究结果显示，阳性药苯妥英钠在首次给药后即即表现出显著的抗癫痫作用，表现为小鼠癫痫发作等级明显降低、癫痫发作潜伏期明显延长。这一发现与临床实践相符，苯妥英钠作为一线抗癫痫药物^［12］，尤其适用于控制癫痫持续状态，其作用机制既包括通过稳定脑细胞膜功能，增强脑内抑制性神经递质5-HT及GABA作用，阻止脑区异常放电^［13］，减轻癫痫持续状态；又包括增强中枢抑制性神经递质5-HT和GABA的功能。值得注意的是，神经递质检测结果显示：虽然阳性药组脑组织GABA含量较模型组有所升高，但未达到统计学差异，而兴奋性神经递质Glu含量则明显降低。这一结果提示苯妥英钠的抗癫痫作用机制可能并非直接促进GABA的合成或释放，而是通过增强GABA受体对现有递质的敏感性，抑制谷氨酸能神经突触的兴奋性传递，以及调节突触后膜上兴奋性与抑制性受体的平衡来实现^［14］。

众多临床和基础研究表明，安神类中药在中枢神经系统疾病的治疗中具有独特优势。特别值得注意的是，酸枣仁汤在抗抑郁方面展现出与帕罗西汀相当的疗效，同时具有更好的安全性特征^［15］。在帕金森病相关睡眠障碍的治疗中，酸枣仁汤通过其多组分、多靶点、多途径的作用特点，对多个关键病理环节产生调节作用^［16］。然而，相比于苯妥英钠的快速起效，酸枣仁汤的抗癫痫作用呈现出明显的时效特征。高、中剂量组在连续给药7 d后才显现出治疗效果。这一现象深刻反映了中药复方与化学药物在作用机制上的本质差异。其他中药抗癫痫治疗过程也展现出类似的时效关系。如茯苓多糖抗癫痫药效研究中，研究者给药14 d才发现能够明显减轻小鼠癫痫发作^［17］。在机制研究方面，本研究证实酸枣仁汤能够显著抑制促炎性反应，提高抗炎性反应。更重要的是，本研究首次发现酸枣仁汤可以上调脑颞叶皮层GAD65蛋白表达，进而提高GABA含量并降低Glu水平，这可能是其发挥抗癫痫作用的关键机制之一。以上发现为理解酸枣仁汤的中枢神经系统保护作用提供了新的科学依据。此外，酸枣仁汤虽然起效较慢，但在众多中枢神经系统疾病模型中对CaMK信号通路^［18］、DJ-1/Nrf2信号通路^［19］等都存在一定调节作用，提示酸枣仁汤多靶点调节特点可能更适用于癫痫的长期管理与复发预防。

综上所述，酸枣仁汤对癫痫存在明显治疗作用，其机制极可能与提高GAD65蛋白表达，促进Glu向GABA转化相关，也可能与炎症反应抑制存在一定关系。然而，本研究也存在一定局限性。首先是，酸枣仁汤低剂量组在观察期内未表现出显著疗效，若延长给药时间是否有效尚不明确，需进一步探索其剂量-效应关系。其次，研究仅观察了28 d的治疗效果，未能评估酸枣仁汤的长期疗效及停药后的复发情况，未来可延长实验周期以验证其持续作用。最后，与苯妥英钠相比，酸枣仁汤在急性发作控制方面并无优势，但其是否能在“治未病”方面发挥作用，仍需深入研究。另外，本研究未来仍需探索酸枣仁汤与苯妥英钠的协同作用，以及是否能在快速控制症状的同时减少西药用量及副作用。

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基金资助

新疆维吾尔自治区重点实验室开放课题(XJDX711-2217)