LINC02589通过m6A介导的子宫内膜异位症FTO抑制促进上皮-间充质转化

LINC02589 promotes epithelial-mesenchymal transition via m6A-mediated suppression of FTO in endometriosis

摘要

目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）LINC02589和脂肪质量与肥胖相关蛋白（FTO）在子宫内膜异位症（EMs）中的表达及其与m6A甲基化水平的关系，揭示LINC02589和FTO在EMs病理过程中的潜在作用。 方法 收集10例EMs患者和10例健康对照者的子宫内膜组织样本，通过qRT-PCR检测LINC02589、FTO的表达水平，MeRIP-qPCR检测LINC02589的m6A甲基化水平，Western blot检测FTO及m6A蛋白表达水平。正常子宫内膜基质细胞（ESCs）分为ESCs组和ESCs+17β-雌二醇组（ESCs+17β-E）。ESCs分别进行LINC02589沉默、FTO过表达及17β-雌二醇处理，命名为：Vector+siNC组、Vector+siNC+17β-E组、Vector+siLINC02589+17β-E组、FTO+siNC+17β-E组、FTO+siLINC02589+17β-E组，检测LINC02589、FTO及m6A甲基化水平。此外，通过Western blot检测FTO、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和β-catenin的蛋白表达，Transwell及CCK-8实验检测细胞迁移、侵袭及增殖情况。 结果 与健康对照相比，EMs患者组织中LINC02589表达显著升高（P<0.001），FTO表达显著降低（P<0.001），且m6A甲基化水平升高（P<0.001），LINC02589与FTO表达呈负相关（r=-0.835 9，P<0.001）。在细胞实验中，ESCs+17β-E组较ESCs组LINC02589表达和m6A甲基化水平升高（P<0.001），FTO表达降低（P<0.001）；与Vector+siNC+17β-E组相比，Vector+siLINC02589+17β-E组和FTO+siNC+17β-E组m6A甲基化水平显著降低（P<0.001）；此外，FTO+siNC+17β-E组较Vector+siNC+17β-E组E-cadherin表达升高（P<0.001），N-cadherin、Vimentin和β-catenin表达降低（P<0.001），而FTO+siLINC02589+17β-E组这一效应被逆转（P<0.001）。功能实验表明，FTO+siNC+17β-E组细胞迁移、侵袭和增殖能力较Vector+siNC+17β-E组显著减弱（P<0.01），而FTO+siLINC02589+17β-E组这些指标可部分恢复（P<0.001）。 结论 LINC02589通过负调控FTO表达促进m6A甲基化，从而介导雌激素诱导的EMs发生发展。

Abstract

Objective To investigate the expression of long non-coding RNA（lncRNA） LINC02589 and fat mass and obesity-associated protein（FTO） in endometriosis（EMs）， and their relationship with m6A methylation levels， and explore the potential roles of LINC02589 and FTO in the pathological process of EMs. Methods Endometrial tissue samples were collected from 10 EMs patients and 10 healthy controls. The expression levels of LINC02589 and FTO were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR）. The m6A methylation level of LINC02589 was assessed using methylated RNA immunoprecipitation followed by qPCR（MeRIP-qPCR）. Protein levels of FTO and m6A were measured by Western blot. Normal endometrial stromal cells（ESCs） were divided into ESCs group and ESCs+17β-estradiol group（ESCs+17β-E）. ESCs were divided into Vector+siNC group， Vector+siNC+17β-E group， Vector+siLINC02589+17β-E group， FTO+siNC+17β-E group， and FTO+siLINC02589+17β-E group， and LINC02589 and FTO expression， and m6A methylation levels were detected. Additionally， Western blot was performed to detect FTO， E-cadherin， N-cadherin， and Vimentin protein expressions. Cell migration， invasion， and proliferation were assessed using Transwell and CCK-8 assays. Results Compared to healthy controls， EMs tissues exhibited increased LINC02589 expression（P<0.001）， decreased FTO expression（P<0.001）， and elevated m6A methylation levels（P<0.001）. LINC02589 expression was negatively correlated with FTO expression（r=-0.835 9， P<0.001）. Compared to ESCs group， LINC02589 expression and m6A methylation increased in ESCs+17β-E group（P<0.001）， and FTO expression decreased（P<0.001）. Compared to Vector+siNC+17β-E group， m6A methylation levels significantly reduced in Vector+siLINC02589+17β-E group and FTO+siNC+17β-E group（P<0.001）. Compared with Vector+siNC+17β-E group， E-cadherin expression increased in FTO+siNC+17β-E group and N-cadherin， Vimentin and β-catenin expressions decreased（P<0.001）， and the effects were reversed in FTO+siLINC02589+17β-E group（P<0.001）. Functional assays revealed that cell migration， invasion， and proliferation were significantly attenuated in FTO+siNC+17β-E group compared with Vector+siNC+17β-E group（P<0.01）. However， the cellular capabilities were partially restored in FTO+siLINC02589+17β-E group（P<0.001）. Conclusion LINC02589 promotes m6A methylation by negatively regulating FTO expression， thereby mediating estrogen-induced pathogenesis and progression of endometriosis.

Graphical abstract

关键词

子宫内膜异位症 / LINC02589 / 脂肪质量和肥胖相关蛋白 / m6A甲基化 / 雌激素 / 上皮-间质转化

Key words

endometriosis / LINC02589 / fat mass and obesity-associated protein / m6A methylation / estrogen / epithelial-mesenchymal transition

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种雌激素依赖的复杂慢性炎症疾病，其特征是子宫内膜组织在子宫腔外的异常生长，主要影响盆腔组织，包括卵巢^［1，2］。EMs的发病率较高，全球约有10%的育龄妇女受其影响^［3，4］。目前研究认为遗传和表观遗传因素在其发病机制中扮演重要角色，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等^［5，6］。目前的治疗方式主要包括抑制排卵和雌激素生成、使用环氧合酶抑制剂以及手术切除病灶，但这些方法仍存在诸多局限，如激素治疗的副作用和手术的高复发率^［1，4］。因此，需要对EMs病理生理学进行深入研究以及开发新型靶向治疗手段，提高治疗效果。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是存在于真核生物mRNA中的一种表观修饰，可以通过影响mRNA的稳定性、转录、剪接、翻译和降解，参与多种生物学过程和疾病的调控^［7-9］。脂肪质量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）是m6A去甲基化酶，能够通过去除mRNA上的m6A修饰调控基因表达^{［10，11］}。研究发现，FTO在EMs患者中下调，影响了糖酵解、增殖和异位内膜间质细胞（ESCs）的转移^［10］。lncRNA是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的RNA分子，近年来被发现具有调控基因表达、参与表观遗传修饰等多种功能^［12］。研究表明，m6A修饰在EMs中显著下调，并且主要富集在AAACU基序上，功能富集分析显示，黏附和发育调控通路在m6A甲基化的lncRNAs中显著富集^［13］。LINC02589是一种长链非编码RNA（lncRNA），通过文献检索发现，目前尚未有关于LINC02589在EMs中的研究报道，其是否通过调控m6A修饰参与疾病的发生仍不明确，需进一步深入探讨。本研究通过探讨FTO的低表达与LINC02589在EMs中的异常m6A去甲基化之间的关联，并观察雌激素对子宫内膜基质细胞中FTO和LINC02589表达及m6A修饰的影响，从而深化对EMs发病机制的理解，为开发新的潜在治疗策略提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

电凝刀购自美国Covidien公司，无菌刮匙购自美国MedGyn公司，超微量紫外分析仪购自美国Quawell Technology公司，-80 ℃超低温保存箱购自中国海尔集团公司，CO₂细胞培养箱购自德国Memmert公司，酶联免疫监测仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

无RNA酶处理的PBS、胎牛血清、青链霉素购自美国Gibco公司，DMEM-高糖培养基购自美国Hyclone公司，胰酶购自美国Genview公司，17β-雌二醇购自美国MedChemExpress公司和美国Sigma-Aldrich公司，Trizol购自日本TaKaRa公司，RNA免疫共沉淀裂解液购自美国Millipore公司，anti-FTO、anti-E-cadherin、anti-N-cadherin、anti-Vimentin、anti-β- catenin、anti-β-actin、HRP Goat anti-Rabbit IgG购自英国Abcam公司，ECL显影液购自美国Thermo Fisher公司，Matrigel基质胶购自美国Corning公司，结晶紫购自中国Solarbio Life Science公司，4%多聚甲醛购自美国Sigma-Aldrich公司，Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2 样本收集与处理

研究对象为2023年1月至2024年4月广西医科大学第二附属医院确诊为EMs的患者（EMs组，n=10）和健康志愿者（Ctrl组，n=10）。EMs患者符合EMs的临床诊断标准^［4］，并通过腹腔镜或病理确诊，年龄在18~45岁，具有生育能力的女性，病变部位为卵巢子宫内膜异位病灶。健康对照为不孕症检查为正常的健康女性，年龄在18~45岁，具有生育能力；所有志愿者自愿参与研究并签署知情同意书。排除标准：有卵巢或子宫相关手术史；存在其他生殖系统疾病或严重全身性疾病；当前妊娠或近期有妊娠计划和近期服用影响内膜状态的药物（如激素类药物）的女性。该实验已获得广西医科大学第二附属医院医学伦理委员会的批准［伦审2022第（KY-0378）号］。

收集EMs患者腹腔镜手术中切除卵巢异位子宫内膜组织，以及健康志愿者行刮宫术获取的正常在位子宫内膜组织。所有样本均在术后立即放入无RNA酶处理的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的无菌离心管中，并用无RNA酶处理的PBS轻轻冲洗2~3次，以去除多余的血液和杂质^［14］。在无菌操作台上，将组织样本切割成约0.5 cm³的小块，确保后续实验的均一性。处理好的样本迅速置于液氮中进行快速冷冻，随后转移至-80 ℃冰箱中长期保存。

1.3 细胞培养

正常子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells，ESCs）分为ESCs组和ESCs+17β-雌二醇组（ESCs+17β-E）。ESCs首先在37 ℃水浴中迅速解冻，然后在超净工作台上进行无菌操作。使用胎牛血清和DMEM-高糖培养基复苏细胞，并利用胰酶进行细胞分离。细胞传代后，以1∶3的比例在含有青链霉素的新鲜培养基中继续培养，放置在CO₂细胞培养箱，条件为37 ℃、5% CO₂。为模拟EMs条件下的异位内膜基质细胞，ESCs在传代后用17β-E（10 nmol/L）处理24 h^［14］。

1.4 载体构建与转染

ESCs细胞随机分为5组：对照组（Vector+siNC）、雌激素处理组（Vector+siNC+17β-E）、LINC02589干扰组（Vector+siLINC02589+17β-E）、FTO过表达组（FTO+siNC+17β-E）、及FTO过表达+LINC02589干扰组（FTO+siLINC02589+17β-E）。

各组分别转染相应的质粒或siRNA。对照组同时转染FTO过表达对照空载体Vector及LINC02589干扰对照siNC，FTO过表达组转染pcDNA3.1-FTO载体，LINC02589干扰组转染LINC02589 siRNA，FTO过表达+LINC02589干扰组同时转染pcDNA3.1-FTO载体及LINC02589 siRNA，FTO过表达+ LINC02589过表达组同时转染pcDNA3.1-FTO和pcDNA3.1-LINC02589载体。其中空载体Vector、pcDNA3.1-FTO和pcDNA3.1-LINC02589过表达载体由GeneChem提供，LINC02589 siRNA、siNC由GenePharma公司合成。细胞转染操作：细胞于6孔板中接种并培养至70%~80%汇合度，使用Lipofectamine 3000转染试剂进行转染。过表达实验组每孔转染2 500 ng质粒，干扰实验组每孔转染100 nmol/L siRNA。转染复合物由核酸（质粒或siRNA）、5 µL Lipofectamine 3000及Opti-MEM混合配制，室温孵育15 min后加入至细胞中。转染6 h后更换为含10% FBS和1%青链霉素的DMEM/F12培养基，继续培养48 h。处理组在更换培养基时补加终浓度为10 nmol/L的17β-E，处理24 h后收集细胞用于后续实验。

1.5 qRT-PCR检测LINC02589、FTO的表达水平

在子宫内膜组织样本和ESCs细胞中检测LINC02589和FTO的表达水平。将子宫内膜组织样本在液氮中研磨后，使用1 mL Trizol提取RNA，并经氯仿分离、异丙醇沉淀和75% DEPC酒精洗涤后，用DEPC处理过的ddH₂O溶解并通过超微量紫外分析仪测定RNA浓度。对于细胞样本，同样使用1 mL Trizol提取RNA，并采用相同的方法进行RNA纯化。逆转录使用2 μg RNA，应用Bestar qPCR RT Kit合成cDNA第一链。qRT-PCR扩增使用Bestar® SybrGreen qPCR MasterMix，在Stratagene Real time PCR仪上进行。扩增参数如下：初始变性在95 ℃持续30 s；随后95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，进行40个循环。使用GAPDH作为内参基因。相对表达量采用2^-ΔΔCt 方法计算，以保证实验数据的可靠性和可比性。引物序列见表1。

1.6 MeRIP-qPCR检测LINC02589的m6A甲基化水平

将ESCs细胞和子宫内膜组织样本使用冷PBS清洗并收集至EP管中。对于细胞样本，直接用RNA免疫共沉淀裂解液裂解；对于子宫内膜组织样本，需先使用液氮研磨或组织匀浆器匀浆，然后加入RNA免疫共沉淀裂解液彻底裂解组织。在4 ℃条件下以1 500 r/min离心5 min，去除上清后再用等体积的RNA免疫共沉淀裂解液重悬，最后分装并储存在-80 ℃超低温保存箱。在实验中，同时设置IgG抗体作为阴性对照，在Eppendorf管中加入Dynabeads^TM Protein A/G磁珠，用涡旋震荡器混匀磁珠悬液，然后与m6A特异性抗体或IgG抗体孵育30 min，使用RIP Wash Buffer进行多次清洗后，加入RIP Immunoprecipitation Buffer并与裂解液孵育形成磁珠-抗体-RNA复合物。将该复合物在4 ℃下孵育过夜，再通过苯酚∶氯仿∶异戊醇（体积比25∶24∶1）提取RNA，用Proteinase K Buffer处理以去除蛋白，提取的RNA用DEPC处理过的水重悬，使用NanoDrop 2000超微量紫外分析仪检测RNA浓度和纯度，储存在-80 ℃以备进行qRT-PCR分析。使用Bestar® SybrGreen qPCR MasterMix，在Stratagene Real-time PCR仪上进行荧光定量PCR检测m6A修饰LINC02589 RNA的富集水平。实验以GAPDH作为内参，采用2^-ΔΔCt法计算LINC02589在m6A抗体组相对输入样本（input）的比值，实验独立重复3次。

1.7 Western blot检测FTO及上皮-间质转化标志相关蛋白表达水平

用PBS清洗子宫内膜组织样本和ESCs细胞，并用RIPA裂解液从组织和细胞中提取总蛋白。通过BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量，利用预制的标准曲线确定样品蛋白浓度。在SDS-PAGE垂直电泳槽中进行电泳。蛋白转移至PVDF膜，随后使用5%脱脂奶粉-TBS封闭PVDF膜，并使用抗体anti-FTO（稀释度1∶1 000）、anti-E-cadherin（1∶2 000）、anti-N-cadherin（1∶1 000）、anti-Vimentin（1∶1 000）、anti-β-catenin（1∶2 000）和anti-β-actin（1∶5 000）进行一抗4 ℃孵育过夜。次日，加入HRP Goat anti-Rabbit IgG（1∶5 000）作为二抗室温孵育1 h。使用ECL显影液显影。最后，使用MICROTEK Bio-5000扫描仪获取图像，并使用ImageJ软件分析凝胶图像数据，以评估蛋白表达水平的变化。

1.8 m6A RNA甲基化定量检测试剂盒检测m6A RNA甲基化水平

用TRIzol试剂提取ESCs组和ESCs+17β-E组细胞总RNA，并使用分光光度计测定RNA浓度及纯度，确保A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8~2.0之间。将200 ng总RNA加入96孔酶标板的各自对应孔中，并加入80 µL结合液，轻柔混匀后，在37 ℃孵育90 min，使RNA充分结合到孔板上。随后，移除未结合的RNA，并用1×洗涤缓冲液洗涤孔3次。接着，加入50 µL稀释的捕获抗体，室温孵育60 min后清洗3次，再加入50 µL稀释的检测抗体，室温孵育30 min后洗涤4次，随后加入50 µL稀释的增强液，室温孵育30 min后洗涤5次。信号检测前，加入50 µL荧光显色液，避光孵育3 min，在激发光530 nm和发射光590 nm波长处使用荧光分光光度计读取荧光信号。m6A甲基化水平通过标准曲线进行定量，并根据荧光信号计算各样本的m6A相对甲基化水平。

1.9 Transwell检测细胞的迁移能力变化

细胞在6孔板中培养至约80%融合度后，使用PBS清洗两次，经胰酶处理后，以无血清培养基重悬细胞。调整细胞浓度至2×10⁵/mL，将100 μL细胞悬液（含2×10⁴细胞）加入Transwell上室，下室添加700 μL含10% FBS的完全培养基，于37 ℃，5% CO₂，100%湿度的条件下培养24 h。实验结束后，使用棉签移除上室非迁移细胞，固定于4%多聚甲醛20 min，后用PBS清洗，再用结晶紫染色10 min，洗净后晾干，并在5个随机视野下计数，以评估细胞迁移情况。

1.10 Transwell检测细胞侵袭能力变化

将Matrigel基质胶从-20 ℃迁移至4 ℃冰箱中过夜融化，与预冷无血清培养基按1∶15的比例混合，将混合后的凝胶液铺设于Transwell小室的上室，在37 ℃下静置2 h形成膜。接种前，细胞在无血清培养基中饥饿处理12 h后，使用胰蛋白酶处理并调整密度至2×10⁵ cells/mL，向上室加入100 μL细胞悬液（含2×10⁴细胞），下室则加入700 μL含10% FBS的完全培养基。培养24 h后（37 ℃，5% CO₂，100%湿度），使用棉签移除上室非侵袭细胞，并用PBS清洗3次后，固定于4%多聚甲醛20 min。随后，使用结晶紫对固定的细胞进行染色5~10 min，冲洗后晾干并用中性树脂封片。封片后进行全景扫描，选择5个随机视野进行细胞计数以评估细胞的侵袭能力。

1.11 CCK-8检测细胞活性

从已培养好的细胞中收集分组处理后的样本，将1×10⁴细胞接种至每孔含有100 μL完全培养基的96孔板中。按每1 mL完全培养基加入100 μL的Cell Counting Kit-8溶液的比例混合均匀，并向每孔中加入100 μL的CCK-8溶液。将培养板置于H₂O₂细胞培养箱内孵育1 h。孵育结束后，将96孔板中的培养基小心转移至酶标板中。最后，使用酶联免疫监测仪在450 nm处测定OD值，以评估细胞活性。

1.12 统计学分析

使用Prism 9.0软件对所有实验数据进行统计分析。数据以均值±标准差（X±S）表示。首先对数据进行正态性检验和方差齐性检验，确保数据满足单因素方差分析（ANOVA）的前提条件。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），并使用Tukey's多重比较检验评估组间差异。相关性分析采用Pearson相关性分析方法进行。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC02589与FTO在EMs中呈负相关，且m6A甲基化水平上调

两组样本的年龄和BMI无显著差异，具有可比性（见表2）。qRT-PCR检测结果显示，与健康对照相比，EMs患者LINC02589的表达显著升高（P<0.001），而FTO的表达显著降低（P<0.001，见图1）。MeRIP-qPCR检测结果显示，与健康对照相比，EMs患者m6A甲基化水平显著升高（P<0.001，见图1）。LINC02589和FTO的表达水平呈显著负相关（r=-0.835 9，P<0.001）。Western blot分析结果显示，与Ctrl组相比，EMs组中FTO的蛋白表达水平显著降低（P<0.001，见图1）。

2.2 雌激素通过上调LINC02589表达抑制FTO，从而促进m6A甲基化水平升高

qRT-PCR检测结果显示，与ESCs组相比，ESCs+17β-E组LINC02589的表达显著升高（P<0.001），而FTO的表达显著降低（P<0.001，见图2）。MeRIP-qPCR检测结果表明，与ESCs组相比，ESCs+17β-E组LINC02589的m6A甲基化水平显著升高（P<0.001，见图2）。Western blot结果显示，与ESCs组相比，ESCs+17β-E组FTO的蛋白表达水平显著降低（P<0.001，见图2）。此外，m6A RNA甲基化水平检测结果显示，与ESCs组相比，ESCs+17β-E组m6A RNA甲基化水平显著升高（P<0.001，见图2）。

2.3 LINC02589通过调控FTO表达影响m6A甲基化水平

qRT-PCR结果显示，与Vector+siNC组相比，Vector+siNC+17β-E组LINC02589的表达显著增加（P<0.001），FTO的表达显著降低（P<0.001）；与Vector+siNC+17β-E组比较，Vector+siLINC02589+17β-E组和FTO+siNC+17β-E组LINC02589的表达显著降低（P<0.001），FTO+siNC+17β-E组中FTO的表达显著升高（P<0.001）；与FTO+siNC+17β-E组相比，FTO+siLINC02589+17β-E组LINC02589的表达显著升高（P<0.001，见图3）。MeRIP-qPCR检测结果显示，相比Vector+siNC组，Vector+siNC+17β-E组m6A甲基化水平显著上升（P<0.05）；相比Vector+siNC+17β-E组，Vector+siLINC02589+17β-E组和FTO+siNC+17β-E组m6A甲基化水平显著降低（P<0.001）；与FTO+siNC+17β-E组相比，FTO+siLINC02589+17β-E组m6A甲基化水平显著上升（P<0.001，见 图3）。

2.4 LINC02589通过调控FTO影响上皮-间质转化相关蛋白的表达

Western blot 结果显示，与Vector+siNC组相比，Vector+siNC+17β-E组FTO的表达显著降低（P<0.001）；与Vector+siNC+17β-E组相比，FTO+siNC+17β-E组FTO表达水平显著升高（P<0.001，见图4）。与Vector+siNC组相比，Vector+siNC+17β-E组E-cadherin的表达显著降低（P<0.001），N-cadherin、Vimentin和β-catenin的表达水平显著升高（P<0.001）；与Vector+siNC+17β-E组相比，Vector+siLINC02589+ 17β-E组和FTO+siNC+17β-E组E-cadherin的表达显著升高（P<0.001），N-cadherin、Vimentin和β-catenin的表达水平显著降低（P<0.001）；与FTO+siNC+17β- E组相比，FTO+siLINC02589+17β-E组E-cadherin的表达显著降低（P<0.001），N-cadherin、Vimentin和β- catenin的表达水平显著升高（P<0.001，见图4）。

2.5 LINC02589通过调控FTO影响细胞迁移、侵袭及增殖能力

Transwell及CCK-8结果显示，与Vector+siNC组相比，Vector+siNC+17β-E组细胞的迁移、侵袭和增殖能力显著增强（P<0.001）；与Vector+siNC+17β-E组相比，FTO+siNC+17β-E组和FTO+siNC+17β-E组细胞的迁移、侵袭和增殖能力显著降低（P<0.01）；与FTO+siNC+17β-E组相比，FTO+siLINC02589+17β-E组细胞的迁移、侵袭和增殖能力显著增强（P<0.001，见图5）。

3 讨论

EMs是一种常见的妇科疾病，其特征是子宫内膜组织出现在子宫腔外，引起疼痛、不孕等症状^［15］。尽管其病因尚未完全明确，但已有研究表明，遗传、免疫和激素因素均在其发病过程中发挥作用^［16］。已有研究表明，FTO在EMs患者中的表达水平较低，可能导致m6A修饰增加，从而影响基因表达和细胞功能^［7，17］。此外，lncRNA也被发现通过与m6A修饰相互作用，在EMs的发生和发展中起到重要作用^［8］。然而，目前关于FTO、m6A和lncRNA在EMs中的具体机制研究仍不充分，需要进一步的深入探讨。

研究发现，lncRNA H19在卵巢癌中的高表达与患者的不良预后相关^［18］。lncRNA HOTAIR被发现通过促进m6A修饰增强细胞的迁移和侵袭能力^［19］。此外，研究表明，m6A修饰在EMs中具有调控作用，且FTO的表达水平与m6A修饰密切相关^［20］。这些研究表明lncRNA在EMs中可能通过调控m6A修饰影响疾病进程。在本研究中，qRT-PCR结果显示，LINC02589在EMs样本中的表达显著高于正常组织，而FTO的表达显著低于正常组织；MeRIP-qPCR结果进一步证实，EMs样本中m6A甲基化水平显著高于正常组织，LINC02589与FTO呈负相关，提示LINC02589可能通过抑制FTO的表达从而增加m6A修饰水平，促进EMs的发生和发展。雌激素在EMs中不仅促进内膜样组织的生长，还通过多种途径调控基因表达和修饰^［21］。有研究指出，m6A修饰在雌激素介导的基因表达调控中也发挥重要作用^［22］。本研究显示，相对于ESCs组，ESCs+17β-E组LINC02589的表达显著提高，FTO的表达降低，并m6A甲基化水平增加。结果提示，雌激素可能通过上调LINC02589表达与抑制FTO表达相关联，进而促进m6A甲基化水平升高。

为了进一步探讨LINC02589和FTO在子宫内膜细胞功能中的具体作用，本研究进行了基因干扰和过表达实验。研究显示，FTO通过调控m6A修饰影响癌细胞的迁移和侵袭能力^{［23，24］}。本研究结果显示，相较于Vector+siNC+17β-E组，Vector+siLINC02589+17β-E组和FTO+siNC+17β-E的m6A甲基化水平显著降低，提示沉默LINC02589和过表达FTO可逆转17β-E2的作用。而与FTO+siNC+17β-E组相比，FTO+LINC02589+17β-E组的m6A甲基化水平显著上升，结果提示LINC02589可能通过与FTO的相互作用，促进了LINC02589的m6A甲基化修饰，LINC02589的过表达可能增强了FTO在m6A修饰过程中的作用，导致m6A甲基化水平的提高。lncRNA HOTAIR被发现通过促进m6A修饰增强细胞的迁移和侵袭能力^［19］。E-cadherin的降低和N-cadherin、Vimentin的增加是上皮-间质转化（EMT）的典型标志^{［25，26］}。本研究进一步发现，与Vector+siNC组相比，Vector+siNC+17β-E组中E-cadherin的表达显著下降，而N-cadherin、Vimentin和β-catenin的表达显著上升，这些变化提示细胞发生了EMT，说明17β-E可促进EMT。与Vector+siNC+17β-E组相比，FTO+siNC+17β-E组EMT被抑制，FTO的过表达逆转17β-E诱导的EMT，而与FTO+siNC+17β-E组相比，FTO+siLINC02589+17β-E组EMT增强，提示LINC02589可能通过改变FTO的表达，导致EMT增强。此外，与Vector+siNC+17β-E组相比，FTO+siNC+17β-E组的迁移、侵袭和增殖能力显著降低，说明FTO抑制肿瘤转移，而沉默LINC02589后，细胞的迁移、侵袭和增殖能力显著增强，提示LINC02589可能通过调控FTO的表达，进而促进细胞的迁移和增殖能力。

尽管本研究揭示了LINC02589和FTO在EMs中的重要作用，但仍存在一些局限性。首先，本研究主要依赖于体外细胞模型和组织样本的分析，缺乏对整个生物体生理状态的全面评估，尚需进一步在动物模型和更多的临床样本中验证其结果的可靠性。其次，LINC02589和FTO在EMs中的具体分子机制及其下游信号通路仍需进一步研究。此外，尽管本研究探讨了雌激素对LINC02589和FTO表达及m6A修饰的影响，但雌激素受体在这一过程中的具体作用仍需进一步研究。

总之，本研究通过系统地分析LINC02589和FTO在EMs中的表达及其相互关系，揭示了它们在EMs发生发展中的重要作用。本研究结果表明，LINC02589的上调和FTO的下调与EMs中的m6A甲基化水平变化密切相关，雌激素通过调控LINC02589和FTO的表达及其m6A修饰途径，诱导子宫内膜细胞的上皮-间质转化，使子宫内膜细胞活性、迁移和侵袭能力显著增强。这些发现为EMs的机制研究提供了新的视角，并为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。未来将进一步深入探讨LINC02589和FTO的具体分子机制及其在EMs中的作用，为临床治疗提供更加科学的依据。

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基金资助

广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题(Z-A20220651)