铜离子干预对瘢痕疙瘩成纤维细胞TGF-β1表达及创口愈合的影响

Effect of copper ion intervention on TGF⁃β1 expression and wound healing in keloid fibroblasts

摘要

目的 探讨铜离子（Cu²⁺）干预对人瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）中转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响及其在创口愈合中的作用。 方法 体外培养KFs，使用不同浓度的CuCl₂干预细胞48 h，设为对照组、低浓度组（10 μmol/L）、中浓度组（20 μmol/L）及高浓度组（40 μmol/L），对照组不使用CuCl₂干预。采用ELISA检测TGF-β1表达，CCK-8检测细胞增殖，细胞划痕实验检测细胞迁移和创口愈合情况，流式细胞术检测细胞周期，Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力。 结果 与对照组相比，低浓度组TGF-β1表达、细胞存活率无显著变化（P>0.05）；中浓度组和高浓度组TGF-β1表达、细胞存活率呈浓度依赖性降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，中浓度组和高浓度组创口愈合率、细胞迁移及侵袭能力明显降低（P<0.05），且高浓度组上述指标变化更显著（P<0.05）；中浓度组、高浓度组G0/G1期细胞阻滞率明显上升（P<0.05），S期和G2/M期细胞阻滞率下降（P<0.05）。 结论 Cu²⁺在适度浓度（20~40 μmol/L）可降低KFs细胞TGF-β1表达，抑制细胞增殖、迁移与侵袭能力，减缓创口愈合，其机制可能与细胞周期阻滞有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of copper ion（Cu²⁺） intervention on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） in human keloid fibroblasts（KFs） and its role in wound healing. Methods KFs were cultured in vitro and intervented with different concentrations of CuCl₂ for 48 h. KFs were divided into control group（0 μmol/L）， low concentration（10 μmol/L） group， medium concentration（20 μmol/L） group， and high concentration（40 μmol/L） group. TGF-β1 expression was measured by ELISA， cell proliferation was assessed using CCK-8 assay， cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry， cell migration and scratch wound healing were evaluated by scratch assay， and cell invasion was examined using Transwell assay. Results Compared with control group， TGF-β1 expression and cell survival rate showed no significant changes in low concentration group（P>0.05）， and TGF-β1 expression and cell survival rate concentration-dependently decreased in medium and high concentration groups（P<0.05）. Compared with control group， the wound healing rate and the cell migration and invasion abilities were significantly reduced in medium concentration group and high concentration group（P<0.05）， and the changes of the above indicators were more significant in high concentration group（P<0.05）. Compared with control group， the G0/G1 phase cell arrest rate significantly increased in medium and high concentration groups（P<0.05）， while the S and G2/M phase cell arrest rates decreased（P<0.05）. Conclusion Cu²⁺ at moderate concentrations（20-40 μmol/L） can reduce the TGF-β1 expression in KFs cells， inhibit cell proliferation， migration， and invasion， thereby slowing wound healing， which may be associated with cell cycle arrest.

Graphical abstract

关键词

铜离子 / 瘢痕疙瘩成纤维细胞 / 转化生长因子-β1 / 创口愈合 / 细胞周期 / 细胞划痕实验

Key words

copper ion / keloid fibroblasts / TGF-β1 / wound healing / cell cycle / scratch test

瘢痕疙瘩是皮肤创伤修复过程中纤维组织过度增生形成的良性病变，其发病机制复杂，涉及多种细胞因子和生长因子的相互作用^［1］。目前，瘢痕疙瘩的临床防治仍是研究热点。研究表明，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在瘢痕疙瘩形成中起关键作用^［2］。瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KFs）具有类似肿瘤样的特性，虽形态与正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs）相似，但具有较强的增殖和侵袭能力，能够不断分裂和生长，导致瘢痕组织过度增大^［3］。

铜离子（Cu²⁺）是重要的微量元素，具有广泛的生物学效应，参与细胞增殖、分化及创口愈合等过程。Cu²⁺代谢紊乱可能影响细胞内的氧化还原平衡，进而调控KFs的生物学行为，而KFs异常的生理过程也可能改变细胞内Cu²⁺的分布和含量^［4］。为此，本研究探讨Cu²⁺干预对人KFs细胞中TGF-β1表达及创口愈合的影响，为临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞

人KFs来源于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，细胞培养使用KFs专用培养基（含原代成纤维细胞培养添加剂、10% FBS、1% P/S），37 ℃，5% CO₂，饱和湿度。

1.1.2 实验试剂与耗材

KFs专用培养基（iCell-0131a-001b）购自赛百慷生物技术股份有限公司，胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）（25200-056）购自美国GIBCO公司，PBS磷酸盐缓冲液粉剂（ZLI-9062）购自北京中杉金桥生物公司，CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒（FC101-03）购自北京全式金生物技术股份有限公司，DMSO（D2650）购自日本SIGMA公司、氯化铜（CuCl₂）（C805298）购自上海麦克林生化科技股份有限公司，Human/Mouse TGF-β1 ELISA Kit检测试剂盒（EK981）购自杭州联科生物技术股份有限公司，结晶紫染色液（G1062）购自北京索莱宝科技有限公司，基质胶（356234）、Transwell小室（3422）、96孔板（3596）、25 cm²培养瓶（430639）均购自美国Corning，PI/RNase Staining Buffer（550825）购自美国BD公司，15 mL离心管（CS015-0001）购自苏州依科赛生物科技股份有限公司。

1.1.3 实验仪器

CO₂细胞培养箱（Smart Cell HF-90）、生物安全柜（HF1200LC）购自上海力康仪器有限公司，台式低速离心机（DK-80）购自上海飞鸽仪器有限公司，恒温水浴锅（GL-16GB）购自上海精宏仪器厂，-20 ℃低温冰箱（BCD-249LCK）、-80 ℃低温冰箱（DW-HL388）购自合肥美菱股份有限公司，手动单道移液器（Research plus）购自德国Eppendorf公司，液氮罐（YDS-50-125）购自成都金凤仪器厂，荧光倒置显微镜（Eclipse TS100-F）购自日本尼康公司，酶标仪（xMarkTM）购自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪（BF-700）购自桂林优利特医疗电子有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

1.2.1.1 细胞复苏

从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37 ℃水浴中快速晃动冻存管，2 min内使细胞快速解冻，提前在15 mL离心管中加入9 mL完全培养基，将解冻后的细胞快速加入离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量新鲜培养基轻轻重悬细胞，将细胞接种至培养瓶中，放入37 ℃、饱和湿度、5% CO₂细胞培养箱中培养。

1.2.1.2 细胞传代

取出细胞，弃去培养瓶中的培养基，加入3 mL无菌PBS缓冲液反复冲洗，弃去PBS缓冲液，每瓶中加入1 mL的胰酶，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，并放于37 ℃培养箱中消化，每30 s观察细胞消化情况，待细胞脱落，加入1 mL的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底，将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，小心吸去离心管中的液体，并用2 mL的完全培养基重悬沉淀的细胞，显微镜下观察细胞，调整合适的细胞密度接种至培养瓶中，放入37 ℃、饱和湿度、5% CO₂细胞培养箱中继续培养。

1.2.1.3 细胞冻存

配制冻存液，基础培养基550 μL+FBS 400 μL+DMSO 50 μL。消化收集对数期细胞（融合度≥90%），分装至标记冻存管（1 mL/管）中，经4 ℃ 20 min→-20 ℃ 30 min→-80 ℃（过夜）梯度降温后，转移至液氮中保存。

1.2.2 CuCl₂干预浓度筛选

1.2.2.1 ELISA检测KFs细胞上清液中TGF-β1含量

取KFs，用完全培养基制备成5×10⁴细胞/mL的单细胞悬液，接种至24孔板中（500 μL/孔）。使用浓度为10，20，40 μmol/L的CuCl₂干预细胞，设为低浓度组、中浓度组及高浓度组。设置对照组，加入新鲜培养液。干预48 h，每组重复3次。干预后，收集上清液，加入裂解液后立即根据ELISA试剂盒说明书检测TGF-β1含量，加入终止液后30 min内使用酶标仪检测双波长，测定450 nm最大吸收波长和570 nm参考波长下的OD值。校准后OD值为450 nm的测定值减去570 nm的测定值。

1.2.2.2 CCK-8检测KFs细胞增殖情况

取KFs，用完全培养基制备成5×10⁴细胞/mL的单细胞悬液，接种至96孔板中（100 μL/孔）。使用浓度为10，20，40 μmol/L的CuCl₂干预细胞，设为低浓度组、中浓度组及高浓度组。设置对照组，加入新鲜培养液。干预48 h，每组重复3次。干预后，每孔加CCK-8试剂10 μL，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm处的OD值。根据CCK-8实验结果筛选出适宜浓度进行后续实验。

1.2.3 细胞划痕实验检测KFs细胞迁移和创口愈合能力

取KFs，用完全培养基制备成5×10⁵细胞/mL的单细胞悬液，接种至24孔板中（500 μL/孔）。待细胞生长汇合至100%时，用无菌枪头轻轻划出笔直的划痕区域，PBS清洗去除脱落细胞。根据CCK-8实验结果，使用浓度为20，40 μmol/L的CuCl₂干预细胞，设为中浓度组及高浓度组。设置对照组，加入无血清培养液，干预48 h。分别于0，24，48 h在相同位置拍照记录划痕区域，采用ImageJ软件分析划痕面积，观察细胞迁移和创口愈合情况。①细胞迁移率（%）=（初始划痕宽度-t时刻划痕宽度）/初始划痕宽度×100%；②创口愈合率（%）=（初始划痕面积-t时刻划痕面积）/初始划痕面积×100%。

1.2.4 流式细胞术检测KFs细胞周期分布

取KFs，用完全培养基制备成5×10⁵细胞/mL的单细胞悬液，接种至6孔板中（2 mL/孔）。待细胞贴壁后，使用浓度为20，40 μmol/L的CuCl₂干预细胞，设为中浓度组及高浓度组。设置对照组，加入新鲜培养液，干预48 h。干预后，收集细胞至15 mL离心管中，预冷PBS洗涤2次，4 ℃、80%乙醇固定过夜（≥12 h）。固定后PBS洗涤，加入PI/RNase染色液（500 μL/管），避光孵育30 min（37 ℃）。上机前经200目尼龙网过滤，以减少细胞团块干扰。采用流式细胞仪（激发波长488 nm，FL2通道检测红色荧光）检测细胞周期，使用软件分析G0/G1期、S期、G2/M期细胞分布情况。

1.2.5 Transwell实验检测KFs细胞侵袭能力

4 ℃过夜融化Matrigel基质胶，用无血清培养基将基质胶稀释至1 mg/mL；在chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀释后的基质胶，37 ℃温育5 h使其成胶。使用浓度为20，40 μmol/L的CuCl₂干预细胞，设为中浓度组及高浓度组。设置对照组，加入培养液，干预48 h。用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞悬液至2×10⁵细胞/mL；在下室（24孔板底部）加入600 μL完全培养基，上室加入100 μL细胞悬液，每组3个重复孔，继续在培养箱中培养72 h；用镊子小心取出小室，PBS洗2次，4%甲醛室温固定20 min；取出小室，PBS洗2次，移至预先加入600 μL的0.1%结晶紫染液中，染色5 min；取出小室，PBS洗2次，用湿棉棒小心擦去上室表面的细胞，底面朝上晾干；移至载玻片上，显微镜下观察并计数穿膜侵袭细胞数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计量数据采用均值±标准差（X±S）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。GraphPad Prism 5.0辅助作图。

2 结果

2.1 CuCl₂对KFs细胞上清液中TGF-β1表达的影响

与对照组相比，低浓度组TGF-β1表达无显著变化（P>0.05）；中浓度组、高浓度组TGF-β1表达呈浓度依赖性降低，差异有统计学意义（P<0.05，见表1）。

2.2 CuCl₂对KFs细胞存活率的影响

与对照组相比，低浓度组细胞存活率无显著变化（P>0.05）；中浓度组、高浓度组细胞存活率呈浓度依赖性降低，差异有统计学意义（P<0.05，见表2）。因此选用20，40 μmol/L CuCl₂进行后续的实验观察。

2.3 CuCl₂对KFs细胞迁移和创口愈合能力的影响

与对照组相比，中浓度组、高浓度组创口愈合率、细胞迁移能力明显降低（P<0.05），且高浓度组变化更显著（P<0.05，见图1、表3）。

2.4 CuCl₂对KFs细胞周期的影响

与对照组相比，中浓度组、高浓度组G0/G1期细胞阻滞率明显上升（P<0.05），S期和G2/M期细胞阻滞率下降（P<0.05，见表4）。

2.5 CuCl₂对KFs细胞侵袭能力的影响

与对照组相比，中浓度组、高浓度组细胞侵袭数明显减少（P<0.05），且高浓度组变化更显著（P<0.05，见图2、表5）。

3 讨论

研究表明，瘢痕疙瘩的形成与TGF-β1、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等信号分子的异常表达密切相关，这些因子通过激活Smad等信号通路，促进细胞增殖和胶原沉积，进而影响创口愈合^［5］ 。本研究从细胞信号通路的角度探讨了Cu²⁺对KFs细胞增殖、迁移、侵袭及TGF-β1表达的影响，首次系统阐述了Cu²⁺浓度依赖性影响KFs细胞中TGF-β1表达及细胞增殖、迁移、侵袭能力等生物学行为，这一发现为理解Cu²⁺在皮肤纤维化中的作用提供了新视角，并为开发靶向Cu²⁺的瘢痕疙瘩治疗策略奠定了理论基础。

TGF-β1是调控细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积的核心细胞因子，在瘢痕疙瘩的发生发展中发挥重要作用。TGF-β1通过调控细胞周期相关基因（如Cyclin D1、p21等），促进细胞增殖^［6］。TGF-β1不仅刺激Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成，还通过抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）活性并上调组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）表达，减少ECM降解，导致胶原过度沉积^［7］。TGF-β1通过诱导黏附分子（如整合素等）的表达，增强细胞-基质相互作用，促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移和侵袭^［8，9］。Ogen-Shtern等^［10］报道显示Cu²⁺可调控皮肤组织中TGF-β1的分泌，本研究中CuCl₂对KFs细胞TGF-β1的调控作用与此相符。本研究揭示了CuCl₂浓度梯度效应，低浓度CuCl₂对TGF-β1表达无显著影响，中浓度CuCl₂可明显下调TGF-β1表达，可能与Cu²⁺直接调控TGF-β1转录等有关；高浓度CuCl₂可能因其细胞毒性作用导致TGF-β1表达显著降低。与既往研究不同，Zhu等^［11］实验结果表明在浓度为15.6、31.2、62.5 μmol/L铜的培养基中TGF-β1表达增加，而TGF-β1表达最高水平的最佳铜浓度和最佳培养时间分别为31.2 μmol/L和48 h。

有研究表明铜螯合疗法可靶向TGF-β1并抑制多种癌症中的上皮-间质细胞转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）过程，而EMT可使癌细胞获得更强的迁移、侵袭和抗凋亡能力，与肿瘤的转移和预后不良密切相关，是一种潜在的有效治疗策略^［12］。本研究实验结果发现，中、高浓度CuCl₂可明显降低创口愈合率，抑制细胞迁移能力，且高浓度CuCl₂抑制效果更显著，分析可能与TGF-β1信号通路受干扰或细胞骨架重构受阻等有关^［13］。而高浓度CuCl₂可通过诱导细胞G0/G1期阻滞，减少进入增殖期的细胞数量，抑制细胞增殖，这种变化可能与高浓度CuCl₂引发氧化应激导致的特异性细胞周期调控有关，但需通过进一步实验来验证。中、高浓度CuCl₂可明显抑制细胞侵袭能力，且高浓度CuCl₂抑制效果更显著，分析认为可能与Cu²⁺通过调节TGF-β1等关键细胞因子分泌、影响MMPs活性、改变ECM组成和结构等途径抑制细胞侵袭能力有关^［14-16］，但需进一步通过实验来验证。

综上所述，Cu²⁺在适度浓度（20~40 μmol/L）可降低KFs细胞TGF-β1表达，抑制细胞增殖、迁移与侵袭能力，减缓创口愈合，减少瘢痕形成，其机制可能与细胞周期阻滞等有关。但本研究仍存在一定局限性，如Cu²⁺调控TGF-β1的确切分子机制尚未完全阐明，特别是其对TGF-β1转录后调控的影响及可能涉及的MAPK/ERK等非经典Smad通路需进一步实验验证，还需通过动物模型验证20~40 μmol/L CuCl₂在生物体内的安全性与有效性。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2022D01C756)