两种血清总胆红素参考测量方法检测结果的一致性评价

Consistency evaluation of results of two reference methods for total bilirubin in serum

摘要

目的 评价两种血清总胆红素参考测量方法检测临床血清样本结果的可比性，为实验室选择参考测量方法提供数据支持。 方法 依据CLSI EP9-A3文件要求，选择Doumas总胆红素参考测量方法和德国汉诺威临床化学研究所改良总胆红素候选参考测量方法进行正确度试验，通过后采用两种方法同时检测40份患者已检测完成的剩余血清。统计实验数据，以目测法检测离群值，以偏差图和百分比偏差图分析数据差异变化趋势，以Passing-Baklok回归模型和Deming回归模型评估两种方法检测结果在医学决定水平处的偏倚，以国家卫健委临床检验中心室间质评1/2TEa（7.5％）为可接受标准进行结果评价。 结果 两种参考测量方法对有证参考物质及RELA比对样本的检测结果均值均在合格范围内，偏倚小于±1.0％。两组方法检测结果之间具有良好的相关性（R² =0.999），目测未有离群值。检测结果差值具有恒定、恒比混合变化趋势。Deming回归方程为：y=0.976 3x-0.476 6，斜率95%CI为0.963 7~0.989 0，截距95%CI为-1.370 5~0.417 3，相关系数R² =0.999。Passing-Baklok回归方程为：y=-0.096 8x+0.970 7，斜率95%CI为0.964 7~0.979 6，截距95%CI为-0.506 6~0.252 4，相关系数R² =0.999。依据两个回归方程计算得到医学决定水平处相对偏倚在-3.87%至-2.54%之间，小于国家卫健委临床检验中心室间质评1/2TEa（7.5％）。 结论 总胆红素候选改良参考测量方法与经典参考测量方法检测结果一致性符合临床检测的要求。在标准品SRM916a能够稳定获得的情况下，优先选择Doumas总胆红素参考测量方法。

Abstract

Objective To evaluate the comparability of the results of two reference measurement methods for total bilirubin in clinical serum samples， and provide data support for choosing reference measurement methods in laboratory test. Methods In accordance with the requirements of the CLSI EP9-A3 document， the Doumas total bilirubin reference method and the modified total bilirubin candidate reference method of German Hannover Institute of Clinical Chemistry were selected for experiment of trueness， and then the remaining serum of 40 patients were simultaneously detected by both the two methods.Outliers were detected by visual inspection. The trend of data variation was analyzed using deviation chart and percentage deviation chart. The bias of the test results of the two methods at the medical decision level was evaluated by Passing-Baklok regression model and Deming regression model. The results were evaluated based on the 1/2 TEa（7.5%） of the external quality assessment of the National Health Commission Clinical Laboratory Center as the acceptable standard. Results The mean values of the test results of the certified reference materials and RELA comparison samples by the two reference measurement methods were all within the qualified range， and the bias was less than ±1.0%.There was a good correlation between the detection results by the two methods（R²=0.999）， and no outliers were observed visually. The difference in the test results showed a mixed variation trend of constant and constant ratio. The Deming regression equation was y=0.976 3x-0.476 6， the 95%CI of the slope was 0.963 7-0.989 0， the 95%CI of the intercept was -1.370 5 to 0.417 3， and the correlation coefficient R²=0.999. The Passing-Baklok regression equation was y=-0.096 8x+0.970 7， the 95%CI of the slope was 0.964 7-0.979 6， the 95%CI of the intercept was -0.506 6 to 0.252 4， and the correlation coefficient was R²=0.999. Based on two regression equations， the relative bias at the medical decision level was from -3.87% to -2.54%， which was less than 1/2 TEA（7.5%） of the inter-laboratory quality assessment of the National Health Commission Clinical Laboratory Center. Conclusion The consistency of the test results between the candidate modified reference measurement method for total bilirubin and the classical reference measurement method meets the requirements of clinical testing. When the standard SRM916a can be stably obtained， the Doumas total bilirubin reference measurement method should be given priority.

Graphical abstract

关键词

总胆红素 / EP9-A3 / 参考测量方法 / 一致性 / 偏倚 / 允许总误差

Key words

total bilirubin / EP9-A3 / reference measurement procedure / agreement / bias / allowable total error

血清总胆红素检测作为医学实验室检查的重要项目，其检测结果的准确性及不同实验室之间的一致性对临床医生诊断和鉴别诊断肝胆相关性疾病和其他众多疾病具有重要的参考意义^［1-3］。医学参考测量方法是不同实验室检测结果能够实现标准化、一致化的重要手段，在不同实验室检测结果的互认中也可以发挥重要作用^［4，5］。就总胆红素而言，以SRM 916a作为校准物质的Doumas总胆红素参考测量方法是目前绝大多数参考实验室在用的总胆红素参考测量方法。但是由于SRM 916a无法保证持续供应，德国汉诺威临床化学研究所在2018年报道对该方法进行了改良。文献报道，复现了该候选改良参考测量方法，并且检测性能良好，符合参考测量方法的相关要求^［6，7］。

为了进一步验证改良后参考测量方法的应用效果，本研究依据EP9-A3文件，通过使用临床患者剩余血清样本对两种参考测量方法的测量结果进行一致性分析，为实验室选择总胆红素参考测量方法提供更多理论支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Cary100紫外可见分光光度计（Agilent，美国）、Microlab-500型稀释配液仪（HAMILTON，美国），re⁃ference移液器（eppendorf，德国）。对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、四水酒石酸钾钠、氢氧化钠、安息香酸钠、EDTA二钠盐、醋酸钠均购自Sigma公司，咖啡因购自AMRESCD公司。标准品：SRM 916a购自美国国家标准与技术研究院（NIST），纯度：98.3%± 0.3%。

1.2 检测原理及试剂配制

1.2.1 检测原理

总胆红素参考测量方法和候选改良参考测量方法的基本检测原理是相同的：在咖啡因试剂存在条件下，胆红素与重氮试剂反应生成偶氮胆红素，加入碱性酒石酸后使颜色不稳定的紫红色偶氮胆红素转化为稳定的蓝色偶氮胆红素，其最大吸收峰由530 nm转移至598 nm，在该波长下偶氮化合物的吸光度与胆红素浓度呈正比。

1.2.2 试剂配置

依据参考文献［8］中的内容配制相关试剂，包括：咖啡因试剂、碱性酒石酸溶液、亚硝酸钠溶液、对氨基苯磺酸溶液、重氮试剂以及Doumas总胆红素参考测量方法中总胆红素标准溶液和标准工作溶液。实验室测量条件：全程避光，温度25 ℃；波长598 nm；光谱带宽2 nm；光径10.0 mm。两种方法的详细加样条件及步骤见表1。

1.3 检测对象

收集2024年4月北京航天总医院检验科检测完成的患者剩余血清40份，血清总胆红素浓度为11.05~352.7 μmol/L。

正确度验证使用的样本包括国家一级标准物质GBW09184（108.1±1.9）μmol/L、GBW09185（44.6±0.8）μmol/L、2021年国际参考实验室比对样本21RELA-A（31.7±1.7）μmol/L、21RELA-B（22.2±1.2）μmol/L。

1.4 方法

1.4.1 正确度试验

采用Doumas总胆红素参考测量方法和候选改良参考测量方法检测国家一级标准物质和2021RELA比对标本，每个标本重复测量3次，分析均值与认定值的偏倚。

1.4.2 一致性比对

用Doumas总胆红素参考测量方法和候选改良参考测量方法同时测定40份患者血清标本，每例标本重复测量2次，分5 d完成，每批次测量实验前中后均检测GBW09184、GBW09185作为实验质控，确保测量结果的准确。检测完成后取两次检测的均值作为一致性比对分析的数据进行分析。

1.5 统计学分析

以目测法检测离群值，以偏差图和百分比偏差图分析数据差异变化趋势，选择合适的回归模型进行计算。以上统计学分析步骤分别使用Excel2021和MedCalc22软件完成。

2 结果

2.1 正确度验证结果

两种参考测量方法对标准物质和21RELA样本的检测结果均值均在合格范围内，偏倚均小于1.0％（见表2）。

2.2 目测法检测离群值

以Doumas参考测量方法的测量结果为x轴，候选改良参考测量方法的结果为y轴，绘制散点图，两组检测结果之间具有良好的相关性（R² =0.999），目测未见有离群值（见图1）。

2.3 利用数据作图评估偏倚

对无离群值的40例血清样本结果，以Doumas参考测量方法的测量结果为x轴，候选改良参考测量方法与Doumas参考测量方法结果的偏差和百分比偏差分别为y轴，绘制偏差图，结果显示，两种参考测量方法的差值具有恒定、恒比混合变化趋势（见图2和图3）。

2.4 方法学比对和偏倚评估

由于两种检测系统的差值具有恒定、恒比混合变化趋势，所以选择Deming回归方程和Passing-Baklok回归方程进行线性拟合。Deming回归方程为：y=0.976 3x-0.476 6，斜率95%CI为0.963 7~0.989 0，截距95%CI为-1.370 5~0.417 3，相关系数R² =0.999（见图4）。Passing-Baklok回归方程为：y=-0.096 8x+0.970 716，斜率95%CI为0.964 7~0.979 6，截距95%CI为-0.506 6~0.252 4，相关系数R² =0.999（见图5）。

2.5 医学决定水平处偏倚

将总胆红素医学决定水平处的值34.20，171.00，342.00 μmol/L分别带入两个回归方程，预估偏倚的范围为-3.81%至-2.54%，均在可接受范围内（见表3）。

3 讨论

医学实验室提供的检验结果的准确性，对目前的“精准医疗”和“不同机构检验结果互认”都具有重要的意义。通过验证结果的溯源性可以直观地比对不同检测结果的一致性。参考测量方法是量值溯源的重要组成部分，其和参考物质、参考实验室等共同组成了参考测量系统。因此研究参考测量方法，或复现并验证已经被收录的参考测量方法是参考实验室重要的工作之一^［9］。 国际医学检验溯源联合委员会（JCTLM）认定的血清总胆红素参考测量方法目前是由Jendrassik-Grof法改进而来的Doumas参考测量方法。该方法经过众多实验室的复现与验证，性能稳定，一直在胆红素检测的量值溯源中起着重要的作用^［8-11］。该方法的核心影响因素就是T-Bil标准原液和标准曲线的制备是否能够达到参考测量方法的要求。目前其原液的来源主要是美国国家标准与技术研究院（NIST）生产的SRM 916a。但是该物质一直无法保证连续的向市场供应。这使得参考实验室在开展总胆红素参考测量的过程中会有一定的不确定因素影响。2018年德国汉诺威临床化学研究所经过研究使用摩尔吸光系数来进行校准，对Doumas参考测量方法进行了改良。本实验室同时使用这两种参考测量方法参加了2022年、2023年的RELA比对和2022年卫生部临检中心组织的总胆红素参考测量的比对，实验结果良好，均在合格范围内。

在验证过两种参考测量方法的各项检测性能均符合参考测量方法的要求后，本研究希望依据EP9-A3文件的相关要求，通过检测临床患者血清样本来比对两种方法检测结果的一致性，为实验室选择总胆红素参考测量方法提供更多的理论支持。通过正确度试验发现两者在检测有证参考物质时的偏倚非常小，在-0.95%至0.90%之间。单就此来看，候选改良参考测量方法不仅操作更简便，而且减少了使用标准曲线而引入的误差，在实验室选择参考测量方法时具有一定的优势。

在正确度试验通过后，依据EP9-A3文件的要求，对两者进行了检测结果的一致性比对，两种方法的检测结果相关性较好，通过统计学分析发现两者在总胆红素医学决定水平处产生的预期偏倚在-3.87%至-2.54%之间，在临床可接受范围内（<±7%）。虽然通过选取的两个回归模型发现两者的预期偏倚是符合临床检测的要求的，但是作为参考测量方法，本次研究发现候选改良参考测量方法在检测此次研究收集的临床血清时相较于Doumas参考测量方法产生了一定的负偏倚，这在之前复现该改良方法时并未出现。因此也提示实验室在选择参考测量方法时应该进行更多检测结果的一致性分析。

综上所述，总胆红素候选改良参考测量方法与经典参考测量方法检测结果一致性符合临床检测的要求。但是在此次比对中两者存在一定的负偏倚，在标准品SRM 916a能够稳定获得的情况下，仍提示参考测量实验室使用Doumas参考测量方法。

参考文献

[1] 于婷，张娟丽，孙晶，等. 2020年血清中总胆红素测定比对试验结果分析［J］. 国际检验医学杂志，2021，42（20）：2523-2526.

[2] 邵燕，刘淑明，孙慧颖，等. 血清总胆红素测量原理与测量结果正确度的相关性研究［J］. 标记免疫分析与临床，2017，24（9）：1052-1055.

[3] 孟祥兆，李敏，孙江漫，等. 总胆红素改良候选参考测量方法与常规检测系统检测结果的可比性分析［J］. 黑龙江医学，2024，48（22）：2745-2748.

[4] 居漪. 检验医学参考测量系统的研究与应用［J］. 检验医学，2021，36（3）：237-239.

[5] 唐利萍，刘明锦，刘冠财，等. 医学参考系统在我国IVD企业的应用与思考［J］. 检验医学，2021，36（3）：250-254.

[6] Klauke R， Kytzia HJ， Weber F，et al. Reference measurement procedure for total bilirubin in serum re⁃evaluated and measurement uncertainty determined［J］.Clin Chim Acta，2018，481：115-120．

[7] 李敏，孟祥兆，孙江漫，等. 血清总胆红素改良参考测量程序的复现及性能评价［J］. 临床检验杂志，2022，40（4）：265-267.

[8] Doumas BT， Kwork⁃cheung PP， Perry BW，et al. Candidate refe⁃rence method for determination of total bilirubin in serum： deve⁃lopment and validation［J］. Clin Chem，1985，31（11）：1779- 1789．

[9] 周伟燕，刘庆香，刘珍妮，等. 计量溯源性和临床检验参考系统［J］. 临床检验杂志，2020，38（10）：721-728.

[10] 吴立山，沈敏，徐峰，等. 血清总胆红素参考测量方法的建立及其不确定度评估［J］. 国际检验医学杂志，2014（2）：205-207.

[11] 李敏，孟祥兆，孙江漫，等. 基于CLSI EP9⁃A3的总胆红素方法学比对及偏移评估［J］. 标记免疫分析与临床，2022，29（7）：1215-1218.

基金资助

“国家质量基础的共性技术研究与应用”重点专项基金项目(2017YFF0205401)