基于血清药物化学和网络药理学探讨通腑止血方治疗脑出血的药效物质和作用机制

Pharmacodynamic material basis and mechanisms of Tongfu Zhixue formula treating cerebral hemorrhage based on serum pharamcochemistry and network pharmacology

摘要

目的 基于超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-exactive orbitrap MS）技术定性分析通腑止血方的入血成分，并结合网络药理学探究其治疗脑出血的潜在作用机制。 方法 通过对比含药血清、空白血清的色谱图，并结合数据库二级图谱、文献及对照品裂解信息，分析鉴定通腑止血方的入血成分。借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、Swiss Target Prediction、Comparative Toxicogenomics Database和Genecards数据库分别对入血成分、疾病进行靶点收集筛选，运用Cytoscape软件进行网络可视化处理，以中心度≥1 252.14、度值≥37.94为阈值筛选关键靶点，构建药材-入血成分-关键靶点图；取度值前10的靶点为核心靶点，对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析和基因本体（GO）富集分析，运用Pymol软件对筛选出的度值前10的核心靶点与相联系的入血成分进行分子对接验证。 结果 共鉴定出14个原形成分，分别为人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷F1、人参皂苷Rh1、三七素、槲皮素、柠檬酸、水杨酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚；关键靶点共111个，其中度值前10的核心靶点分别为PTGS2、IL-1β、TNF、CASP3、IL-6、HSP90AA1、Bcl-2、CYP3A4、RELA和AKT1。KEGG富集分析显示，核心靶点主要富集于TNF信号通路、IL-17信号通路及NF-κB信号通路。分子对接表明，除水杨酸和柠檬酸外，其他核心成分（如人参皂苷Rb1、大黄酸）与核心靶点结合能均≤-6.0 kcal/mol，其中大黄酸与HSP90AA1结合能达-10.4 kcal/mol。 结论 通腑止血方主要通过人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚7个入血成分调控TNF、IL-1β、RELA、AKT1等核心靶点，从而抑制TNF/NF-κB炎症级联反应及凋亡通路，同时激活PI3K-Akt促存活信号，协同发挥抗炎、抗凋亡及血管修复作用。

Abstract

Objective To qualitatively analyze the blood components of Tongfu Zhixue formula by ultra-high performance liquid chromatography tandem quadrupole electrostatic field orbit trap mass spectrometry（UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）， and explore the potential mechanism of its treatment of intracerebral hemorrhage（ICH） by network pharmacology. Methods By comparing the chromatograms of medicated serum and blank serum， combined with database secondary spectra， literature， and reference substance lysis information， the absorbed components of Tongfu Zhixue formula were analyzed and identified. The target genes of absorbed components and diseases were collected and screened using databases such as Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）， Swiss Target Prediction， Comparative Toxicogenomics Database， and Genecards， and network visua⁃lization processing was performed using Cytoscape software. Key targets were screened using a threshold of centrality ≥1 252.14 and degree value ≥37.94， and then a medicinal material-blood-entering component-key target diagram was constructed. The top 10 targets by degree value were taken as the core targets， and analyzed by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analysis and Gene Ontology（GO） enrichment analysis. The molecular docking of the top 10 core targets screened by degree value using Pymol software and their associated blood-entering components were verified. Results A total of 14 prototype components（absorbed without metabolism） were identified， including ginsenoside Rf， ginsenoside Rb1， ginsenoside Rg1， ginsenoside F1， ginseno⁃side Rh1， dencichine， quercetin， citric acid， salicylic acid， aloe emodin， rhein， emodin， chrysophanol， and physcion. A total of 111 key targets were identified， and the top 10 core targets by degree value were PTGS2， IL-1β， TNF， CASP3， IL-6， HSP90AA1， Bcl-2， CYP3A4， RELA， and AKT1. The core targets were mainly enriched in TNF signaling pathway， IL-17 signaling pathway， and NF-κB signaling pathway. Molecular docking indicated that， apart from salicylic acid and citric acid， the binding energies of other core components（such as ginsenoside Rb1， rhein） with core targets were all ≤-6.0 kcal/mol， and the binding energy of rhein with HSP90AA1 was -10.4 kcal/mol. Conclusion Tongfu Zhixue formula exerts its synergistic anti-inflammatory， anti-apoptotic， and vascular repair effects by inhibiting TNF/NF-κB inflammatory cascade and apoptotic pathways， activating PI3K-Akt pro-survival signaling pathway through seven absorbed components（ginsenoside Rb1， ginsenoside Rg1， aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol， and physcion）， which regulates core targets（e.g.， TNF， IL-1β， RELA， AKT1）.

Graphical abstract

关键词

通腑止血方 / 脑出血 / 核心通路 / 炎症 / 血清药物化学 / 网络药理学

Key words

Tongfu Zhixue formula / intracerebral hemorrhage / core pathway / inflammation / serum pharmacology / network pharmacology

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外伤性脑实质出血^［1］，作为卒中的一种严重亚型，在中国卒中患者中占23.4%。该病以突发性、病情快速进展以及高致死和致残率而著称^［2］。针对急性脑出血的临床治疗，目前主要依赖于血压控制、颅内压降低的脱水治疗、活血化瘀以及手术干预等手段^［3］。

脑出血中医病因主要是风、火、痰、瘀、毒，病位是脑府，基本病机为血气并走于上，血随气逆夹杂痰、瘀、火上冲脑络，腑气不通，导致脑络破裂而发病，内邪蓄积成毒，其腑实与血瘀是重点。中医理论认为离经之血便为瘀血。因此，尽管脑出血有出血症状，依据中医理论亦当活血化瘀，治疗上以通腑化瘀为要^［1］。

通腑止血方是岐黄学者张允岭教授团队治疗急性脑出血的经验方，该方由三七和熟大黄组成，主治瘀热蒙蔽清窍证，治法为通腑开窍，凉血止血。《名医别录》^［4］中记载《神农本草经》原文：“大黄，味苦，寒。主下瘀血血闭，寒热，破癥瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏。”大黄有将军之号，为通腑之要药。《医学衷中参西录》^［5］言：“三七……善化瘀血，又善止血妄行，为吐衄要药。病愈后不至瘀血留于经络……化瘀血不伤新血，允为理血妙品。”将三七和熟大黄配伍，因熟大黄能破瘀通腑，化瘀而不伤正，三七止血化瘀，活血止痛，止血而不留瘀，一通一涩，达到通腑开窍，凉血止血的目的。

该方在临床长期应用取得满意效果，但其物质基础及其发挥药效的作用机制尚不明确。因此，本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS结合网络药理学方法对通腑止血方的入血成分进行分析，明确其药效物质基础，并借助网络药理学和分子对接技术阐明其治疗脑出血的潜在作用机制，为今后通腑止血方的研究提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

高效液相色谱与质谱联用仪（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS），配有热电喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 4.1质谱工作站、Vanquish超高效液相色谱系统（含二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器）（美国Thermo Scientific公司）；ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm（2.1 mm×100 mm Colu⁃mn，爱尔兰Waters公司）；LG-21M立式高速大容量冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；BSA224S电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器）；RE-52AA旋转蒸发器（北京天林恒泰科技有限公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分析天平（AG135，瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.1.2 试药

三七、熟大黄（批号：221005、221105，亳州市中正中药材饮片有限公司）；戊巴比妥钠（批号：261-776-6，美国Sigma公司）；三七素（批号：24080917，北京倍特仁康生物医药科技公司，纯度≥98%）；柠檬酸（批号：SM0425GA14）、水杨酸（批号：Y25F12C139862）、槲皮素（批号：C09S8Y43412）、人参皂苷Rf（批号：P07J11L115714）、人参皂苷Rg1（批号：C27N11Q132589）、人参皂苷Rb1（批号：N18GB163839）、芦荟大黄素（批号：A17GB145379）、大黄酸（批号：Y06J10F92311）、大黄素（批号：T17O11F127680）、大黄酚（批号：T12N11F130577）、大黄素甲醚（批号：M15GB141118），以上试剂均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%；人参皂苷Rh1（批号：D21032011）、人参皂苷F1（批号：D21041106），以上试剂购自南京狄尔格医药科技有限公司，纯度均≥98%。

1.1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠12只，体质量（200±20）g，由维通利华（北京）实验动物技术有限公司提供，许可证号为：SCXK（京）2021-0006。所有动物均饲养于北京中医药大学实验动物中心标准屏障环境内，使用许可证号：SYXK（京）2020-0033，自由饮水进食，明暗节律12 h交替。温度为21~25 ℃，湿度为50%~70%，动物实验方法及条件经北京中医药大学实验动物护理和使用伦理委员会批准（BUCM-2023101602-4014）。

1.1.4 动物服药剂量换算

根据黄继汉等^［6］教授主编的《中国临床药理学与治疗学》中“药理试验中动物间和动物与人间的等效剂量换算”进行人和大鼠之间服药剂量的换算。按人每日临床剂量为三七和熟大黄临床用量，体质量60 kg计算，人用剂量约为0.183 g/kg，根据换算系数为6.17，换算得出大鼠的每日服药剂量约为1.131 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 通腑止血方入血成分分析

1.2.1.1 混合对照品溶液的制备

精密称定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷F1、槲皮素、柠檬酸、水杨酸、三七素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，配制成质量浓度4~16 μg/mL的混合标准溶液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.2.1.2 血清样品的制备

灌胃药液的制备：一定质量的三七和熟大黄，加入适量的饮用水浸泡1 h，煎煮后滤液过200目筛，浓煎至一定体积，旋转蒸发，制得饮片质量浓度约为0.314 g/mL的浓缩液，大鼠的灌胃量为0.361 mL/100 g。

血清样本采集与处理：大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组和药物处理组，每组6只。对照组自由进食饮水，药物处理组每天下午5点灌胃1.2.1.1项下制备的浓缩液，持续1周。第7天，药物处理组禁食不禁水12 h，随后接受高剂量药物治疗，1 h后用2%戊巴比妥钠麻醉。通过腹主动脉采集血液样本，静置、涡旋振荡、离心后收集上清液，存放在-80 ℃冰箱中，用于后续处理和分析。

血清样品的预处理：将-80 ℃保存的空白血清与含药血清于4 ℃解冻后，精密吸取血清样本100 μL，加入乙腈1 200 μL，涡旋振荡1 min，冰水浴中超声10 min，离心25 min（4 ℃，13 000 r/min），将上清液转移至干净的1.5 mL离心管中，冷旋至干。残余物用100 μL甲醇复溶，冰水浴超声10 min，离心25 min（4 ℃，13 000 r/min），进样分析。

1.2.1.3 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，Ireland）；柱温35 ℃，样品盘温度4 ℃，流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱程序：0~5 min，99% B；5~25 min，99%~67% B；25~40 min，67%~40% B；40~55 min，40%~5% B。流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

质谱条件：热电喷雾离子源（HESI），毛细管电压正离子模式3.5 kV，负离子模式3.0 kV。扫描范围100~1 500 m/z，一级扫描分辨率70 000，二级扫描分辨率17 500。毛细管温度320 ℃，鞘气流速35 arb，辅助气流速10 arb，辅助气温度400 ℃，碰撞能20，40，60 eV。

1.2.1.4 液相色谱质谱联用数据分析

通过比对通腑止血方样品、大鼠含药血浆及空白血浆样品的色谱图，结合标准品色谱图和相关文献^［7-12］，采用Xcalibur 3.0软件对通腑止血方入血成分进行鉴定。

1.2.2 网络药理学研究

1.2.2.1 成分靶点及疾病靶点获取

利用TCMSP、Swiss Target Prediction和Comparative Toxicogenomics Database数据库获取通腑止血方的入血成分靶点，通过Uniprot数据库查询对应的人类基因名称，剔除重复和评分值为0的靶点。在Genecards数据库中，使用“thrombus”“blood coagulation”“bleeding”“hemostasis”关键词检索与止血化瘀相关的作用靶点^［13］，使用“inflammation”“anti-inflammation”关键词检索与炎症相关的作用靶点^［14］。

1.2.2.2 蛋白质互相作用（PPI）网络构建及核心靶点筛选

使用Jvenn工具确定了通腑止血方和脑出血的共同靶点，作为治疗脑出血的潜在靶点。将这些靶点导入STRING平台，设置物种为“Homo sapiens”，相互作用阈值为0.7，隐藏孤立节点，生成PPI网络。利用Cytoscape 3.9.1和Centiscape 2.2插件，根据中心度（betweenness）和度值（degree）2个参数筛选关键靶点，构建PPI网络图，并按照药材与成分的归属关系构建药材-入血成分-关键靶点图。

1.2.2.3 KEGG信号通路及GO功能分析

利用David数据库进行KEGG和GO富集分析，在KEGG中剔除与感染、代谢疾病、癌症相关的通路，选取与脑出血核心病理机制止血化瘀和通腑（例如炎症、免疫调节、细胞凋亡和组织修复）相关的通路，共筛选出15条进行可视化，并将其与药物、成分和靶点的相关调控情况进行分析，使用Cytoscape 3.9.1构建“药物-入血成分-核心靶点-通路”网络图；在GO的生物学过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）中，以FDR<0.05、Fold Enrichment>5、功能应直接关联脑出血核心病理机制止血化瘀和通腑（例如炎症、免疫调节、细胞凋亡和组织修复）为筛选条件，分别选取前5个条目进行可视化和机制分析。

1.2.2.4 分子对接

为研究核心靶点与通腑止血方入血成分的相互作用，根据“药物-入血成分-核心靶点-通路”网络图中的核心靶点和入血成分对应关系进行分子对接，从结构生物信息学研究合作组织（Research Collaboratory for Structural Bioinforma⁃tics，RCSB）PDB数据库（Protein Data Bank，PDB）下载核心靶点3D结构。在Pymol中预处理这些蛋白，移除水分子并分离配体和受体。从PubChem下载通腑止血方入血成分的2D结构，并在Chem3D中最小化能量。使用AutoDock Vina进行分子对接，计算结合能，并用Pymol展示对接结果。

2 结果

2.1 通腑止血方入血成分鉴定结果

使用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS分析通腑止血方含药血清，结果见图1和图2。从血清中鉴定出14个原型成分（见表1），其中7个来自大黄，6个来自三七，槲皮素为二者的共有成分，主要为蒽醌类和三萜皂苷类化合物。

2.2 网络药理学

2.2.1 入血成分靶点获得

利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术分析通腑止血方含药血清和空白血清，识别出14个入血原型成分。通过TCMSP、Swiss Target Prediction和Comparative Toxicogenomics Database数据库，发现816个潜在治疗靶点；通过Gene Cards数据库，以“thrombus”“blood coagulation”“bleeding”“hemostasis”“inflammation”“anti-inflammation”为关键词，筛选出19 295个脑出血相关基因靶点。

2.2.2 PPI网络构建及核心靶点筛选

将脑出血靶点与入血成分靶点交集，共得到728个交集靶点，绘制韦恩图，结果见图3。将交集靶点输入STRING数据库中，设置筛选条件后，保存得到的相应结果文件，该网络包含719个节点和5 985条边。利用Cytoscape软件中的centiscape插件进行可视化分析，以betweenness≥1 252.14、degree≥37.94为阈值筛选关键靶点，该网络图中包括111个节点，3 216条边（见图4），通过构建的药材-入血成分-关键靶点图可知，有11个是三七独有的靶点，29个是熟大黄独有的靶点，其余71个为三七和熟大黄共有的靶点（见图5）。选取111个关键靶点中度值排名前10位的核心靶点，且都为三七和熟大黄的共有靶点，分别是PTGS2、IL-1β、TNF、CASP3、IL-6、HSP90AA1、Bcl-2、CYP3A4、RELA和AKT1，预测这些核心靶点和入血成分在通腑止血方对脑出血的治疗调控网络中起着至关重要的作用。

2.2.3 KEGG和GO通路富集分析

通过KEGG富集分析，共筛选出91条显著富集的信号通路。进一步从中筛选出15条与脑出血核心病理机制密切相关的信号通路进行可视化（见图6）。基于富集倍数与统计学显著性（P值）的综合评估，IL-17和TNF信号通路在这两项指标上表现最为突出（富集倍数>20，P<1×10^-7）。通过对文献查阅和对通腑止血方的药物-入血成分-核心靶点-通路数据相关分析，得到15个通路受大黄或三七成分调控（见表2），其中细胞凋亡信号通路、T细胞受体信号通路和PI3K-Akt信号通路主要由三七中的成分主导，细胞因子-受体互作和VEGF信号通路主要由大黄中的成分主导，而其他通路则由三七和大黄共同主导，并构建通腑止血方的“药物-入血成分-核心靶点-通路”网络图（见图7），较多通路涉及靶点RELA、TNF、AKT1、IL-6、IL-1β，而入血成分三七素并未与核心靶点直接关联。

GO功能富集分析得到基因的各种生物学功能，涉及BP条目127个，CC条目8个，MF条目11个，分别筛选出5个条目，对其进行可视化，结果见图8。关键条目包括“炎症反应”（BP）、“蛋白质复合物”（CC）及“酶结合”（MF）。同时将筛选出的GO富集显著条目和脑出血治疗靶点相结合，分析相应条目与脑出血治疗的关联机制，GO富集结果显示，与脑出血治疗相关的显著条目包括炎症反应、一氧化氮生物合成的正向调控和外源性凋亡的负向调控（见表3），提示药物可能通过抑制炎症因子（如IL-6、TNF）和激活抗凋亡通路（如Bcl-2）发挥治疗作用。

2.2.4 分子对接

根据“药物-入血成分-核心靶点-通路”网络图中核心靶点和入血成分的连接关系进行分子对接，其中三七素与各核心靶点无连接，不纳入分子对接，其他成分与靶点无连接的，以0值补缺。分子对接结果见图9。

分子对接显示，三七皂苷类成分（如人参皂苷Rb1、Rg1）主要靶向TNF、CASP3、IL-6，其中人参皂苷Rb1对CASP3（-9.5 kcal/mol）和TNF（-9.4 kcal/mol）结合能最强，提示其可能在抗炎或凋亡中起关键作用；人参皂苷Rg1对IL-6（-7.6 kcal/mol）和TNF（-8.5 kcal/mol）也有显著结合。大黄游离蒽醌类成分（大黄酸、大黄素等）主要靶向HSP90AA、CASP3、TNF、IL-1β，其中，大黄酸对HSP90AA（-10.4 kcal/mol）结合能最强，提示其可能通过调控热休克蛋白发挥药效。芦荟大黄素和大黄酚对IL-1β（-7.5，-7.7 kcal/mol）和TNF（-8.4，-8.2 kcal/mol）的结合能较高，可能参与炎症调控。槲皮素作为共同成分，表现出广泛且强效的结合能力，表明其可能通过多靶点协同发挥抗炎、促凋亡等作用。水杨酸和柠檬酸对核心靶点的结合能较弱，可能不直接参与核心通路，但可能通过其他机制（如调节微环境）辅助药效。

HSP90AA与游离蒽醌成分之间的结合能均<-9.0 kcal/mol，结合能力强，利用PyMOL软件对HSP90AA与游离蒽醌成分（以芦荟大黄素和大黄酸为例）进行分子对接可视化分析，结果显示，游离蒽醌成分与HSP90AA之间能够通过氢键作用稳定结合在靶蛋白氨基酸残基形成的口袋中（见图10）。

3 讨论

ICH作为急性脑血管病的重要亚型，以其高致死率和致残率严重威胁人类健康。现代医学虽通过降压、手术等手段改善症状，但对血肿周围继发性损伤（如神经炎症、氧化应激及细胞凋亡）的调控仍存在局限。中医理论认为，脑出血的核心病机为“风火痰瘀毒”上扰清窍，导致“血溢脑络，腑气不通”，治疗需兼顾“通腑泻热”与“化瘀止血”，以恢复气血平衡^［1］。在此理论指导下，通腑止血方以三七、熟大黄配伍，体现“一通一涩”的治则：三七化瘀止血而不留邪，熟大黄通腑泻热以祛瘀毒，二者协同共奏“通腑开窍、凉血止血”之效。然而，其药效物质基础及分子机制尚未明晰，制约了复方的现代化研究与临床推广。本研究基于血清药物化学与网络药理学，首次系统解析通腑止血方的入血成分群，揭示三七皂苷（如人参皂苷Rg1、Rb1）和熟大黄游离蒽醌（如大黄酸、大黄素）通过多靶点（TNF、CASP3、HSP90AA1等）调控炎症、凋亡及氧化应激网络的协同机制，从分子层面诠释“通腑止血”理论的科学内涵，为中药复方“成分-靶点-通路”一体化研究提供范例，亦为脑出血的精准治疗开辟新思路。

3.1 指标成分的确定

本研究基于“成分-靶点-通路”多维整合策略，通过UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定出通腑止血方14个原型入血成分，结合网络药理学预测的核心靶点群及分子对接验证，最终筛选出7个具有协同调控效应的核心指标成分。筛选过程遵循以下原则：①成分与核心靶点之间有连接且分子对接结合能≤-7.0 kcal/mol；②优先选择在凋亡、炎症、氧化应激等脑出血关键病理环节中具有文献报道机制的成分（如人参皂苷Rb1在缺血性脑损伤模型中已被证实能下调TNF-α/NF-κB信号轴）；③排除虽具有广谱结合能力但缺乏靶点特异性或通路聚焦性的共有成分，如槲皮素。

研究结果表示，三七素与核心靶点之间无连接，柠檬酸和水杨酸与核心靶点之间的分子对接结合能较弱（≥-6.3 kcal/mol），槲皮素虽具有广谱结合能力但缺乏靶点特异性或通路聚焦性，而相关文献报道人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1和大黄中的游离蒽醌成分能够抑制炎症因子NF-κB和TNF-α水平的表达，从而减轻急性脑出血^［42-45］。

因此，通过该策略确定人参皂苷Rg1、Rb1及芦荟大黄素等5种游离蒽醌类成分为复方核心物质基础，为后续的复方机制解析奠定了坚实基础。

3.2 核心通路的确定

根据通腑止血方的“药物-入血成分-核心靶点-通路”网络图可以得知15条信号通路与10个核心靶点的相互作用关系，通常来说，连接更多靶点的通路可能在网络中起更核心的作用，因为它们涉及更多的病理环节。其中，IL-17信号通路和TNF信号通路各连接7个靶点，NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路各连接5个靶点，其他通路连接的靶点数量较少。

TNF-α是炎症反应的关键因子，参与神经炎症和细胞凋亡^［46］，与多个靶点（如IL-6、CASP3、RELA）相关，可能在驱动炎症反应中起核心作用；IL-17信号通路促进中性粒细胞浸润和炎症^［15］，与多个炎症相关靶点连接，但在急性脑出血中的角色可能不如TNF通路直接；NF-κB信号通路作为炎症和凋亡的主要调控者，NF-κB的激活会促进多种炎症因子的表达^［19］，如IL-6、TNF，与多个关键靶点（PTGS2、IL-1β、TNF等）连接；PI3K-Akt信号通路参与细胞存活和凋亡的调控，与抗凋亡蛋白Bcl-2和促存活激酶AKT1相关，可能在保护神经元中起关键作用^［25］；MAPK信号通路涉及应激反应和炎症^［24］，连接多个靶点，但可能作为辅助通路与其他核心通路协同作用。关于通路的交叉调控情况，NF-κB通路可能被TNF信号激活，而TNF通路本身又受NF-κB调控，形成正反馈环路。此外，PI3K-Akt通路可能通过抑制CASP3和促进Bcl-2来拮抗凋亡通路的作用^［25］。

综上所述，TNF信号通路和NF-κB信号通路连接最多靶点，并且调控关键的炎症和凋亡过程，且根据分子对接结果，复方成分如人参皂苷Rb1和大黄酸对TNF、CASP3、HSP90AA等靶点具有高亲和力，进一步支持TNF和NF-κB通路的重要性，确定二者为并列核心通路，此外，PI3K-Akt通路在细胞存活中的重要性也不容忽视，但其连接的靶点数量稍少。

3.3 基于核心通路的通腑止血方指标成分治疗脑出血的分子机制

TNF信号通路和NF-κB信号通路是通腑止血方治疗脑出血的核心通路，通过抗炎、抗凋亡、抗氧化应激、促修复等机制协同治疗脑出血。本研究发现通腑止血方指标成分，如人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚等成分均可参与调控核心通路的多个相关靶点，表明通腑止血方指标成分可配伍协同作用于核心信号通路，发挥抗炎、抗凋亡、抗氧化应激、促修复等机制协同治疗脑出血。

研究显示，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1抑制TNF-α和IL-6表达，减轻炎症对血管内皮的损伤，维持止血微环境稳定^［47］。同时，人参皂苷Rg1激活PI3K-Akt通路，促进血管内皮细胞增殖与迁移，加速损伤血管修复^［18］，从而使三七不仅达到止血作用，更通过修复血管实现“祛瘀生新”。熟大黄中的游离蒽醌成分通过抑制肠道中炎症因子的表达，降低肠道通透性，防止细菌移位，从而达到通腑作用，并调控NF-κB通路减少促炎因子通过肠-脑轴进入循环系统，从而避免这些因子透过血脑屏障加重脑部炎症，因此可知熟大黄可以通过调控肠-脑轴平衡，在改善肠道功能的同时减轻脑出血后神经炎症^［48］，这一机制与中医“上病下治”理论高度契合，也从分子层面揭示了“通腑止血”的科学内涵。

综上，本研究通过对通腑止血方的血清药物化学、网络药理学及分子对接研究，系统分析了其入血原型成分及其在治疗脑出血中的潜在作用机制。首先，基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术，从通腑止血方含药血清中鉴定出14个入血原型成分，包括大黄酸、大黄酚、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1等，这些成分可能通过调控炎症、血管生成及神经元保护等途径发挥治疗作用。其次，通过网络药理学预测的核心靶点群（分别为PTGS2、IL-1β、TNF、CASP3、IL-6、HSP90AA1、Bcl-2、CYP3A4、RELA和AKT1）及分子对接验证，筛选出7个具有协同调控效应的核心指标成分，并确定为通腑止血方的指标成分，分别为人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚。最后，通过网络药理学分析确定TNF信号通路和NF-κB信号通路是通腑止血方治疗脑出血的核心信号通路，揭示了通腑止血方治疗脑出血的多靶点、多通路治疗机制。

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