小鼠心脏衰老的转录组重塑及组织学特征

Transcriptomic remodeling and histological characteristics of cardiac aging in mice

摘要

目的 探究小鼠心脏衰老的分子特征及组织学变化，筛选与衰老相关的关键基因及信号通路，为心脏衰老机制阐明和干预靶点筛选提供参考。 方法 选用10只健康雄性C57BL/6小鼠，分为青年组（8周龄）和老年组（20月龄）各5只。采用Illumina高通量转录组测序技术，比较分析两组心肌组织的基因表达差异，并结合DESeq2等生物信息分析方法筛选差异基因，利用KEGG数据库进行通路富集分析。同步采用HE染色观察心肌组织结构变化，并利用免疫荧光双重标记技术检测α-SMA分别与CDH4、SLC38A1及SLC38A4的蛋白表达与空间共定位。通过ImageJ和GraphPad Prism软件对组织学及分子表达数据进行统计分析。 结果 转录组分析显示，老年组与青年组相比共有499个基因上调、138个基因下调；差异表达基因显著富集于补体与凝血级联反应、细胞因子受体相互作用等免疫和代谢相关通路。HE染色结果显示，老年组心肌细胞的横截面积较青年组显著增大（P<0.05），周长也有增加趋势（P=0.084）。免疫荧光显示老年组心肌组织中α-SMA表达显著增加（P<0.01），且α-SMA与CDH4、SLC38A1及SLC38A4蛋白的空间共定位增强。 结论 小鼠心脏衰老存在免疫、代谢、细胞黏附等多条信号通路的分子重塑，并伴随成纤维细胞活化和组织结构变化。SLC38A1、CDH4和SLC38A4分子可能为心脏衰老干预的潜在新靶点。

Abstract

Objective To investigate molecular features and histological changes associated with cardiac aging in mice， and screen key genes and signaling pathways related to aging for providing references for the study on the mechanism of cardiac aging and the screening of intervention targets. Methods Ten healthy male C57BL/6 mice were divided into young group（8 weeks old） and old group（20 months old）， with 5 mice in each group. Illumina high-throughput transcriptome sequencing was employed to compare and analyze gene expression differences in myocardial tissue between the two groups. Combined with bioinformatics analysis methods such as DESeq2， differentially expressed genes were screened， and the pathway enrichment analysis was performed using the KEGG database. HE staining was used to observe changes in myocardial tissue structure， and immunofluorescence double labeling was employed to detect the protein expression and spatial co-localization of α-SMA with CDH4， SLC38A1， and SLC38A4. ImageJ and GraphPad Prism software were utilized to conduct statistical analysis of data. Results Transcriptome analysis revealed that， compared with young group， 499 upregulated genes and 138 downregulated genes were detected in old group. The differentially expressed genes were significantly enriched in immune- and metabolism-related pathways， such as complement and coagulation cascades， and cytokine-cytokine receptor interactions. HE staining results showed a significant increase in the cross-sectional area of cardiomyocytes in old group compared to young group（P<0.05）， and a increased trend of perimeter（P=0.084）. Meanwhile， immunofluorescence results indicated a significant increase of α-SMA expression（P<0.01）， and strengthened spatial co-localization with CDH4， SLC38A1， and SLC38A4 in the aged myocardial tissue. Conclusion Mouse cardiac aging involves molecular remodeling of multiple signaling pathways related to immune response， metabolism， and cell adhesion， and is accompanied by fibroblast activation and changes in tissue structure. SLC38A1， CDH4， and SLC38A4 could serve as potential new targets for interventions against cardiac aging.

Graphical abstract

关键词

心脏衰老 / 转录组测序 / 基因表达 / 免疫荧光 / 组织重塑 / 纤维化

Key words

cardiac aging / transcriptome sequencing / gene expression / immunofluorescence / tissue remodeling / fibrosis

随着全球人口老龄化趋势日益加剧，心血管疾病，尤其是冠状动脉疾病和心肌梗死，逐渐成为严重的公共卫生问题。心脏衰老被认为是这些疾病发生和发展的重要基础环节，并与高血压、吸烟、糖尿病、缺乏运动、肥胖和高血脂等危险因素密切相关^［1，2］。近年来，研究者对于心脏衰老过程中的分子机制产生了越来越多的关注，特别是在心肌细胞和组织层面的变化方面。有研究表明，冠状动脉疾病的发生与动脉粥样硬化有关，该过程可能自较早的生命阶段起步，随后随着年龄的增长逐步发展和加剧^［3-5］。因此，深入理解心脏衰老的分子机制对相关疾病的防治具有一定参考价值^［6］。

虽然目前关于心脏衰老的机制已经有了一些认识^［7］，但其中涉及的具体分子变化和代谢机制仍然未被完全阐明。特别是在结构和细胞组成发生重塑^［8］的背景下，如何揭示多层次、动态的分子过程仍是一个值得进一步探索的问题。心脏衰老是一个由多基因、多通路参与的复杂生物学过程。为初步探索其分子特征，本研究尝试对年轻和老年小鼠心脏进行转录组测序与生物信息学分析，以期获得与年龄相关的差异表达基因谱。进一步地，为弥补组学数据在空间分辨率上的局限，研究结合了组织病理学和免疫荧光定位技术，初步观察这些候选分子在心肌组织中的表达模式，为后续聚焦于特定分子的功能研究提供初步依据。

1 材料与方法

1.1 动物、主要试剂和仪器

10只健康的雄性C57BL/6小鼠，分为两组：青年组（约8周龄）和老年组（饲养至20个月），均由空军军医大学实验动物中心提供，动物生产许可证号为：SCXK（Shaan）2019-001。实验中，每笼饲养5只小鼠，设置12 h交替的光照周期，湿度维持在40%~60%，并允许自由进食。所有实验动物的使用和处理方法均符合3R原则，并已获得空军军医大学动物伦理委员会的批准（伦理批准号：IACUC-20210196）。

实验中使用的主要仪器包括高通量转录组测序仪（Illumina）、Qubit荧光计（Invitrogen，Q32866）、微型旋涡混合（上海沪西，WH-3）仪、台式高速低温离心机（Thermo，Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R）、 PCR仪（Bio-Rad，T100™ Thermal Cycler）、电泳仪（北京六一，DYY-11）、生物电泳图像分析系统（复日，FR-980A）等。

苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（G1120，北京索莱宝科技有限公司）；兔抗人CDH4多克隆抗体（bs-11196R，北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗人SLC38A1多克隆抗体（bs-19825R，北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗人SLC38A4多克隆抗体（bs-21277R，北京博奥森生物技术有限公司）；α-SMA鼠源单克隆抗体（GB111364-100，武汉赛维尔生物科技有限公司）；FITC标记羊抗兔IgG（A0562，碧云天生物技术有限公司）；Cy3标记羊抗鼠IgG（A0521，碧云天生物技术有限公司）；DAPI封片剂（C0060，北京索莱宝科技有限公司）。其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2 分组以及处理

10只小鼠分为青年组和老年组，每组5只。老年组小鼠经过20个月饲养，青年组小鼠在领回后进行7 d的适应性喂养。除年龄外，所有小鼠的饲养条件（包括饮食、水源、光照和湿度）保持一致。所有小鼠均在同一天通过过量腹腔注射戊巴比妥钠实施安乐死，然后使用4 ℃的焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的PBS进行5~10 min心脏灌注。采样时将整个心脏取出并进行匀浆，不区分具体部位。样品取出后立即使用液氮速冻，并存放于-80 ℃冰箱中。

1.3 转录组测序步骤及样本数据质量汇总统计

转录组测序包括以下步骤：RNA提取、样本检测、文库构建、文库质控和上机测序。使用Illumina高通量测序仪获得的原始图像数据文件经过碱基识别分析，转化为原始测序序列。为确保分析质量，去除了带接头的、低质量（碱基质量值≤25的碱基数占序列60%以上）和不确定碱基信息超过5%的序列，以获得适合后续分析的数据。

1.3.1 差异表达基因的筛选

本研究对每组的生物学重复样本进行了基于基因表达水平的聚类分析和DESeq2统计检验，以分析基因的差异表达。考虑到转录组测序涉及大量独立的统计假设检验，可能导致假阳性率升高，因此对原始假设得到的P值进行了校正。组间比较的显著性标准为校正后P<0.05且|log₂（fold change）|>1。研究结果列出差异最显著的前10个上调或下调的基因。

1.3.2 差异基因的KEGG通路注释

为深入理解年龄对小鼠心肌组织代谢及信号传导路径的影响，采用京都基因与基因组百科全书（KEGG，http：//www.genome.jp/kegg/）数据库进行分析。以参考基因组为背景，应用Fisher精确检验对不同通路中基因的富集情况进行显著性分析。特别地，本研究筛选出富集程度最显著的前20个通路，并在散点图中进行展示。通路的KEGG富集程度通过富集因子、校正后的P值（FDR）以及富集到特定通路的基因数量进行衡量，通常校正后P<0.05认为通路富集显著。

1.4 采用苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠心肌组织形态结构变化

小鼠处死后，迅速剖取心脏并用生理盐水彻底冲洗血液，然后分离出心室肌组织，剪成约0.5 cm³的小块并立即置于4%多聚甲醛固定24 h。固定后的组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，并用石蜡切片机制备5 μm厚切片，贴在载玻片上后于60 ℃烘片1 h。随后对切片进行二甲苯脱蜡及乙醇复水，苏木精染色3~5 min，经1%盐酸酒精分化后自来水返蓝，再以伊红染色15 s。在流水下冲洗后，切片经梯度乙醇快速脱水、二甲苯透明，最后以中性树胶封片。完成上述步骤后，用奥林巴斯VS200研究级全自动切片全景扫描仪扫描记录。为定量评估衰老过程中心肌细胞的形态学改变，本研究后续将利用扫描图像，主要对心肌细胞的横截面积和周长两项指标进行测量与分析，以期客观反映心肌细胞肥大的程度。每组选取3只小鼠，HE染色后对心肌细胞横截面的周长及横截面积进行测量，免疫荧光染色后对目标区域的荧光强度进行定量分析。

1.5 采用免疫荧光双重标记技术检测α-SMA与CDH4、SLC38A1及SLC38A4在心肌组织中的共定位

石蜡包埋组织切片先用二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水至蒸馏水。随后在3%柠檬酸抗原修复液中进行高温修复（95 ℃，20 min），室温自然冷却后用PBS冲洗。组织切片用5% BSA封闭液在室温下封闭30 min，以减少非特异性结合。随后，分别使用抗CDH4、抗SLC38A1、抗SLC38A4及抗α-SMA抗体作为一抗，按说明书推荐稀释度稀释后加入切片，于4 ℃孵育过夜。次日，PBS洗涤3次，每次5 min，然后加入适合的二抗，如FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，避光孵育1 h。二抗孵育完毕后，再用PBS洗涤3次，滴加DAPI封片剂封片。最后，在荧光显微镜下分别观察SLC38A1/α-SMA、SLC38A4/α-SMA及CDH4/α-SMA的免疫荧光信号，并使用奥林巴斯VS200研究级全自动切片全景扫描仪对切片上的荧光信号进行全景扫描，获取高分辨率的荧光图像。

1.6 统计学分析

所有数据均通过ImageJ软件进行测量和分析。统计结果以均值±标准差（X±S）表示。两组间的比较采用独立样本t检验，由GraphPad Prism 8.0统计软件完成分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 转录组测序数据质量评估与各样本统计结果汇总

表1详细展示了各样本的测序数据质量统计，包括下机原始数据量、数据过滤后的剩余数据量、剩余数据的总序列长度（以Gb为单位）、以及碱基质量得分Q20和Q30的百分比。Q20和Q30分别表示碱基质量分数大于20和30的碱基所占的百分比，是评估测序质量的重要指标。此外，表中还列出了每个样本碱基G和C的数量占总碱基数量的百分比（GC含量）。从表1中可以看出，所有样本在数据过滤后均保持了较低的错误率，Q20和Q30的值均较高，显示数据的高质量。这些高质量的数据确保了后续分析的可靠性。

2.2 老年和青年小鼠心肌差异表达基因的筛选与统计分析

在转录组测序分析中，老年组和青年组小鼠心肌组织间呈现出显著的基因表达差异。具体而言，与青年组相比，老年组小鼠共有499个基因表达上调，138个基因表达下调。这些差异表达的基因可能与老化相关的生理和病理过程密切相关。为了更详细地了解这些变化，根据校正后的P值，各列出了上调和下调最显著的10个基因（见表2和表3）。

2.3 差异表达基因的KEGG通路富集分析

根据校正后P值从小到大展示出排序前20的富集通路的气泡图（见图1）。共有3条通路在本次转录组测序中被显著富集（校正后P<0.05）：补体途径和凝血级联反应（complement and coagulation cascades）、细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）和细胞因子与细胞因子受体和病毒蛋白间的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）。

2.4 HE染色检测两组小鼠心肌细胞横截面积和周长的差异

HE染色结果显示，总体上，老年组心肌细胞的横截面积较青年组显著增大（P<0.05），周长也有增加趋势（P=0.084），虽然未达统计学显著，但仍提示心肌细胞外形尺寸有增加趋势（见图2）。形态学和量化结果共同表明，老年组心脏可能发生了以心肌细胞肥大为主要特征的结构性重塑。

2.5 免疫荧光双标检测CDH4、SLC38A1、SLC38A4与α-SMA在心肌组织中的共定位表达

青年组小鼠心脏组织中CDH4、SLC38A1及SLC38A4蛋白可见表达，α-SMA绿色荧光信号较弱，与3种蛋白的共定位区域较少；老年组心脏组织中，α-SMA绿色荧光信号显著增强，分布更为广泛，且与CDH4、SLC38A1的共定位区域明显增多（见 图3）。

荧光强度量化分析表明，老年组α-SMA表达显著高于青年组（P<0.001）；CDH4在老年组呈升高趋势（P=0.069 7），SLC38A1表达呈下降趋势（P=0.076 3），SLC38A4在两组间无显著差异（见图3）。

3 讨论

心脏衰老是多因素共同驱动的复杂过程，既往研究表明，其主要涉及线粒体功能障碍、活性氧（ROS）积累、细胞外基质重塑及钙稳态失调等关键环节，这些变化最终促进心力衰竭等心血管疾病进展^［10-12］。不过，老年心肌组织的具体分子特征及其对心功能的深层影响机制尚未完全阐明。本研究借助转录组学测序系统描述了衰老小鼠心肌组织的基因表达和通路重塑模式，揭示了其多层次的分子改建与结构变化。

转录组结果显示，老年小鼠心肌组织中共鉴定出499个上调基因和138个下调基因，主要涉及离子通道、细胞间黏附、免疫补体反应、能量及氨基酸代谢等多个层面。KEGG富集分析进一步证实，补体与凝血级联反应、细胞因子受体相互作用，以及IL-17和趋化因子等多条炎症信号和代谢相关通路在衰老心肌中显著异常活化。组织学及免疫荧光检测亦证实，老年心肌中成纤维细胞活化增多，结构重塑显著，反映了细胞和组织水平的同步变化。

在显著上调的基因中，Ano5基因变化最为突出，表明衰老心肌离子稳态调控发生了深刻重塑。已有文献证实，由该基因编码的蛋白在心脏中的主要作用包括：维持心脏结构（如主动脉根部）的完整性，参与心肌细胞膜的损伤修复以抑制病理性纤维化，并可能通过存在性别差异的机制来调控心脏对应激的代偿反应^［13-15］。Ighg2c及C3等免疫相关基因的上调，提示炎症和免疫激活在衰老心肌中扮演核心角色^{［16，17］}。慢性低度炎症已被视为心脏衰老和纤维化、心力衰竭等疾病发生的重要推动力，补体系统的活化或可加剧组织损伤与重塑^{［18，19］}。Cdh4、Cdh22等钙黏蛋白家族成员基因的表达升高，揭示细胞间黏附及结构调控机制的重新编程，而Prkcq和Ric3等信号转导与神经调控基因的变化，则反映衰老心脏电生理和神经调节环境的复杂变化。诸如Scn4b、Amy1、Dbp等基因表达的调节，也指向能量代谢和昼夜节律等生物过程在老化心肌中的重要作用^［20-22］。

下调基因中，Slc38a1和Slc38a4的下降反映了氨基酸转运及代谢通路的障碍。Slc38a1基因编码的钠耦合中性氨基酸转运蛋白1主要负责谷氨酰胺等氨基酸摄取，其表达降低不仅可能削弱心肌细胞的抗氧化应激能力，还可能导致能量和代谢失衡，加速心肌功能衰退^［23］。值得注意的是，该蛋白下调现象在多种组织及物种的衰老中普遍存在，其在心脏的具体分子机制尚待深入探究。其他如Ddc和Impa2基因下调涉及神经递质合成及信号通路调节，提示心脏自主神经调控能力下降^{［24，25］}。自噬调控因子Zkscan3和昼夜节律核心组分Cry1等功能基因的表达失调，共同加剧了细胞稳态的失衡^{［25，26］}。神经元相关基因Nrep、Rtn4r、Grip2、Tmem35a的下调，则反映了心脏神经调控网络及自主功能的减弱^［27-30］。总体来看，衰老伴随了离子与信号调控、免疫炎症、能量代谢、氨基酸转运、自噬及神经调节等多层级差异基因网络的重塑。

KEGG富集分析补充了上述分子机制层面的发现。补体和凝血级联反应的增强进一步提示衰老心肌局部免疫激活及炎症反应加剧，这有助于理解心肌间质纤维化和结构异常扩展的机制。细胞因子信号、IL-17及趋化因子等炎症通路的异常亦高度吻合慢性炎症微环境在衰老心脏中的核心地位^［31-33］。氨基酸和矿物质代谢等通路的改变，则强调了能量与物质基础代谢的深刻重塑；而C型凝集素受体、JAK-STAT信号通路等的富集，提示信号转导紊乱同样参与了心脏组织结构和功能的动态调节^［34-36］。

本研究结合转录组学和组织病理学检测，重点选择了Cdh4、Slc38a1、Slc38a4基因所编码的蛋白：钙黏蛋白-4（R-cadherin或称为CDH4）、钠耦合中性氨基酸转运蛋白1（SLC38A1或称为SNAT1）和钠耦合中性氨基酸转运蛋白4（SLC38A4或称为SNAT4）进行免疫荧光验证。这三者覆盖了心脏衰老中的结构重塑、氨基酸代谢及能量转运等核心机制，且抗体资源丰富，便于特异性验证。实验结果显示，老年心肌α-SMA表达及其与CDH4、SLC38A1共定位明显增加，提示成纤维细胞的活化和间质重塑系衰老心脏病理变化的显著特征。CDH4蛋白调控细胞间黏附及结构稳定，对心脏纤维化极为重要^{［37，38］}；SLC38A1及SLC38A4蛋白则保障氨基酸转运和代谢稳态，对抗氧化能力及细胞功能有重要支持作用^{［39，40］}。

尽管本研究系统揭示了衰老心肌在转录与结构层面的重塑，仍存在若干局限性。首先，本研究未直接测量心室壁厚度等心脏功能与结构的关键生理指标，因此相关结论主要基于细胞与组织水平的观察。其次，样本量有限，可能影响统计效能和普适性。此外，动物模型与人类心肌衰老在分子机制上具有一定差异，部分结果需谨慎外推。最后，对于关键分子的具体功能机制缺乏深入实验验证，如SLC38A1蛋白在成纤维细胞及心肌纤维化过程中的作用仍需进一步探讨。未来应扩大样本量、引入多时间点动态分析，并开展分子水平的机制实验，以全面厘清衰老心肌的分子网络与致病过程。

综上，本研究从转录组、病理组织学与分子定位等多个维度，研究心脏衰老过程中的分子重塑及结构异常。上述结果不仅丰富了心衰等老年性心血管疾病的发病基础认知，也为未来干预措施和靶点筛选提供参考。但心脏衰老的分子网络错综复杂，相关机制及其交互作用尚需更加深入和系统的阐释。

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基金资助

陕西省自然科学基础研究计划项目(2021JQ-349)

陕西省自然科学基础研究计划面上项目(2021JM-082)