黄芪甲苷通过调控自噬抑制肝星状细胞活化

Astragaloside Ⅳ suppresses fibrogenesis by down⁃regulating autophagy-related proteins in hepatic stellate cells

摘要

目的 探讨黄芪甲苷（AS-Ⅳ）对肝星状细胞（HSCs）自噬和活化的影响及其机制。 方法 体外培养HSC-T6细胞，采用血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）刺激HSC-T6细胞活化以建立肝纤维化（HF）模型。通过检测纤维化标志蛋白（α-SMA和α1-Collagen）的过表达来认定HF模型构建成功。将HSC-T6细胞分为5组：control组、HF组、HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L组、HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组，筛选AS-Ⅳ干预的最佳浓度。为探讨AS-Ⅳ对HSC-T6细胞自噬水平的影响，将HSC-T6细胞分为：control组、HF组、HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）组；为进一步探讨自噬激活对AS-Ⅳ抗纤维化作用的影响，将HSC-T6细胞分为：control组、HF组、HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）组、HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）+雷帕霉素（RAPA）组。采用qRT-PCR检测炎症因子TNF-α、TGF-β1的mRNA表达水平，Western blot检测纤维化相关蛋白（α-SMA、α1-Collagen）及自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ、Beclin-1）的表达。 结果 与control组相比，HF组TNF-α和TGF-β1的mRNA水平、α-SMA和α1-Collagen表达均显著增加（P<0.001）。与HF组相比，HF+AS-Ⅳ组（20，30，40 μmol/L）TNF-α和TGF-β1的mRNA水平均显著降低（P<0.001），α-SMA和α1-Collagen蛋白的表达水平均显著下降（P<0.05），尤其40 μmol/L时抑制作用最为显著（P<0.000 1）。与HF组相比，HF+AS-Ⅳ组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达均显著降低（P<0.05）；与HF+AS-Ⅳ组相比，HF+AS-Ⅳ+RAPA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1、α-SMA和α1-Collagen、TNF-α和TGF-β1均明显上调（P<0.05）。 结论 AS-Ⅳ可能通过下调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达，抑制HSCs的活化，进而改善肝纤维化。

Abstract

Objective To investigate the effects of Astragaloside Ⅳ（AS-Ⅳ） on autophagy and activation of hepatic stellate cells（HSCs） and its underlying mechanisms. Methods HSC-T6 cells were cultured in vitro and stimulated with platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB） to establish a liver fibrosis（HF） model. The successful establishment of HF model was confirmed by the overexpression of fibrosis markers（α-SMA and α1-Collagen）. To determine the optimal concentration of AS-Ⅳ intervention， HSC-T6 cells were divided into five groups： control group， HF group， HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L group， HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L group， and HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L group. To investigate the effect of AS-Ⅳ on autophagy， HSC-T6 cells were divided into three groups： control group， HF group， and HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L） group. To explore the impact of autophagy activation on the anti-fibrotic effect of AS-Ⅳ， HSC-T6 cells were divided into four groups： control group， HF group， HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L） group， and HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）+ Rapamycin（RAPA） group. The mRNA expression levels of inflammatory factors TNF-α and TGF-β1 were detected by qRT-PCR， and the protein expressions of fibrosis-related markers（α-SMA， α1-Collagen） and autophagy-related markers（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ， Beclin-1） were analyzed by Western blot. Results Compared to control group， the mRNA levels of TNF-α and TGF-β1 were significantly increased， and the protein expressions of α-SMA and α1-Collagen were alao increased（P<0.001）. Compared to HF group， the mRNA levels of TNF-α and TGF-β1 were significantly decreased in HF+AS-Ⅳ（20， 30， 40 μmol/L） groups（P<0.001）， and the expressions of α-SMA and α1-Collagen were significantly reduced（P<0.05）， especially in HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L） group（P<0.000 1）. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and the expression of Beclin-1 were significantly lower in HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L） group than in HF group（P<0.05）. Compared to HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L） group， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio， and the expressions of Beclin-1， α-SMA， α1-Collagen， TNF-α and TGF-β1 were up-regulated in HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）+RAPA group（P<0.05）. Conclusion AS-Ⅳ may inhibit the activation of HSCs and improve the liver fibrosis by down-regulating the expressions of autophagy-related proteins LC3-Ⅱ and Beclin-1.

Graphical abstract

关键词

黄芪甲苷 / 肝星状细胞 / 自噬 / 肝纤维化 / 炎症因子 / 雷帕霉素

Key words

Astragaloside Ⅳ / hepatic stellate cells / autophagy / hepatic fibrosis / inflammatory factors / Rapamycin

肝纤维化（hepatic fibrosis， HF）是慢性肝病进展中的核心病理过程，其特征表现为肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSCs）的异常活化及细胞外基质过度沉积^［1，2］。抑制HSCs活化被认为是防治肝纤维化的核心策略。近年来，研究发现自噬在HSCs活化中发挥关键作用，其既可通过降解脂滴为HSCs活化提供能量^［2，3］，还可通过AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR等信号通路促进纤维化进程^［4，5］。然而，现有自噬抑制剂靶向性差、副作用显著，限制了其临床应用。因此，探索能够温和调控HSCs自噬的天然药物，已成为抗肝纤维化研究的热点。

黄芪甲苷（Astragaloside Ⅳ， AS-Ⅳ）是黄芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化及抗纤维化等多种药理作用^［6，7］。既往研究发现，AS-Ⅳ可通过抑制内质网应激和TGF-β1信号通路减轻肾间质纤维化^［6］，提示其具有抗纤维化潜力。值得注意的是，AS-Ⅳ能够通过AMPK/mTOR通路介导的自噬改善视神经损伤^［8］，并可下调LC3、Beclin-1等自噬相关蛋白调节脂质代谢^［9，10］。在肝脏疾病方面，AS-Ⅳ能降低CCl₄诱导的肝纤维化模型的炎症和胶原沉积^［11］。与其他中药单体（如姜黄素、小檗碱）相比，AS-Ⅳ具有多靶点、低毒性等优势^［4，12］，但其是否通过调控自噬抑制HSCs活化，发挥抗肝纤维化作用，尚不明确。

本研究以大鼠HSC-T6细胞为体外模型，采用血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB， PDGF-BB）诱导其活化，观察AS-Ⅳ对自噬水平、炎症因子及纤维化相关蛋白的影响，并联合自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）探讨其作用机制，为开发靶向自噬的抗肝纤维化天然药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系

本研究采用大鼠肝星状细胞系HSC-T6作为体外实验模型，细胞购自上海富衡生物科技有限公司（货号：FH0402）。细胞培养至第3代后开始使用，所有实验用细胞代数均控制在20代以下。

1.2 主要仪器与试剂

5415R型离心机（德国Eppendorf公司）；Fresco低温冷冻离心机、MultiSkan3酶标仪（美国Thermo公司）；C1000型PCR仪、1645052型电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Mini P-4电泳槽、MP3035型湿转电泳槽（北京凯元信瑞仪器有限公司）；7500型实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；OI-X6Touch型化学发光成像仪（广州光仪生物科技有限公司）。

蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒、5×还原样品缓冲液、10×TBST pH 8.0、彩虹180广谱蛋白Marker（15-130KD）均购自天德瑞（北京）生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自德国Roche公司；NC膜（0.45 μm孔径）、ECL化学发光检测试剂盒购自德国Millipore公司；GAPDH鼠单抗、α-SMA鼠抗、α1-Collagen兔抗、LC3-Ⅱ兔抗、Beclin-1兔抗均购自美国Immunoway公司； HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）购自天德悦（北京）生物科技有限责任公司；SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅱ反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；总RNA提取试剂盒购自新赛美（中国）生物科技有限公司；脱脂奶粉购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司；引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.3 细胞培养

解冻HSC-T6细胞，离心后重悬于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM完全培养基中，接种于培养皿，采用“8字形旋转法”使细胞均匀分布。于37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下培养，每48 h换液，待细胞融合至80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。为了研究AS-Ⅳ的影响，取对数生长期的HSC-T6细胞，以4×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，于37 ℃、5% CO₂条件下继续培养24 h，待完全贴壁后进行药物干预。处理完成后收集细胞，提取RNA和蛋白质，用于后续分析。

1.4 模型构建、分组及处理

为了研究AS-Ⅳ对HSC-T6细胞活化的影响，将HSC-T6细胞分为control组、肝纤维化（HF）组、HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L组、HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组。control组细胞不做处理；HF组经10 ng/mL PDGF-BB刺激HSC-T6细胞12 h以诱导肝纤维化^［13］；HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L组、HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组在HF组基础上，分别使用不同浓度AS-Ⅳ（20，30，40 μmol/L）处理48 h。采用qRT-PCR和Western blot分别检测炎症因子（TNF-α、TGF-β1）mRNA及纤维化相关蛋白（α-SMA、α1-Collagen）的表达水平。

为了进一步研究AS-Ⅳ对HSC-T6细胞自噬水平的影响，将HSC-T6细胞分为control组、HF组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组。各组处理同上。通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1的表达。

为了研究自噬激活对AS-Ⅳ抗纤维化作用的影响，将HSC-T6细胞分为control组、HF组、HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）组和HF+AS-Ⅳ（40 μmol/L）+雷帕霉素（RAPA）组。control组、HF组和HF+AS-Ⅳ组处理同上；HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L +RAPA组在HF组基础上，使用40 μmol/L AS-Ⅳ联合100 nmol/L RAPA处理48 h。然后采用qRT-PCR和Western blot检测炎症因子（TNF-α、TGF-β1）mRNA、纤维化（α-SMA、α1-Collagen）及自噬（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1）相关蛋白的表达。

1.5 qRT-PCR检测TNF-α和TGF-β1的mRNA表达

按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA。随后配制qPCR反应体系进行荧光定量PCR扩增。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40次；溶解曲线采用仪器默认设置进行分析。以β-actin作为参考基因进行标准化。通过分析扩增后获得的Ct值，使用2^-ΔΔCt 方法计算目标基因的相对表达量。相关引物序列见表1。

1.6 Western blot检测纤维化及自噬相关蛋白的表达

control组、HF组、HF+AS-Ⅳ组和HF+AS-Ⅳ+ RAPA组细胞团通过离心收集，并在冰上使用裂解缓冲液裂解30 min提取总蛋白。采用BCA法对蛋白浓度进行定量测定，按比例加入SDS样品缓冲液，95 ℃煮沸变性15 min。随后通过SDS-PAGE电泳分离蛋白组分并转印至NC膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，随后分别孵育特异性一抗：α-SMA（1∶40 000）、α1-Collagen（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000），于4 ℃摇床孵育过夜。次日，TBST洗膜，室温下与HRP标记的二抗（1∶10 000）孵育2 h。最后，通过ECL化学发光显色蛋白条带，并使用ImageJ软件定量分析目标蛋白灰度值。

1.7 统计学分析

使用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（X±S）表示。对于正态分布且方差齐性的数据采用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。运用Graphpad Prism 8.0绘制统计图表，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-Ⅳ对HSC-T6细胞活化、纤维化及炎症因子表达的影响

qRT-PCR结果显示，与control组相比，HF组TNF-α和TGF-β1的mRNA表达水平显著升高（P<0.001）；与HF组相比，HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L组、HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组TNF-α和TGF-β1的mRNA表达均显著下降（P<0.01），其中40 μmol/L时抑制作用最为显著（P<0.001，见图1）。Western blot结果显示，与control组相比，HF组中α- SMA和α1-Collagen蛋白表达水平显著增加（P<0.000 1）；与HF组相比，HF+AS-Ⅳ 20 μmol/L组、HF+AS-Ⅳ 30 μmol/L组和HF+AS-Ⅳ 40 μmol/L组α-SMA和α1- Collagen蛋白的表达水平均显著下降（P<0.05），其中40 μmol/L时抑制作用最为显著（P<0.000 1，见图1）。

2.2 AS-Ⅳ对HSC-T6细胞自噬水平的影响

与control组相比，HF组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达均显著升高（P<0.01）；与HF组相比，HF+AS-Ⅳ组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1的表达水平显著下调（P<0.05，见图2）。

2.3 自噬激活对AS-Ⅳ抗纤维化作用的影响

与HF+AS-Ⅳ组相比，HF+AS-Ⅳ+RAPA组中TNF-α和TGF-β1的mRNA表达水平显著上升（P<0.01，见图3），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05），α-SMA和α1-Collagen的表达也明显增加（P<0.01，见图4）。

3 讨论

肝纤维化是多种致病因素（包括嗜肝病毒感染、酒精滥用、药物及毒物暴露等）引发的慢性肝病共同病理进程。其中，HSCs的异常活化是肝纤维化发生发展的核心环节，抑制HSCs活化已成为抗肝纤维化药物研究的重要靶点^［2，14］。

研究发现，活化的HSCs转化为肌成纤维细胞的过程中伴随着α-SMA的显著升高^［15-17］，该分子不仅是HSCs活化的关键标志物^{［18，19］}，也与肝纤维化的进展及预后密切相关^{［20，21］}。此外，活化的HSCs能够分泌α1-Collagen，抑制其表达可诱导HSCs发生凋亡^{［16，22］}。本研究结果显示，PDGF-BB可显著诱导HSC-T6细胞活化，伴随α-SMA和α1-Collagen的过表达以及炎症因子TNF-α、TGF-β1的升高，而AS-Ⅳ可显著抑制上述变化，提示其在体外具有显著的抗纤维化作用，这一结论与既往研究一致^［6］。

自噬与HSCs的异常活化密切相关。研究发现，自噬可通过降解脂滴为HSCs活化提供能量^［23］。在纤维化肝组织及活化的HSCs中，自噬水平显著升高，并通过促进HSCs的增殖和分化加速肝纤维化进程^［3］。靶向抑制HSCs的自噬可有效阻止其活化状态^［24］，并显著减轻肝纤维化程度^［25］。本研究结果发现，肝纤维化模型组自噬蛋白（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1）表达增加，同时伴随着炎症因子TNF-α、TGF-β1的过表达，提示自噬参与了肝纤维化进程。因此，选择性调控HSCs自噬是治疗肝纤维化的潜在策略^{［25，26］}。本研究通过体外模型探讨了AS-Ⅳ抗肝纤维化的作用机制。结果发现，AS-Ⅳ可通过抑制自噬显著降低炎症因子TNF-α、TGF-β1和纤维化标志物α-SMA、α1-Collagen的表达。这一结论与既往Wu等^［7］研究成果一致。该研究发现AS-Ⅳ可通过调节肠道菌群与NLRP3/Caspase-1信号通路，下调血清和肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6的炎症因子的表达，进而改善肝损伤^［7］。

此外，本研究联合自噬激活剂RAPA部分逆转了AS-Ⅳ对自噬及纤维化的抑制作用，进一步证实AS-Ⅳ可能通过抑制自噬途径，抑制HSCs活化和炎症反应，从而改善肝纤维化。这一结论与Li等^［27］的研究结果类似，其发现AS-Ⅳ可通过上调醛脱氢酶2（ALDH2）表达，抑制AKT/mTOR信号通路介导的自噬，并下调自噬关键蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达，从而改善肾纤维化。本研究结果与这一发现类似，均提示AS-Ⅳ在不同器官纤维化中的保护作用可能与其抑制过度自噬的机制相关。新近研究发现AS-Ⅳ可通过Akt/mTOR通路调节代谢相关脂肪肝的肝细胞自噬^［28］，而Akt/mTOR通路是HSCs自噬调控的关键通路^［27］。通过调节这一通路，AS-Ⅳ可能抑制HSCs的过度自噬，减缓纤维化的进展。因此，AS-Ⅳ通过自噬途径在肝脏疾病中的潜在治疗作用值得进一步深入研究。

本研究仍存在一定局限性。首先，实验基于体外细胞模型，未能充分反映复杂的体内微环境，因而结果的普适性仍需动物实验或临床样本进一步验证；其次，本研究虽发现AS-Ⅳ可通过抑制自噬抑制HSCs活化，但其上游信号通路（如AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR）的具体作用尚未阐明，需要进一步利用基因干预或特异性通路抑制剂进行验证。此外，AS-Ⅳ的长期安全性和临床剂量窗口尚不明确，仍需更多系统性研究支持。未来应在动物模型和临床前研究中继续完善其疗效和机制研究，为其在肝纤维化治疗中的转化应用奠定基础。

综上所述，本研究发现AS-Ⅳ可能通过抑制自噬过程，降低HSCs活化、纤维化及炎症反应，从而发挥抗肝纤维化作用。本研究为AS-Ⅳ作为潜在抗肝纤维化药物提供了新证据，也提示自噬通路可能是治疗的重要靶点。

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基金资助

山西省卫生健康委员会科研课题(2023018)