心脏代谢蛋白与颅内动脉瘤的因果关系及免疫的中介作用

Causality of cardiometabolic proteins with intracranial aneurysms and the mediating role of immunity

摘要

目的 采用孟德尔随机化（MR）分析心脏代谢蛋白、免疫和颅内动脉瘤（IA）三者间的因果关系，并结合中介分析来探讨免疫在心脏代谢蛋白和IA之间的中介效应。 方法 从IEU开放全基因组关联研究（GWAS）数据库获取257种心脏代谢蛋白的统计数据、从GWAS Catalog数据库获取731种免疫细胞表型的统计数据，同时从FinnGen数据库中获取IA的统计数据，首先采用两样本MR分别鉴定心脏代谢蛋白和免疫细胞表型与IA的因果关系。在确立了与IA具有因果关系的心脏代谢蛋白和免疫细胞表型后，借助MR进一步分析心脏代谢蛋白与免疫细胞表型的因果关系。随后采用两步法中介分析确立免疫细胞表型在心脏代谢蛋白与IA因果关系中的中介效应。在每步分析中以逆方差加权法为主，结合多种MR方法及敏感性分析以确保结果的可靠性。 结果 有11种心脏代谢蛋白、41种免疫细胞表型分别与IA存在因果关系。进一步分析发现8种心脏代谢蛋白与19种免疫细胞表型存在因果关系。中介分析提示肿瘤坏死因子受体1和Versican核心蛋白均可通过降低CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比来降低IA风险；Versican核心蛋白还通过增加CD25在活化型调节T细胞上的表达水平来降低IA风险（中介比例=15.21%）；肺表面活性物质相关蛋白D则通过增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright 细胞占T细胞百分比（中介比例=66.17%）和前向散射光面积在人类白细胞抗原-DR同种型阳性CD4⁺细胞上的水平（中介比例=8.79%）来降低IA风险；节点调节因子1则通过增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright 细胞占T细胞百分比（中介比例=30.01%）、记忆B细胞占淋巴细胞百分比（中介比例=2.23%）、CD25在IgD⁺CD24⁺B细胞上的表达水平（中介比例=2.72%）和CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平（中介比例=4.26%）来降低IA的风险。 结论 免疫介导了心脏代谢蛋白对IA的部分因果效应。这进一步强化了“心-脑轴”的联系，并为IA的疾病预防及机制研究奠定了基础。

Abstract

Objective To investigate the causal relationships between cardiometabolic proteins， immunity， and intracranial aneurysm（IA） by Mendelian randomization（MR） analysis， and explore the mediating effect of immunity between cardiometabolic proteins and IA by mediator analysis. Methods Statistical data of 257 cardiometabolic proteins were obtained from the IEU open genome-wide association studies（GWAS） database， 731 immune cell phenotypes were retrieved from the GWAS Catalog database， and statistical data for IA were acquired from the FinnGen Database. Firstly， two-sample MR was employed to identify causal relationships between cardiometabolic proteins and IA， and between immune cell phenotypes and IA. After identifying cardiometabolic proteins and immune cell phenotypes causally related to IA， MR was further utilized to analyze the causal relationships between cardiometabolic proteins and immune cell phenotypes. Subsequently， a two-step mediation analysis was employed to establish the mediating effect of immune cell phenotypes in the causal relationship between cardiometabolic proteins and IA. The inverse-variance weighted method was used in each step of the analyses， and multiple MR methods and sensitivity analyses were used to ensure the reliability of the results. Results A total of 11 cardiometabolic proteins and 41 immune cell phenotypes showed causal relationships with IA. Further analyses revealed that 8 cardiometabolic proteins were causally associated with 19 immune cell phenotypes. Mediation analysis indicated that tumor necrosis factor receptor 1 and Versican core proteins reduced IA risk by decreasing both the percentage of CD4⁺CD^dim cells among lymphocytes and the percentage of CD4⁺CD^dim cells among leukocytes. Versican core proteins also reduced IA risk by increasing the expression level of CD25 on activated regulatory T cells（mediating effect=15.21%）. Pulmonary surfactant-associated protein D reduced IA risk by increasing the percentage of CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright cells among T cells（mediating effect=66.17%） and the forward scatter-area on human leukocyte antigen-DR⁺CD4⁺ cells（mediating effect=8.79%）. Nodal modulator 1 reduced IA risk by increasing the percentage of CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright cells among T cells（mediating effect=30.01%）， the percentage of memory B cells among lymphocytes（mediating effect=2.23%）， the expression level of CD25 on IgD⁺CD24⁺B cells（mediating effect=2.72%）， and the expression level of CD19 on IgD⁺CD3^bright B cells（mediating effect=4.26%）. Conclusion Immunity partially mediates the causal effects of cardiometabolic proteins on IA. This further strengthens the “heart-brain axis” link and lays the foundation for studies on disease prevention and mechanism of IA.

Graphical abstract

关键词

颅内动脉瘤 / 心脏代谢蛋白 / 免疫 / 孟德尔随机化 / 因果关系 / 中介 / 心-脑轴

Key words

intracranial aneurysm / cardiometabolic proteins / immunity / Mendelian randomization / causal relationship / mediation / heart-brain axis

颅内动脉瘤（intracerebral aneurysm， IA）是脑动脉壁局部异常膨出形成的血管病变，其破裂导致的蛛网膜下腔出血致死率高达50%^［1］。在我国，IA的患病率约为7%，其中约20%~30%为多发性动脉瘤，给患者带来极大的生命威胁，造成了沉重的社会负担^［2］。尽管外科手术可降低破裂风险，但IA的发病机制尚未完全阐明，尤其是遗传、代谢与免疫因素的交互作用仍不明确。研究发现，血流动力学异常和血管壁损伤重塑在IA的发病中占据了重要作用^［3］。但随着心-脑轴及免疫在IA中的作用逐渐被发现，心脏代谢异常对脑血管的影响及免疫介导的炎症通路可能为IA发生发展提供新的见解。

在心功能受损时，心脏代谢蛋白（如脂联素、生长因子及炎症因子等）的水平可能发生变化，进而发挥多种生物学效应^［4］。在心力衰竭后，S100b的水平升高，并且与严重程度密切相关，同时S100b会进一步启动包括核因子-κB在内的信号通路，激活氧化应激、炎症及细胞死亡从而加重损伤^［5，6］。同时，整合素β3可以通过调节雷帕霉素及胞外信号调节激酶通路来促进心肌细胞的增殖，进而减轻细胞凋亡^［7］。这些都提示了受心脏影响的蛋白组的复杂功能，包括免疫及炎症反应。此外，在IA破裂后的蛛网膜下腔出血中，先天免疫细胞（包括中性粒细胞、经典单核细胞、小胶质细胞和巨噬细胞）在早期即可发生浸润和激活，并且与神经元死亡和运动缺陷相关^［8］。在未破裂的IA中，中枢神经系统相关的巨噬细胞可以在瘤壁中积累，特异性耗竭巨噬细胞可以减少IA的形成和破裂风险^［9］。这些都提示了免疫在IA中的重要作用。然而，现有证据多基于观察性研究，难以建立心脏代谢蛋白组、免疫和IA的复杂因果联系。与传统的观察性研究相比，孟德尔随机化（Mendelian randomization， MR）基于全基因组关联研究（genome-wide association studies， GWAS）中单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）来建立因果推断。MR使用SNP作为工具变量（instrumental variable， IV），可以有效避免混杂因素和反向因果关系的干扰，提供更加可靠的因果推断^［10］。故本研究拟通过两样本MR与中介分析相结合，系统性地评估心脏代谢蛋白、免疫表型与IA的因果关系及中介模型，为IA的分子机制提供新见解。

1 材料与方法

1.1 研究设计

本研究所选的数据均来自于公开的数据集，这些数据已经获得了当地的伦理机构审查委员会的批准，因此无需额外的伦理批准。首先选取多个GWAS研究中的SNP作为IV，其次采用两样本MR分析探讨257种心脏循环代谢蛋白、731种免疫细胞表型与IA的因果关系，最后采用中介分析确定了免疫在心脏代谢蛋白和IA因果效应中的中介作用。MR分析需要保证3个核心假设：①所选的IV和暴露因素显著相关；②IV不能通过混杂因素影响结局；③所选的IV只能通过暴露影响结局^［11］。本研究参考STROBE-MR为标准进行分析^［12］。

1.2 数据来源

本研究数据均来自于欧洲人群。257种心脏代谢蛋白的统计数据来自于对克里特岛1 301名参与者的基因组DNA文库进行的测序，该研究获得了哈罗科皮奥大学机构审查委员会和希腊教育、终身学习和宗教事务部的批准，并获得了每位参与者的知情同意。作者在进行严格的质量控制后，保留了257种心脏代谢相关的蛋白质测量数据^［13］。完整的统计数据来源于IEU open GWAS数据库，其记录编号为ebi-a-GCST90010102~ebi-a-GCST90010358（https：// gwas.mrcieu.ac.uk/）。

免疫细胞表型的统计数据来自对3 757名撒丁岛个体的GWAS研究，所有参与者均签署了知情同意书，同意接受经撒丁岛地区伦理委员会批准的研究方案（方案编号2171/CE）。GWAS Catalog数据库提供了对应的完整数据，其记录编号为GCST0001391-GCST0002121（https：//www.ebi.ac.uk/gwas/home），涵盖731个细胞表型，包括调节性T细胞，成熟T细胞，T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（T cell， B cell and natural killer cell， TBNK），经典树突状细胞（conventional dendritic cell， cDC），B细胞，单核细胞，骨髓细胞^［14］。

IA的统计数据来自于FinnGen R12版本（诊断编码为ICD-10：I67.1； ICD-9：4373），其包括457 138名参与者，其中有3 310名患者，453 828健康对照者（https：//r12.finngen.fi/）。由于以上数据来自于不同的队列研究，因此不存在样本重叠。

1.3 工具变量的选择

本研究严格根据MR的3个核心假设来筛选IV。首先，为了保证假设①，将P值阈值设定为1×10^-5以获得合适的SNP数量并尽可能地准确估计因果效应，同时在每次分析中剔除连锁不平衡的IV（遗传距离=10 000 kb和r²<0.001）^［15］。随后，计算F统计量来衡量IV的强度：F=［R²（n-1-k）］/［（1-R²）k］，排除F<10的IV^［16］。此外，将具有回文结构的SNP剔除，以确保整个分析过程的完整性。其次，为了去除混杂效应以保证假设②，通过LD link（https：//ldlink.nih.gov/）来寻找与吸烟、饮酒、BMI及血压相关的SNP并进行排除。最后，剔除P_结局<P_暴露的IV以保证假设③。

1.4 统计及敏感性分析

为了保证分析的准确性，本研究以逆方差加权法（inverse variance weighted， IVW）为主要方法，辅以MR Egger、加权中位数、简单模型、加权模型和最大似然比来共同分析暴露与结局的因果关系^［17］。采用多种敏感性分析方法确保结果的准确性。首先，Cochran′s Q检验（包括MR Egger和IVW）用于确定异质性的存在^［18］；MR Egger截距检验和MR-PRESSO Global检验用于检测结果的水平多效性；当异质性和多效性结果的P>0.05时，表明因果分析结果稳健^［19］。其次，使用Steiger检验用于再次确认当前因果关系方向的正确性，P<0.05代表正确的因果方向。随后，如果存在异质性，则采用随机效应模型IVW法；否则，采用固定效应模型IVW法。如果存在水平多效性，且无法检测到异常值，则认为当前的因果关系不可靠。为确保分析的可靠性，只有当P_IVW<0.05，6种MR分析方法的β值有相同的方向，同时敏感性分析未提示异常时才认为因果关系存在^［20］。当IA作为结局时，使用比值比（odds ratio， OR）和95%CI表示暴露和IA之间的关联；当心脏代谢蛋白作为暴露而免疫细胞表型作为结局时，采用β和95%CI表示因果暴露和结局的关联。

1.5 中介分析

使用两步法评估免疫细胞表型在心脏代谢蛋白和IA因果关系中的中介效应^［21］。首先使用两样本MR分析分别获得与IA存在因果关系的心脏代谢蛋白和免疫细胞表型；其次在这些因素中，进一步以心脏代谢蛋白为暴露，免疫细胞表型为结局进行MR分析获得存在因果关系的蛋白与免疫细胞表型。β₁代表心脏代谢蛋白对免疫细胞表型的因果效应，而β₂则代表对应的免疫细胞表型对IA的因果效应，β₀则代表心脏代谢蛋白对IA的总体因果效应。中介效应为β₁×β₂，而中介效应比例为（β₁×β₂）/β₀。只有β₁×β₂和β₀的方向一致才认为中介模型成立。

所有的分析和可视化均通过R软件（版本4.3.0）完成。所用的R包包括“TwoSampleMR”“MR-PRESSO”“ggplot2”“MendelianRandomization”。在统计分析中，设定单侧检验水平为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏代谢蛋白与IA的因果关系

心脏代谢蛋白和IA的MR分析结果见表1和图1。在遵循3个核心假设及因果关系判定标准的基础上，一共发现了心脏代谢蛋白和IA的11种因果关系，所选IV的数目范围为9~20个，总数为143个，F值范围为19.97~457.36，表明了当前IV的可靠性。具体来说，抗酒石酸磷酸酶5型水平升高可以增加IA的风险，而血小板衍生生长因子亚基B水平、表皮生长因子B型受体4水平、肺表面活性物质相关蛋白D水平、肿瘤坏死因子受体1水平、DNA（嘌呤或嘧啶位点）裂解酶水平、整合素beta-7水平、节点调节因子1水平、非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1水平、丝裂蛋白B8水平和Versican核心蛋白水平均可降低IA的风险。

在敏感性分析中，Cochran′s Q检验及Egger截距检验均未见异常，表明当前结果不存在异质性及水平多效性；同时MR-PRESSO Global检验的P值均大于0.05，表明当前结果不存在离群值及多效性；Steiger检验进一步说明了当前因果关系方向的正确性（见表2）。

2.2 免疫细胞表型与IA的因果关系

经过严格的MR分析后，最初发现了42种免疫细胞表型与IA存在因果关系，所选IV的数目范围为6~25个，总数为673个，F值范围为19.55~703.06，表明当前结果不存在弱偏倚IV。6种MR方法的分析结果见图2。具体来说，有10种B细胞、4种cDC细胞、6种成熟阶段T细胞、1种单核细胞、1种骨髓细胞、12种TBNK细胞及8种调节性T细胞的表型与IA存在因果关系。在敏感性分析中，Egger截距检验提示NK细胞占淋巴细胞百分比与IA的因果关系存在显著的水平多效性（P=0.029），同时MR-PRESSO离群值检验未见明显异常（P=0.292），因此，此时的因果关系不成立。同时，Cochran′s Q检验提示CD45RA在静息型调节T细胞上的表达水平与IA的MR分析结果存在异质性（P=0.035），因此，使用随机效应模型IVW来表示当前结果。在剩余的MR分析结果中，均未见显著的异质性、多效性及离群值。Steiger检验进一步说明了当前因果关系方向的正确性（见表3）。

2.3 心脏代谢蛋白与免疫细胞表型的因果关系

在与IA存在因果关系的心脏代谢蛋白和免疫细胞表型中，以当前的心脏代谢蛋白为暴露，免疫细胞表型为结局进行MR分析。经过筛选后，所选IV的数目范围为4~17个，总数300个，F值均>10。如图3所示，血小板衍生生长因子亚基B水平与CD20在IgD⁺CD38^-初始B细胞上的表达水平成正比；肺表面活性物质相关蛋白D可以增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比，以及前向散射光面积（forward scatter-area， FSC-A）值在人类白细胞抗原-DR同种型阳性（human leukocyte antigen-DR⁺， HLA-DR⁺）CD4⁺细胞上的水平；肿瘤坏死因子受体1则降低了CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比；抗酒石酸磷酸酶5型增加了CD45在HLA-DR⁺CD8^bright细胞上的表达水平同时又降低了CD38在初始-成熟B细胞上的表达水平；整合素beta-7增加了CD3在中央记忆CD4⁺T细胞上的表达水平；节点调节因子1降低了FSC-A值在单核细胞上的水平同时又增加了CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright 细胞占T细胞百分比、记忆B细胞占淋巴细胞百分比、CD25在IgD⁺CD24⁺细胞上的表达水平与CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平；非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1则降低了CD45在HLA-DR⁺CD8^bright细胞上的表达水平；Versican核心蛋白增加了CD25在活化型调节T细胞上的表达水平，同时减少了CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比、CD4⁺CD8^dim占淋巴细胞百分比、CD24⁺CD27⁺细胞占淋巴细胞百分比及FSC-A值在单核细胞上的水平。

在敏感性分析中，Cochran′s Q检验提示肺表面活性物质相关蛋白D水平和FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平的MR结果存在异质性，因此使用随机效应模型IVW表示；在剩余的因果关系中，未见显著的异质性、多效性和离群值（见表4）。

2.4 免疫细胞表型的中介作用

分别获得β₁、β₂、和β₀后，建立中介模型（见图4），即在3个MR核心假设的基础上，当心脏代谢蛋白作为暴露时，免疫细胞表型作为中介因素介导了心脏代谢蛋白对IA的因果关系。CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比和FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平介导了肺表面活性物质相关蛋白D对IA的保护作用；CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比介导了肿瘤坏死因子受体1对IA的保护作用；CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比、记忆B细胞占淋巴细胞百分比、CD25在IgD⁺CD24⁺B细胞上的表达水平和CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平分别可以介导节点调节因子1对IA的保护作用；CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比、CD25在活化型调节T细胞上的表达水平和CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比则介导了Versican核心蛋白对IA的保护作用（见表5）。

3 讨论

越来越多的研究证实了“心-脑轴”的存在，心脏功能的变化能够显著影响神经系统疾病的发生。同时，免疫被认为是介导疾病联系的重要因素^{［22，23］}。然而尚未有研究报道心脏代谢因素和IA的潜在关联，同时由于现有研究的局限性，难以在大规模组学方面确立心脏代谢蛋白组、多种免疫细胞表型与IA的因果关系。MR可以有效减少混杂偏倚干扰，能够发现更可靠的因果关系^［24］。本研究首次系统性地将心脏代谢蛋白、免疫细胞表型与IA进行整合分析，并利用MR结合中介分析，构建了“心-免疫-脑轴”的因果模型。结果表明，部分心脏代谢蛋白能够通过特定免疫细胞表型的调控间接影响IA风险，从而揭示了免疫在心脏代谢蛋白与IA之间的关键中介作用。

随着研究的深入，免疫和动脉瘤的关系日渐受到重视。本研究发现CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比的增加均提升了IA的风险。尽管T细胞对于IA的确切关系尚不清楚，但其在动脉瘤病理过程中的重要性已被证实。近期研究发现组织浸润T细胞在人类腹主动脉瘤壁内会大量激活，其数量随着腹主动脉瘤的直径增大而增加^［25］。针对小鼠IA模型的研究表明T细胞对于动脉瘤的形成可能有重要作用，尤其是CD4⁺T细胞在IA壁中显著大量浸润，提示CD4⁺T细胞与IA存在密切关联^{［26，27］}。同时，活化的CD4⁺T细胞可介导强大的免疫效应。首先，其可以释放穿孔素和丝氨酸蛋白酶，导致靶细胞上形成孔状损伤，从而进一步激活半胱天冬酶3依赖的细胞凋亡^［28］。其次，CD4⁺T细胞不仅可以产生干扰素-γ和IL-17，而且还可以通过增加细胞毒性来诱发结肠炎的发生^［29］。此外，活化的CD4⁺T细胞能够增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达，使其与死亡受体5结合，进而诱导脑血管内皮细胞凋亡。在脑出血模型中，CD4⁺T细胞会加剧血肿周围水肿，进而诱发更为严重的神经炎症反应^［30］。这些功能提示了CD4⁺T细胞在炎症损伤及细胞死亡中具有促进作用。因此，CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞和淋巴细胞百分比的增加可能通过损伤血管壁来增加IA的风险。研究发现慢性肿瘤坏死因子暴露可通过其1型受体来抑制效应T细胞增殖及核因子-κB的激活，进而导致CD4⁺T细胞的功能障碍^［31］。而Versican核心蛋白是成纤维细胞和内皮细胞的有效激活剂，其可以增强心肌细胞增殖、减少纤维化并改善心脏功能，进而增加血管的稳定性^［32］。在富含Versican核心蛋白的培养物中，CD4⁺T细胞的增殖及迁移会受到显著抑制，这些发现都提示了肿瘤坏死因子受体1和Versican核心蛋白在抑制CD4⁺T细胞增殖方面的潜力^［33］。因此，肿瘤坏死因子受体1和Versican核心蛋白可以通过减少CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比，进而发挥血管保护的作用来降低IA的风险。另一方面，本研究发现Versican核心蛋白还可以通过增加CD25在活化型调节T细胞上的表达的水平来降低IA风险。据报道，CD25是IL-2R的α链，其可以与IL-2竞争结合受体，从而减少IL-2介导的免疫反应^［34］。此外，CD25水平升高可以增强调节性T细胞的功能，减少肿瘤坏死因子-α和IL-1β的水平来控制过度的炎症反应，进而减少血管壁的损伤来降低IA风险^［35］。因此，Versican核心蛋白可能通过抑制CD4⁺T细胞的过度活化，同时上调CD25的表达来降低IA的风险。尽管目前缺乏直接且充分的证据，但是Versican核心蛋白、免疫和IA的关系值得进一步深究。

肺表面活性物质相关蛋白D是一种由肺泡Ⅱ型细胞分泌的亲水性肺表面活性剂蛋白，其通过髓系细胞上的富含半胱氨酸区域与信号抑制调节蛋白α结合，进而触发Src同源区2结构域磷酸酶-1和2的募集，这两种蛋白酪氨酸磷酸酶可使参与促炎通路（包括核因子-κB）的关键信号分子去磷酸化，促进抗炎环境的形成，进而显著降低基质金属蛋白酶和炎性细胞因子的产生，发挥强大的抗炎作用^［36］。因此，肺表面活性物质相关蛋白D能够增强血管壁的稳定性，进而降低IA的风险。同时，本研究发现其能够增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比。CD28^-CD8^bright T细胞通常为经长期或反复抗原刺激后的终末分化亚群，其丧失共刺激分子CD28但高表达IL-2受体α链（CD25），这一表型既可代表成熟的效应T细胞，也可包含具有免疫抑制/调节功能并分泌IL-10的亚群，因而其在控制慢性或过度炎症中具有双重角色^［37］。研究发现肺表面活性物质相关蛋白D通过与抗原呈递细胞表面的受体结合^［38］，重编程抗原呈递细胞的共刺激分子表达与细胞因子分泌谱（包括IL-12/IL-10的平衡以及IL-2），从而增强或延长抗原呈递并驱动CD8⁺细胞向终末/效应样（CD28^-、高CD25、CD8⁺）分化富集^{［37，39］}。因此，肺表面活性物质相关蛋白D可能通过增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比来降低IA风险。此外，FSC-A代表细胞前向散射光强度，反映了细胞体积大小。FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平升高反映了CD4⁺T细胞的低活化状态，提示其处于较低的炎症和氧化应激水平^［40］。因此，FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平升高可以减少血管壁的损伤而降低IA的风险。一项研究表明，经重组肺表面活性物质相关蛋白D处理后，外周血单核细胞中活化T细胞的比例下降，而抑制性分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的表达上调，同时其也可以诱导T细胞的选择性凋亡^［41］。因此，肺表面活性物质相关蛋白D可能促进了低活化的CD4⁺T细胞状态，同时由于其强大抗炎作用，其可能通过增加FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平以降低IA风险。然而，还需要更为完善的生物学机制实验证实这些发现。

节点调节因子1是一种高度保守的跨膜蛋白，属于转化生长因子-β家族，在早期胚胎的左-右不对称性、神经系统发育以及器官形成等过程中发挥关键作用。作为胞外配体，其可以激活特异性受体并形成复合物，进而磷酸化Smad蛋白，促进Smad4介导的基因转录，从而促进细胞外基质的生成与释放^［42］。而细胞外基质被认为是血管壁细胞赖以生存的微环境组成部分，对于血管细胞的正常功能维持和疾病发生至关重要^［43］。因此，节点调节因子1可以通过增强血管稳态来降低IA的风险。本研究的中介分析还发现了其潜在的免疫中介通路。首先是表达CD25的免疫细胞表型，其通过增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比和CD25在IgD⁺CD24⁺B细胞上的表达水平来降低IA的风险。CD25在IgD⁺CD24⁺B细胞上的表达代表过渡性B细胞的活化状态，这类细胞常被认为具备IL-10分泌能力，能够在炎症环境中发挥调节性功能^{［44，45］}。同时CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright T细胞也有高表达IL-10的能力。IL-10不仅可以直接抑制IL-6、IL-1β的产生，还能抑制效应T细胞的过度活化，从而限制血管损伤性炎症反应^［46］。与此同时，记忆B细胞在淋巴细胞中百分比的升高反映了增强的持久体液免疫记忆能力。记忆B细胞在再次遇到抗原时能迅速分化为浆细胞并产生高亲和力抗体，从而有效清除病原或炎性物质^［47］。研究表明缺乏B细胞会加剧动脉壁损伤和动脉粥样硬化进展^［48］，而记忆B细胞的扩增与血管保护效应相关^［49］。因此，节点调节因子1可能通过提升记忆B细胞占比来发挥血管保护作用，进而降低IA的风险。此外，CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平同样具有重要意义。IgD⁺ CD38^bright B通常属于新生或过渡性B细胞群体，其免疫学功能偏向于免疫耐受和调节^［50］。CD19作为B细胞受体信号复合物的关键分子，能够放大B细胞受体信号并促进B细胞的增殖和分化^［51］。研究表明，CD19信号增强可提升B细胞的免疫调控能力，并促进IL-10的分泌^［52］。而CD19缺陷会导致整体体液免疫反应受损，对感染的易感性增加。这提示了CD19对于维持免疫稳态的复杂作用^［53］。因此，节点调节因子1通过上调CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平，可能进一步强化了B细胞的调节性功能，抑制血管局部过度炎症反应，维持免疫耐受环境，进而降低IA的风险。

本研究综合多种MR方法和敏感性分析，发现心脏代谢蛋白和免疫细胞表型均可影响IA的发病，并揭示了免疫在心脏代谢蛋白与IA之间的中介作用。本研究在遵循3个MR核心假设的基础上，使用6种MR方法共同确立因果关系以增强结果的可信度，同时，借助多种敏感性分析方法和方向性检验均未发现多效性和反向因果关系。这些结果为“心-免疫-脑轴”的存在提供了证据支持，为IA的疾病预防及发病机制研究提供了见解。然而本研究还存在一些局限性。首先，本研究人群均来源于欧洲群体，其结果在我国及其他种族中的普适性有待验证。其次，为了获取足够的SNP用于分析，本研究选定了P<1×10^-5作为关联阈值，尽管借助多种敏感性分析来控制偏倚，然而潜在的水平多效性仍不能完全排除。此外，本研究基于公开统计数据，虽初步建立了因果关系与中介模型，但未能覆盖全部潜在路径，其他中介机制仍有待探索。因此，未来研究应基于更大规模、涵盖不同地域与种族的人群队列来验证这些结果，并通过更为完善的前瞻性研究和分子生物学实验，以充分证实和探索“心-免疫-脑轴”的联系机制。此外，有必要评估心脏代谢蛋白及其相关免疫细胞表型作为疾病预测生物标志物的潜力，并探索其作为干预靶点的可行性。

综上所述，本研究通过综合MR分析揭示了心脏代谢、免疫和IA的因果关系，免疫细胞表型可以介导心脏代谢蛋白对IA的因果效应。具体而言，血清肿瘤坏死因子受体1和Versican核心蛋白均可通过降低CD4⁺CD8^dim细胞占白细胞百分比和CD4⁺CD8^dim细胞占淋巴细胞百分比来降低IA风险；同时Versican核心蛋白可以增加CD25在活化型调节T细胞上的表达水平来降低IA风险；肺表面活性物质相关蛋白D则通过增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比和FSC-A值在HLA-DR⁺CD4⁺细胞上的水平来降低IA风险；节点调节因子1则增加CD28^-CD25⁺⁺CD8^bright细胞占T细胞百分比、记忆B细胞占淋巴细胞百分比、CD25在IgD⁺CD24⁺ B细胞上的表达水平和CD19在IgD⁺CD38^bright B细胞上的表达水平来降低IA的风险。这些发现为理解IA的发病机制及探寻“心-免疫-脑轴”的潜在作用奠定了基础。同时，临床医师可以早期关注心脏代谢情况，进而有助于对IA的发生进行监测和预防。

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基金资助

山西省卫生健康委科研项目(202107)