大柴胡汤对动脉粥样硬化大鼠氧化三甲胺及脂代谢的影响

Effects of Da⁃Chai⁃Hu decoction on trimethylamine oxide and lipid metabolism in atherosclerotic rats

摘要

目的 探讨大柴胡汤对动脉粥样硬化（AS）模型大鼠氧化三甲胺（TMAO）及脂代谢的调节作用，揭示其抗动脉粥样硬化的潜在机制。 方法 将SD大鼠按随机数字表法分为：正常对照组、AS模型组、大柴胡汤组及阿托伐他汀片组，每组10只。使用全自动生化分析仪，并配套相应试剂盒，测定大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的浓度；HE染色和油红O染色观察主动脉的病理变化；采用ELISA法检测血清TMAO的表达水平。 结果 与正常对照组比较，其余三组大鼠体质量均有所增加；与AS模型组相比，大柴胡汤组和阿托伐他汀片组大鼠体质量均出现显著下降（P<0.05）。与正常对照组比较，AS模型组TG、TC、LDL-C含量升高，HDL-C降低（均P<0.05）；与AS模型组比较，大柴胡汤组和阿托伐他汀片组TG、TC、LDL-C含量降低，HDL-C升高（均P<0.05）；与阿托伐他汀片组比较，大柴胡汤组TG、TC、LDL-C含量升高，HDL-C降低（均P<0.05）。HE结果显示，正常对照组主动脉结构完整；模型组主动脉损伤严重，内膜明显增厚，中膜纤维紊乱、结构破坏；大柴胡汤组和阿托伐他汀片组损伤减轻，内膜增厚和纤维增生得到改善，结构更规整。油红O结果显示，正常对照组几乎无脂质沉积；模型组出现大量红色脂质沉积；大柴胡汤组和阿托伐他汀片组脂质沉积明显减少；与对照组比较，AS模型组TMAO含量显著增加（P<0.05）；与AS模型组比较，大柴胡汤组和阿托伐他汀片组TMAO含量显著降低（均P<0.05）；与阿托伐他汀片组比较，大柴胡汤组TMAO显著升高（P<0.05）。 结论 大柴胡汤可能通过降低TMAO水平并调节脂代谢紊乱，从而减轻动脉粥样硬化模型大鼠的体质量、血脂异常及主动脉病理损伤，发挥抗动脉粥样硬化作用。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effect of Da⁃Chai⁃Hu decoction on trimethylamine oxide and lipid metabolism in atherosclerotic model rats， and explore its potential anti-atherosclerotic mechanism. Methods SD rats were randomly divided into four groups using a random number table： normal control group， AS model group， Da⁃Chai⁃Hu decoction group， and Atorvastatin group， with 10 rats in each group. The concentrations of total cholesterol（TC）， triglycerides（TG）， low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）， and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C） in serum were measured using a fully automated biochemical analyzer with matched reagent kits. Pathological changes of the aorta were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining and oil red O staining. The serum TMAO concentration was measured using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results Compared with normal control group， the body weight of rats in the other three groups increased significantly（P<0.05）. Compared with AS model group， the body weight of rats in Da⁃Chai⁃Hu decoction group and Atorvastatin group decreased significantly（P<0.05）. Compared with normal control group， the levels of TG， TC， and LDL-C increased， while HDL-C decreased in AS model group（all P<0.05）. Compared with AS model group， the levels of TG， TC， and LDL-C decreased while HDL-C increased in Da⁃Chai⁃Hu decoction group and Atorvastatin group（all P<0.05）. Compared with Atorvastatin group， the levels of TG， TC， and LDL-C increased while HDL-C decreased in Da⁃Chai⁃Hu decoction group（all P<0.05）. HE staining results showed that the aortic structure was intact in normal control group， with smooth and continuous endothelium. The rats in model group exhibited severe aortic injury， characterized by significantly thickened intima， disordered medial fibers， and marked structural destruction. The degree of injury was alleviated in both Da⁃Chai⁃Hu decoction group and Atorvastatin group， showing a relatively flat intima， improved medial fibrous hyperplasia， and a more regular structure. Oil red O staining results showed almost no lipid deposition in normal control group. The rats in model group exhibited extensive red lipid deposition throughout the aortic wall. The red lipid deposition was significantly reduced in both Da⁃Chai⁃Hu decoction group and Ator⁃vastatin group， indicating reduced atherosclerotic plaque formation. Compared with normal control group， the serum TMAO concentration increased significantly in AS model group（P<0.05）. Compared with AS model group， the TMAO concentration decreased significantly in both Da⁃Chai⁃Hu decoction group and Atorvastatin group（all P<0.05）. Compared with atorvastatin group， the TMAO concentration significantly increased in Da⁃Chai⁃Hu decoction group（P<0.05）. Conclusion Da⁃Chai⁃Hu decoction may exert anti-atherosclerotic effects by reducing TMAO concentration and regulating lipid metabolism disorders， thereby ameliorating abnormal body weight， dyslipidemia， and aortic pathological damage in atherosclerotic model rats.

Graphical abstract

关键词

大柴胡汤 / 动脉粥样硬化 / 氧化三甲胺 / 脂质代谢 / 代谢产物 / 大鼠

Key words

Da⁃Chai⁃Hu decoction / atherosclerosis / trimethylamine oxide / lipid metabolism / metabolites / rats

动脉粥样硬化（atherosclerosis， AS）是心血管疾病的核心病理基础，其发病与脂质代谢紊乱和慢性炎症密切相关^［1］。近年来，肠道菌群及其代谢产物氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO）在AS中的作用备受关注。研究表明，TMAO通过促进泡沫细胞形成、抑制胆固醇逆向转运及加剧血管炎症等机制加速AS进程^［2］。临床数据显示，冠心病患者血浆TMAO水平显著升高，且与斑块负荷呈正相关^［3］，提示调控TMAO生成可能成为AS防治的新靶点。大柴胡汤源自《伤寒杂病论》，由柴胡、黄芩、半夏等八味中药组成，具有和解少阳、通腑泻浊之效。现代药理研究表明，其可通过多组分协同作用调节脂代谢、抑制炎症反应，并在代谢性疾病中显示潜在干预价值^［4，5］。例如，柴胡皂苷可激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路促进胆固醇逆向转运，黄芩苷能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶活性以减少胆固醇合成，大黄蒽醌类成分可抑制肠道胆固醇吸收。尽管其作用机制尚未完全阐明，但已有研究证实其对血脂异常及血管炎症有改善作用。本研究以AS大鼠为模型，结合生化检测、病理分析及分子生物学技术，系统探讨大柴胡汤对TMAO及脂代谢的调节作用，旨在为阐释其抗AS机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

40只雄性6周龄SD大鼠由新疆医科大学动物中心提供，实验动物生产许可证编号为：SCXK（新）2018-0002。本研究通过新疆医科大学实验动物伦理委员会审批（批号：IACUC-20220624-10）。大柴胡汤由本院制剂室统一配制，方剂组成包括柴胡、黄芩、芍药、半夏、生姜、枳实、大枣和大黄等，所提供药液浓度为0.94 g/mL。阿托伐他汀片（国药准字：H20051408）购自杭州默沙东制药有限公司。氧化三甲胺ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）购自长春汇力生物技术有限公司。

1.2 动物模型的建立

将SD大鼠在实验前进行为期7 d的适应性饲养，饲养期结束后，依据随机数字表法将大鼠分为4组：正常对照组、AS模型组、大柴胡汤组及阿托伐他汀片组，每组10只。正常对照组予普通饲料喂养，其他三组则持续给予高脂饲料诱导动脉粥样硬化模型。

1.3 动物分组及处理

8周后给予药物灌胃。大柴胡汤剂量：参考临床成人日用量，按体表面积折算后，大鼠等效剂量为9.4 g/（kg·d）。将水煎浓缩液配制为浓度0.94 g/mL，按1 mL/100 g体积灌胃。阿托伐他汀剂量：参考成人临床日用量（20 mg/d），折算为大鼠等效剂量为1.9 mg/（kg·d）。将阿托伐他汀钙片用蒸馏水研磨并配制为0.19 mg/mL的混悬液，按1 mL/100 g体积灌胃。正常对照组和AS模型组给予蒸馏水（1 mL/100 g）灌胃，大柴胡汤组给予大柴胡汤（1 mL/100 g）灌胃，阿托伐他汀片组给予阿托伐他汀片（1 mL/100 g）灌胃，每天一次，给药4周。

1.4 全自动生化分析仪检测TC、TG、LDL-C及HDL-C水平

采用全自动生化分析仪，利用相应检测试剂盒中的酶法，检测大鼠血清中的TC、TG、LDL-C及HDL-C水平。

1.5 苏木精-伊红（HE）染色观察主动脉组织形态学变化

大鼠处死后背侧剖开胸腔，完整分离胸主动脉至腹主动脉段，去除周围脂肪及结缔组织，剪成约0.5 cm长的组织块，置于4%多聚甲醛溶液内进行为期24 h的固定处理。其后，组织依次经梯度乙醇（70%，80%，90%，95%，100%）脱水各1 h，二甲苯透明（2次，每次20 min），石蜡包埋后使用切片机制备5 μm厚连续切片，于载玻片上备用。切片经二甲苯脱蜡（2次，每次10 min），梯度乙醇水化（100%，95%，90%，80%，70%乙醇各5 min），苏木精染液染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化5 s，自来水蓝化10 min，伊红染液染色3 min，再次经梯度乙醇脱水（70%，80%，90%，95%，100%乙醇各5 min），二甲苯透明（2次，每次10 min），中性树胶封片。在显微镜下观察组织的病理改变。

1.6 采用油红Ｏ染色法检测主动脉脂质沉积

制备冰冻切片，恢复至室温，以蒸馏水进行冲洗；用60%异丙醇浸泡处理后，使用油红O染液染色10 min；其后以60%异丙醇分化至背景无色，蒸馏水冲洗；采用Mayer苏木素复染数分钟，经PBS浸泡（蓝化）3 min；最后用蒸馏水冲洗后，以水溶性封片剂进行封片操作。在显微镜下观察组织的病理改变。

1.7 ELISA法检测TMAO的表达水平

实验前先对组织进行匀浆处理并获取上清液。随后设置标准孔与样品孔，标准孔每孔添加50 μL相应标准品；样品孔先加入40 μL样本稀释液，再加入10 μL待测样本，在37 ℃环境下温育30 min。之后每孔添加50 μL检测抗体，充分混匀后继续在37 ℃温育30 min。随后向每孔分别加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，振荡混匀后在37 ℃避光条件下显色10 min，最后加入50 μL终止液终止反应。采用酶标仪在450 nm波长下测定各孔的光密度（OD值）。

1.8 统计学分析

采用SPSS25.0软件开展数据处理工作，数据均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布，以均数±标准差（X±S）的形式呈现。多组间计量资料运用单因素方差分析，两两比较时采用LSD法，将检验水准设定为α=0.05，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大柴胡汤对大鼠体质量和血脂水平的影响

与正常对照组比较，其余各组大鼠体质量增加；与AS模型组比较，大柴胡汤组和阿托伐他汀片组体质量降低（P<0.05，见图1）。与正常对照组比较，AS模型组TG、TC、LDL-C含量增加，HDL-C降低（均P<0.05）；与AS模型组比较，大柴胡汤组和阿托伐他汀片组TG、TC、LDL-C含量降低，HDL-C升高（P<0.05）；与阿托伐他汀片组比较，大柴胡汤组TG、TC、LDL-C含量升高（均P<0.05），HDL-C降低（P<0.05，见图1）。

2.2 大柴胡汤对大鼠主动脉病理形态的影响

HE染色结果显示，正常对照组大鼠主动脉无异常病变，内膜光滑连续，中膜与外膜结构规整，各层组织排列有序；AS模型组大鼠主动脉呈现显著损伤，内膜增厚且形态不规则，中膜弹性纤维与胶原纤维分布紊乱、明显增粗，血管壁结构破坏明显；大柴胡汤组和阿托伐他汀片组大鼠主动脉损伤程度均有不同程度减轻，内膜相对平整，中膜纤维组织增生情况改善，结构趋于规则（见图2）。

油红O染色结果显示，正常对照组大鼠主动脉几乎无红色脂质沉积，表明处于正常脂质代谢状态；AS模型组大鼠主动脉可见大量红色脂质沉积，分布广泛且集中，提示脂质异常堆积严重；大柴胡汤组和阿托伐他汀片组大鼠主动脉红色脂质沉积均减少，说明脂质堆积情况得到一定程度改善（见图2）。

2.3 大柴胡汤对大鼠血清TMAO水平的影响

与正常对照组比较，模型组TMAO含量显著增加（P<0.05）；与模型组比较，大柴胡汤组、阿托伐他汀片组的TMAO含量显著降低（P<0.05）；与阿托伐他汀片组比较，大柴胡汤组TMAO显著升高（P<0.05，见图3）。

3 讨论

动脉粥样硬化是动脉的一种慢性炎症状态，作为心血管疾病的主要病理基础，多年来一直是全世界人类死亡的主要原因，严重危害人类健康^［6，7］。动脉粥样硬化的显著特征是大动脉内膜脂质积累和炎症的生成，尤其是在主动脉和冠状动脉中^［2］。从中医理论而言，脾具有运化水谷精微的重要功能，乃气血生化之根本。血液中的脂质同样由脾对水谷的运化作用生成，并依靠脾的转输功能布散至全身各处。若长期过食肥甘厚腻之品，会损伤脾胃功能，导致脾胃运化失常，水谷精微的输布出现紊乱，进而凝聚形成痰浊，痰浊与瘀血相互结聚，常常会引发血脂代谢异常及动脉粥样硬化，随着时间的推移更易诱发心血管疾病^［8］。大柴胡汤包括柴胡、半夏、黄芩、生姜、大枣等主要组分，诸药相配，既可疏少阳阳明之气滞，又可通腑泻浊以祛瘀，使得瘀血得消、肝气得疏、脉络通畅、血运无阻^［9］。

TMAO主要是由肠道菌群中的三甲胺氧化产生^［10］。研究证实，TMAO水平升高会显著增加肾功能衰竭、代谢综合征、糖尿病、心力衰竭、高血压、动脉粥样硬化及血脂异常的发病风险，最终可导致严重心血管事件发生的风险上升^［11］。本研究结果显示，AS模型组大鼠TC、TG、LDL-C水平显著高于正常对照组，HDL-C水平显著降低，符合AS模型典型的血脂特征。给予大柴胡汤灌胃4周后，模型大鼠TC、TG、LDL-C水平显著下降，HDL-C水平显著升高，表明大柴胡汤可有效改善AS模型大鼠的血脂紊乱。大柴胡汤源自《伤寒论》，具有和解少阳、内泻热结之功效，方中柴胡、黄芩疏肝清热，大黄、枳实通腑泄浊，芍药、大枣养血和中，全方共奏调和气血、清泻痰热之效。现代药理研究表明，柴胡皂苷可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体通路促进胆固醇逆向转运；黄芩苷能抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶活性，减少胆固醇合成；大黄中的蒽醌类成分可抑制肠道胆固醇吸收，促进胆汁酸排泄。本研究结果与上述机制相呼应，提示大柴胡汤可能通过多成分、多靶点调节脂质代谢，从而发挥抗AS作用。

本研究揭示大柴胡汤降低AS大鼠TMAO水平的直接效应，其机制可能涉及“抑制生成-促进排泄”的双向调节：（1）抑制三甲胺（trimethylamine， TMA）生成。大柴胡汤组主动脉脂质沉积显著减少，提示其可能通过调节肠道菌群结构抑制胆碱代谢。有研究表明，肠道细菌可将膳食中的胆碱和左旋肉碱代谢为TMA^［12-14］，而大柴胡汤可通过调节肠道菌群结构，改变肠道细菌对胆碱等物质的代谢，从而减少TMA的生成，进而降低TMAO的产生，减缓心血管疾病的发生发展^［15］。提示大柴胡汤调节肠道菌群抑制胆碱代谢，可能是其降低TMAO水平的重要机制之一。（2）促进TMAO排泄。本研究中大柴胡汤组HDL-C水平显著升高，而HDL可通过结合TMAO增强其肾脏清除^［16］。此外，多项研究表明，大柴胡汤可通过上调occludin表达^［17］、抑制TLR4/NF-κB通路^［18］及调节肠道菌群^［19］等多种机制修复肠道屏障功能，减少TMAO前体的肠肝循环。（3）调控能量代谢。本研究中大鼠体质量增长减缓，提示能量代谢重编程可能参与抗AS过程，加味大柴胡汤研究证实，其通过激活SIRT1/PGC-1α通路提高线粒体ATP生成^［20］。而临床研究显示，大柴胡汤可同步改善胰岛素抵抗^［5］，并通过调控CTNNB1/EGFR轴维持肠道屏障功能^［17］，与中医“通腑泻浊”理论高度契合。何璠玙等^［21］改良方剂“通脉降浊汤”进一步证实，抑制NLRP3炎症小体可显著缓解AS合并心理应激，提示大柴胡汤类方在复杂代谢性疾病中的广阔应用前景。

本研究初步揭示了大柴胡汤通过“TMAO-脂代谢”轴改善AS的潜力，但存在以下局限：未检测肠道菌群组成及TMA含量，未来需结合16S rRNA测序和代谢组学深入解析菌群-宿主互作；未验证FMO3活性或肾脏排泄功能，TMAO降低的具体通路仍需明确，未来可进一步探讨大柴胡汤关键成分（如黄芩苷、大黄素）对特定菌属的调控作用。

综上，大柴胡汤能够显著降低动脉粥样硬化模型大鼠的体质量、血清脂质水平，减少动脉粥样硬化斑块形成，降低TMAO的表达水平，有效改善动脉粥样硬化的病理损伤。大柴胡汤或可作为防治动脉粥样硬化的潜在中药选择，其通过多靶点干预肠道菌群代谢产物与脂质紊乱，体现了中医药整体调节的优势，为心血管疾病的防治提供了新的思路和实验依据。

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基金资助

自治区卫生健康委“青年科技人才—乡村振兴”项目(WJWY-XCZX202215)