间充质干细胞对海马神经细胞缺氧复氧损伤的影响及机制

Effect and mechanism of mesenchymal stem cells on hypoxia-reoxygenation injury in hippocampal neurons

摘要

目的 探讨间充质干细胞（MSCs）通过抑制铁死亡对海马神经细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的影响及其机制。 方法 将海马神经细胞分为3组：对照组、缺氧复氧（H/R）组、间充质干细胞共培养（MSCs）组。CCK-8试剂盒检测细胞活力；ELISA检测谷胱甘肽（GSH）、Caspase-3活性、Fe²⁺含量、丙二醛（MDA）水平；流式细胞术检测活性氧（ROS）含量和细胞凋亡；蛋白免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、转铁蛋白受体（TFR）表达水平。为进一步明确MSCs是否通过调控铁死亡通路发挥神经保护作用，采用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）与激动剂Erastin进行干预，分别分为：H/R组、MSCs组、Lip-1组和MSCs+Lip-1组；以及H/R组、MSCs组、Erastin组和MSCs+Erastin组；通过CCK-8法检测细胞活力，并同步测定GSH、Fe²⁺和MDA等铁死亡相关指标。 结果 与对照组相比，H/R组海马神经细胞中ROS、MDA和Fe²⁺含量、Caspase-3活性增加（P<0.01），GSH含量、细胞活力显著降低（P<0.01）；同时GPX4表达显著下调（P<0.01），TFR表达显著上调（P<0.01）。与H/R组相比，MSCs组ROS、MDA及Fe²⁺含量、Caspase-3活性显著降低（P<0.01），GSH含量和细胞活力增加（P<0.05），细胞凋亡减少（P<0.05）；GPX4表达显著上调（P<0.05），TFR表达显著下调（P<0.01）。与H/R组相比，Lip-1组细胞活力、GSH含量增加（P<0.01），GPX4表达上调（P<0.05），TFR表达下调（P<0.01），MDA和Fe²⁺含量减少（P<0.01）；与MSCs组相比，MSCs+Lip-1组GPX4表达显著上调（P<0.01），TFR表达显著下调（P<0.01），MDA和Fe²⁺含量显著降低（P<0.05），细胞活力和GSH含量没有显著差异。相反，与H/R组相比，Erastin组细胞活力、GSH含量降低（P<0.05），MDA及Fe²⁺含量显著升高（P<0.01）；与MSCs组相比，MSCs+Erastin组细胞活力、GSH含量降低（P<0.05），MDA和Fe²⁺含量显著升高（P<0.01）。 结论 MSCs通过抑制海马神经细胞在缺氧复氧后的铁死亡，发挥细胞修复作用。

Abstract

Objective To investigate the effect and mechanism of mesenchymal stem cells（MSCs） on hippocampal neuronal injury induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. Methods Hippocampal neurons were divided into three groups： control group， H/R group， and MSCs co-culture group. Cell viability was detected by CCK-8 kit. The levels of glutathione（GSH）， Caspase-3， Fe²⁺， and malondialdehyde（MDA） were measured by ELISA. The content of reactive oxygen species（ROS） and the cell apoptosis were detected by flow cytometry. The expression levels of glutathione peroxidase 4（GPX4） and transferrin receptor（TFR） were detected by Western blot. To further clarify whether MSCs exert neuroprotective effects by regulating the ferroptosis pathway， ferroptosis inhibitor Liproxstatin-1（Lip-1） and agonist Erastin were used for intervention， and the cells were divided into： H/R group， MSCs group， Lip-1 group， and MSCs+Lip-1 group； or H/R group， MSCs group， Erastin group， and MSCs+Erastin group. Then cell viability， and ferroptosis-related indicators such as GSH， Fe²⁺， and MDA were measured. Results Compared with control group， the levels of ROS， MDA， and Fe²⁺， and the activity of Caspase-3 were significantly increased in H/R group（P<0.01）， the content of GSH and the cell viability were significantly decreased（P<0.01）； meanwhile， GPX4 expression was significantly down-regulated（P<0.01）， and TFR expression was significantly up-regulated（P<0.01）. Compared with H/R group， the levels of ROS， MDA， and Fe²⁺， and the cell apoptosis were significantly reduced in MSCs group（P<0.05）， and GSH content and the cell viability were increased（P<0.05）； GPX4 expression was significantly up-regulated（P<0.05）， while TFR expression was significantly down-regulated（P<0.01）. Compared with H/R group， the cell viability，and GSH content were significantly increased in Lip-1 group（P<0.01）， GPX4 expression was up-regulated（P<0.05）， TFR expression was down-regulated（P<0.01）， and the contents of MDA and Fe²⁺ were reduced（P<0.01）. Compared with MSCs group， GPX4 expression was significantly up-regulated while TFR expression was down-regulated in MSCs+Lip-1 group（P<0.01）， the contents of MDA and Fe²⁺ were reduced（P<0.01）， and there was no significant difference in the cell viability and GSH content. Compared with H/R group， the cell viability and GSH content were significantly decreased in Erastin intervention group（P<0.05）， and the contents of MDA and Fe²⁺ were increased（P<0.01）. Ccompared with MSCs group， the cell viability and GSH content were significantly decreased in MSCs+Erastin group（P<0.05）， and the contents of MDA and Fe²⁺ were increased（P<0.01）. Conclusion MSCs exert a role in cell repair by inhibiting ferroptosis in hippocampal neurons after hypoxia/reoxygenation.

Graphical abstract

关键词

间充质干细胞 / 海马神经细胞 / 铁死亡 / 缺氧复氧损伤 / 氧化应激 / 细胞修复

Key words

mesenchymal stem cells / hippocampal neurons / ferroptosis / hypoxia-reoxygenation injury / oxidative stress / cell repair

全球早产儿发病率居高不下，每年约有1 500万早产儿出生，其中存活的极早早产儿近一半面临认知障碍、视听缺陷及脑瘫等不良神经结局^［1］。脑白质损伤（white matter injury， WMI）是导致早产儿不良结局的主要原因之一，其发生与髓鞘形成障碍及白质结构破坏密切相关。作为中枢神经系统中对缺氧最敏感的区域之一，海马神经细胞在缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation， H/R）后易发生损伤，进而诱发多种神经系统疾病，严重影响患儿远期生存质量^［2］。

缺氧复氧损伤涉及多种分子机制，包括氧化应激、细胞凋亡和铁死亡等^［3］。铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化的细胞死亡方式，以活性氧（reactive oxygen species， ROS）积累和谷胱甘肽（glutathione， GSH）耗竭为主要特征^［4］。细胞内铁离子超载可催化脂质过氧化，破坏膜结构，导致细胞死亡^［5］。GPX4是铁死亡的关键调控蛋白，通过还原脂质过氧化物发挥保护作用；转铁蛋白受体（TFR）则参与铁摄取，其高表达可促进铁死亡进程^［6，7］。既往研究表明，抑制铁死亡可缓解多种缺氧复氧相关损伤^［8］，但在海马神经细胞中的具体机制尚不明确。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）具有多向分化潜能及强大的旁分泌能力，可通过释放细胞因子和外泌体等修复受损组织，在多种疾病模型中显示保护效应^［9］。然而，MSCs是否可通过调控铁死亡通路减轻海马神经细胞缺氧复氧损伤，目前尚未见报道。

因此，本研究拟通过MSCs与缺氧复氧处理的海马神经细胞共培养，探讨MSCs是否通过抑制铁死亡通路减轻神经细胞损伤、促进修复功能，为深入理解早产儿脑损伤机制及开发神经保护策略提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

研究使用2~3周雄性C57BL/6小鼠5只，SPF级，体质量10~15 g，由新疆医科大学动物实验中心提供，所有实验程序均遵循动物伦理学标准，本研究经西安医学院第二附属医院动物实验医学伦理委员会批准（X2Y2025091）。海马神经细胞HT22购自武汉普诺赛生命科技有限公司，DMEM完全培养基（含10%胎牛血清）由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。无糖无血清培养基、胰蛋白酶及双抗溶液购自美国Gibco公司。CCK-8试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒、Fe²⁺及MDA检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。Tubulin抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司，GPX4和TFR抗体购自美国Abclonal公司。铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）及激动剂Erastin均购自美国MedChemExpress公司。

1.2 细胞培养

采用黎涵玥等^［10］的方法培养间充质干细胞，1 mL注射器抽取含10%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）注入小鼠骨髓腔内，收集冲洗得到的骨髓悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞移入细胞培养瓶中，使用含10% FBS的DMEM培养基培养细胞一周后换液，细胞传代至2代可进行实验。

海马神经细胞采用DMEM培养基培养，置于含5% CO₂、95% 空气、37 ℃ 恒温箱中培养，每2 d换液一次，显微镜下观察细胞形态和生长情况，按照细胞生长情况进行传代，取生长良好的细胞进行建模。

1.3 实验分组及处理

为探讨MSCs与海马神经细胞共培养对缺氧复氧诱导的海马神经细胞损伤是否具有保护作用，本研究分为3组：对照组、缺氧复氧（H/R）组及间充质干细胞（MSCs）共培养组。对照组海马神经细胞于正常条件下培养（37 ℃、5% CO₂、95%空气）；H/R组海马神经细胞在无糖无血清培养基中经缺氧（37 ℃、99% N₂、1% O₂，8 h）处理后复氧（37 ℃、5% CO₂、95%空气，24 h）；MSCs组将两种细胞共培养48 h后实施相同H/R处理。然后采用CCK-8法检测海马神经细胞活力，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定GSH、Caspase-3、Fe²⁺含量及MDA水平；流式细胞术分析细胞内ROS含量及细胞凋亡率；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测铁死亡相关蛋白表达，包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和转铁蛋白受体（TFR）。

为了进一步探究MSCs的保护作用是否通过抑制铁死亡通路来实现：（1）设置抑制剂干预实验，分为4组：H/R组、MSCs组、Lip-1组、MSCs+Lip-1组。H/R组和MSCs组与上部分实验要求相同。Lip-1组在H/R过程中加入了特异性的铁死亡抑制剂（Lip-1），此组别不仅用于验证H/R损伤中是否存在铁死亡这一机制，同时也作为探究MSCs作用机制的对照。MSCs+Lip-1组在H/R处理的同时，既与MSCs共培养，也加入Lip-1，用于探究MSCs的保护作用是否主要通过抑制铁死亡这一通路来实现。（2）设置激动剂干预实验，分为4组：H/R组、MSCs组、Erastin组、MSCs+Erastin组。H/R组和MSCs组与上部分实验要求相同。Erastin组在H/R过程中加入了特异性的铁死亡激动剂（Erastin），此组别作为阳性对照，验证铁死亡通路被强制激活后是否会加剧细胞损伤。MSCs+Erastin组在H/R处理的同时，既与MSCs共培养，也加入Erastin，施加MSCs保护的同时，利用Erastin人为地激活铁死亡。然后检测细胞活力、GSH、Caspase-3、Fe²⁺含量及MDA水平；Western blot检测铁死亡相关蛋白表达，包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和转铁蛋白受体（TFR）。

1.4 CCK-8法检测海马神经细胞存活率

将对照组、H/R组、MSCs组细胞分别接种于96孔板，每孔100 μL，加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃恒温箱培养30 min，用酶标仪测定450 nm处吸光值。计算细胞存活率=（实验孔-调零孔）/（对照组-调零孔）×100%，每组设置3个复孔，实验重复3次取均值。

1.5 采用Caspase-3活性检测法检测细胞凋亡水平

取培养的对照组、H/R组、MSCs组细胞，用胰蛋白酶消化，显微镜下观察细胞形态80%~95%变圆，加入3倍体积的DMEM终止消化，离心收集细胞沉淀，用200 μL PBS洗涤3次后，按照顺序先后分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μl PI染液，混匀，室温避光孵育15 min，再通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.6 采用MDA试剂盒检测脂质氧化物（MDA）含量

利用MDA检测试剂盒测定对照组、H/R组、MSCs组MDA含量。用胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察细胞形态80%~95%变圆，加入3倍体积的DMEM终止消化，离心收集细胞沉淀，按照MDA检测试剂盒说明书操作收集细胞上清液。用酶标仪测定532 nm处吸光值，计算样本中MDA含量，每组设置3个复孔，取均值进行分析。

1.7 采用DCFH-DA荧光探针法检测海马神经细胞内ROS水平

用胰蛋白酶消化对照组、H/R组、MSCs组细胞，弃去上清加入200 μL PBS洗涤3次，取沉淀用1 mL PBS重悬，加入荧光探针 DCFH-DA，用流式细胞仪测定相对荧光强度。

1.8 采用微量酶标法测定海马神经细胞中GSH含量

培养对照组、H/R组、MSCs组细胞，弃去培养基，加入PBS洗涤3遍吸净PBS，加入RIPA裂解液冰上裂解细胞，冰浴超声破碎细胞，4 ℃，12 000g离心10 min。依次将样品、标准品（100 μL/孔）加入96孔板，检测412 nm处各孔吸光度值，并计算样本中GSH含量，每组设置3个复孔，取均值进行分析。

1.9 采用微量酶标仪检测海马神经细胞内Fe²⁺含量

培养对照组、H/R组、MSCs组细胞，弃去培养基，PBS洗涤一次，弃去PBS，加入胰蛋白酶消化细胞，收集沉淀。按照要求加入缓冲溶液，混匀，冰上裂解10 min。用玻璃匀浆仪在4 ℃进行匀浆，12 000g离心3~5 min，收集上清液。空白组中加入不同浓度铁标准溶液和显色溶液。测定组中加入相应样品和显色溶液。用酶标仪在593 nm处测定每组样品的吸光度值。按标准曲线计算Fe²⁺含量。

1.10 采用Western blot法检测海马神经细胞中GPX4及TFR蛋白的表达水平

将对照组、H/R组、MSCs组、Lip-1组、MSCs+Lip-1组细胞，分别用RIPA裂解液裂解各组细胞蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。标化浓度后，各组取10 μL蛋白用12.5% SDS-PAGE，分离，转PVDF膜，洗膜，5%脱脂奶粉的TBST工作液室温封闭1 h，加入一抗孵育过夜。一抗及稀释比例：Tubulin（内参，1∶5 000）、GPX4（1∶1 000）、TFR（1∶1 000）。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗（1∶5 000）在37 ℃培养1 h。用ECL液化学发光检测，Image J软件计算灰度值。

1.11 统计学分析

所有实验数据均采用平均值±标准误（X±S_X ）的形式表示，利用Graphpad Prism 9.0软件进行统计学分析。数据方差齐性采用Levene′s检验，多样本间差异比较采用单因素方差分析（ANOVA），之后组间两两比较采用Tukey事后检验（Tukey′s post hoc test）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 海马神经细胞与间充质干细胞共培养对缺氧复氧损伤的修复作用

与对照组相比，H/R组细胞活力显著降低（P<0.01）；而与H/R组相比，MSCs组细胞活力显著升高（P<0.05，见图1A）。在细胞凋亡方面，H/R组Caspase-3活性较对照组显著上升（P<0.01），MSCs组Caspase-3活性较H/R组则降低（P<0.01，见图1B）。流式细胞术检测结果显示，H/R组细胞凋亡率较对照组显著升高（P<0.01），MSCs组细胞凋亡率较H/R组显著降低（P<0.05，见图1C）。

2.2 MSCs共培养对缺氧复氧诱导海马神经细胞氧化应激的影响

与对照组相比，H/R组GSH含量显著降低（P<0.05），MDA、Fe²⁺含量及ROS活性均显著升高（均P<0.01）；而与H/R组相比，MSCs组GSH含量显著升高（P<0.05），MDA、Fe²⁺含量及ROS活性均显著降低（均P<0.01，见图2）。

2.3 间充质干细胞共培养对海马神经细胞缺氧复氧损伤后铁死亡的影响

与对照组相比，H/R组GPX4蛋白表达显著降低（P<0.01），TFR蛋白表达显著升高（P<0.01）；而与H/R组相比，MSCs组GPX4蛋白表达显著升高（P<0.05），TFR蛋白表达明显降低（P<0.01，见图3）。

2.4 铁死亡抑制剂Lip-1对海马神经细胞缺氧复氧损伤后铁死亡的影响

与H/R组相比，MSCs组和Lip-1组GPX4蛋白表达均显著升高（P<0.05），TFR蛋白表达均显著下降（P<0.01）；与MSCs组相比，MSCs+Lip-1组GPX4蛋白表达显著升高（P<0.01），TFR蛋白表达显著降低（P<0.01，见图4）。

2.5 铁死亡抑制剂Lip-1对缺氧复氧损伤后海马神经细胞的影响

与H/R组相比，MSCs组和Lip-1组细胞活力均显著升高（P<0.01），MDA含量和Fe²⁺含量均显著降低（P<0.01），GSH含量升高（P<0.05）。与MSCs组相比，MSCs+Lip-1组MDA和Fe²⁺含量均显著降低（P<0.05），细胞活力和GSH含量没有显著差异（见图5）。

2.6 铁死亡激动剂Erastin对缺氧复氧后海马神经细胞损伤的影响

与H/R组相比，MSCs组细胞活力和GSH含量均升高（P<0.05），MDA、Fe²⁺含量降低（P<0.05）；Erastin组细胞活力显著降低（P<0.01），MDA、Fe²⁺含量显著升高（P<0.01），GSH含量降低（P<0.05，见图6）。与MSCs组相比，MSCs+Erastin组细胞活力、GSH含量降低（P<0.05），MDA和Fe²⁺含量均显著升高（P<0.01，见图6）。

3 讨论

早产儿由于神经细胞、脑血管发育不成熟，在缺血缺氧、宫内感染等因素下极易发生脑损伤，表现为少突胶质细胞成熟障碍、小胶质细胞浸润以及髓鞘损伤等白质病变，同时往往伴有灰质神经元的损伤，而这些神经元的损伤也是后期发生神经系统后遗症的重要原因。海马组织是学习和记忆功能的中枢，也是一个容易发生缺氧缺血损伤的组织，尤其是海马CA1区，对缺氧缺血高度敏感，导致神经发育障碍的风险增加，目前还没有有效的治疗方法^［12］。

干细胞具有旁分泌效应和多向分化潜能，已在多个领域得到广泛研究，Cao等^［13］发现不同移植剂量HUC-MSCs鞘内注射脊髓损伤大鼠模型，可显著抑制缺血性卒中大鼠中性粒细胞浸润，促进脑组织结构和神经/运动功能恢复。已有多项研究已证实铁死亡在神经退行性疾病和脑缺血再灌注损伤中的关键作用^［14］，Zhang等^［15］报道在卒中模型中抑制铁死亡可减轻神经功能缺损。孙梦雅等^［16］发现褪黑素可以通过调节Akt/Nrf2/Gpx4通路抑制海马神经元铁死亡的发生，从而减轻海马组织的病理损伤，改善BIPI模型大鼠的学习记忆功能。本研究通过构建海马神经细胞缺氧复氧模型，模拟新生儿缺氧缺血性脑病等神经系统疾病的病理过程，重点探讨了间充质干细胞通过抑制铁死亡通路对神经细胞的保护作用及机制。结果发现，MSCs共培养可显著减轻缺氧复氧诱导的氧化应激和铁死亡，具体表现为提高细胞活力、上调GPX4表达、下调TFR表达，并调节GSH、MDA和Fe²⁺水平。进一步通过使用铁死亡抑制剂Lip-1和激动剂Erastin进行验证，结果表明MSCs的保护效应与铁死亡抑制密切相关。在缺氧复氧损伤模型中系统验证了MSCs通过调控GPX4、TFR介导的铁死亡通路发挥神经保护作用。不仅从表型水平（细胞活力、氧化应激指标）证实MSCs可缓解缺氧复氧损伤，还从分子机制层面揭示其作用路径，为临床治疗缺氧缺血性脑损伤提供了新的潜在靶点和治疗策略。

本研究进一步发现，MSCs除传统旁分泌和抗凋亡机制外，还可通过调节铁代谢和脂质过氧化直接抑制铁死亡，铁死亡是Dixon等^［17］在2012年首次提出的一种新的细胞程序性死亡方式。不同于坏死、凋亡等传统的细胞死亡形式，铁死亡是由多种原因导致细胞内铁离子水平异常增高和抗氧化能力的下降，通过铁依赖的芬顿反应引起细胞内脂质过氧化的迅速扩增和蓄积，进而诱发的一种铁依赖的、以脂质过氧化为特征的细胞死亡形式。在铁死亡过程中，细胞膜上的磷脂是ROS的主要攻击靶点，而由此导致的脂质过氧化是铁死亡的主要驱动因素。脑组织中的磷脂含量较其他组织更为丰富，因此在氧化应激后更易发生铁死亡。本研究聚焦于海马神经细胞，拓展了MSCs调控细胞死亡方式的范畴，提示MSCs的修复作用可能涉及多通路协同，而非单一分子调控。

综上，本研究阐明了MSCs通过抑制铁死亡来减轻海马神经细胞缺氧复氧损伤，从而促进神经细胞修复，这为临床干预缺氧缺血性脑病提供了新的理论依据和潜在治疗策略。但本研究所有实验均在细胞层面进行，缺乏动物体内实验的验证，因此其生理相关性和转化价值需进一步探讨；且铁死亡信号网络复杂，本研究仅关注GPX4和TFR两个关键分子，未全面考察其他潜在调控因子如ACSL4、FSP1等的作用，未来研究将在以下方面深入展开：首先在体内模型中验证MSCs通过抑制铁死亡缓解脑缺血再灌注损伤的效果；其次利用多组学技术筛选MSCs调控铁死亡的关键效应分子；最后探索联合使用MSCs与铁死亡抑制剂是否具有协同神经保护效应，进一步明确GPX4、TFR之外是否还有其他信号分子参与MSCs调控铁死亡的进程。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82060288)