重复经颅磁刺激对颅脑损伤认知障碍大鼠TNF⁃α、IL⁃6和IL⁃10表达的影响

Effects of rTMS on expressions of TNF⁃α， IL⁃6 and IL⁃10 in rats with cognitive impairment after traumatic brain injury

摘要

目的 探讨重复经颅磁刺激（rTMS）治疗对颅脑损伤（TBI）后认知障碍大鼠不同时间点促炎因子（TNF-α、IL-6）和抗炎因子（IL-10）表达的影响。 方法 SD大鼠随机分为4组：对照组、假手术组、TBI组和rTMS组，每组40只。对照组大鼠不进行任何处理；假手术组仅开放骨窗；TBI组和rTMS组均按照Feeney自由落体法建模，rTMS组于术后当天起进行每天20 min的重复经颅磁刺激治疗。于建模0 h、24 h、7 d、14 d、28 d对四组大鼠进行改良神经功能缺损评分（mNSS评分），并检测血清和脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10的含量。 结果 在0 h和24 h，rTMS组mNSS评分与TBI组相比差异无统计学意义（P>0.05）；在7 d和14 d，rTMS组mNSS评分均低于TBI组（P<0.05）；在28 d，rTMS组和TBI组间mNSS评分差异无统计学意义（P>0.05）。在0 h，四组间血清和脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量差异均无统计学意义（P>0.05）；在24 h、7 d和14 d，rTMS组TNF-α和IL-6含量均显著低于TBI组，IL-10含量显著高于TBI组（均P<0.05）；在28 d，rTMS组脑组织中IL-10含量略高于TBI组，但差异不显著（P>0.05）。 结论 TBI后认知障碍大鼠给予rTMS治疗可有效抑制促炎因子过度表达和促进抗炎因子的表达，减轻炎症反应，从而起到脑保护作用。

Abstract

Objective To investigate the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation（rTMS） on the expressions of pro-inflammatory factors（TNF-α， IL-6） and anti-inflammatory factor（IL-10） at different time points in rats with cognitive impairment after traumatic brain injury（TBI）. Methods SD rats were randomly divided into four groups： control group， sham operation group， TBI group， and rTMS group， with 40 rats in each group. The rats in control group were given no any treatment， the bone window of rats was opened in sham group， and the TBI-induced cognitive impairment rat models in TBI group and rTMS group were constructed using Feeney weight-drop method. Starting from the day after surgery， the rats in rTMS group underwent 20 min repetitive transcranial magnetic stimulation every day. At 0 h， 24 h， 7 d， 14 d， and 28 d， the modified neurological deficit score（mNSS score） was performed on the rats in four groups， and the expressions of TNF-α， IL-6， and IL-10 in serum and brain tissue were detected. Results At 0 h and 24 h， there was no statistically significant difference in mNSS score between rTMS group and TBI group（P>0.05）. At 7 d and 14 d， the mNSS scores in rTMS group were lower than those in TBI group（P<0.05）； at 28 d， there was no statistically significant difference in mNSS score between rTMS group and TBI group（P>0.05）. At 0 h， the levels of TNF-α， IL-6， and IL-10 in serum and brain tissue showed no statistically significant differences among four groups（P>0.05）； at 24 h， 7 d， and 14 d， the levels of TNF-α and IL-6 in rTMS group were significantly lower than those in TBI group（P<0.05）， and the level of IL-10 was significantly higher. At 28 d， IL-10 level in the brain tissue in rTMS group was slightly higher than those in TBI group， but the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion The rTMS can play a brain-protective role by effectively inhibiting the overexpression of proinflammatory factors and promoting the expression of anti-inflammatory factors in TBI-induced cognitive impairment rats.

Graphical abstract

关键词

创伤性脑损伤 / rTMS / IL-6 / TNF-α / IL-10 / 炎症因子

Key words

traumatic brain injury / rTMS / IL-6 / TNF-α / IL-10 / inflammatory factors

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）会引起神经元损伤和炎症，导致认知、行为和运动障碍，15%~30%TBI后认知障碍患者会产生持续的认知和神经行为功能障碍^［1，2］，进而影响生活能力和康复效果^［3］。TBI的病理生理机制是一个复杂的多阶段过程，涉及原发性损伤和继发性损伤的相互作用，其中继发性脑损伤在原发性损伤后数小时至数天发生，可干预，是治疗的关键靶点。神经炎症和氧化损伤又是继发性脑损伤致病的最主要因素^［4］。炎症因子与颅脑损伤后的炎症反应启动和调节有密切关系，是颅脑损伤病理生理过程中的一个重要构成因素。

重复经颅磁刺激（rTMS）是一种非侵入性且相对安全的脑刺激技术，该技术通过对置于头部的线圈施加短暂的强脉冲电流，利用电磁感应在大脑中产生电场，进而通过调节神经跨膜电位来发挥神经调控作用，对TBI后的认知障碍有显著改善作用^［5，6］。此外，它还能迅速改善脑组织缺氧，并发挥减轻脑水肿、抑制炎症反应及促进神经再生等多重效应^［7］。近年大量临床研究显示，rTMS在TBI后认知障碍治疗中有广泛应用^［5-7］，本研究旨在进一步证实从急性期持续至慢性期rTMS对TBI后神经炎症的双向免疫调节作用，分析TBI后认知障碍大鼠给予rTMS治疗后动态监测炎症因子变化趋势及其疗效评价。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级成年雄性SD大鼠，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（晋）2019-0004，体质量250~300 g。本研究经山西医科大学实验动物福利伦理委员会审批，批准文号：SYDL2023042。

1.2 分组及处理

将大鼠随机分为4组：对照组、假手术组、TBI组、rTMS组，每组各40只。对照组不给予特殊处理，正常饲养；假手术组仅将颅骨开窗，不予头部打击；TBI组按照改良Feeney法^［8］制作重度脑外伤大鼠模型；rTMS组按照改良Feeney法造模后，采用武汉奥赛福医疗科技有限公司磁刺激仪OSF-3型于术后当天起进行每天20 min的重复经颅磁刺激治疗，固定处置大鼠，给予高频刺激（10 Hz，30%最大输出强度），总脉冲数为1 800，1次/d，连续28 d。手柄中心位于动物患侧大脑半球。刺激时固定大鼠头部，线圈紧贴头皮，与大鼠大脑半球相切。

1.3 TBI模型建立及评价

利用自由落体打击方法建立模型。术前大鼠均禁食禁水6~8 h。大鼠用40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，俯卧位将大鼠头颅固定于脑立体定向仪上，调节仪器确保头颅保持水平。备皮消毒后，沿颅顶正中剪开头皮，分离骨膜，暴露颅骨，用脑立体定位仪确定打击位置（前囟后3.5 mm，中线偏左3 mm），钻约5 mm的骨窗，保持硬脑膜完整。打击深度6 mm，打击速度4 m/s，停留时间500 ms，撞击杆撞击大鼠硬脑膜。完成打击后，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，碘伏消毒伤口。

模型评分细则包括运动功能评估0~4分；感觉功能评分包括触觉测试0~1分、本体感觉测试0~1分；反射缺失0~4分；异常反射包括翻正反射0~2分，角膜、惊吓反射每缺失一项加1分；其他神经功能缺损包括癫痫/肌阵挛、自主活动减少、体温或体重异常，其项目存在加1分。评判标准：0分表示正常；1~6分为轻型颅脑损伤；7~12分为中型颅脑损伤；13~18分为重型颅脑损伤。本研究选择mNSS评分为7~12分的中型TBI模型进行实验研究。

1.4 指标检测

在造模后0 h、24 h、7 d、14 d、28 d对假手术组、TBI组以及rTMS组进行mNSS评分。每组分别在各时间点选取8只大鼠，采用40 mg/kg剂量的戊巴比妥钠进行麻醉，随后实施安乐死，采集各组大鼠的尾静脉血和脑组织标本，脑组织被取出后，于冰上迅速分离双侧前额叶和海马区，所取组织经研磨处理后，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno⁃sorbent assay，ELISA）检测血清和脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10的含量。

1.5 统计学处理

用GraphPadPrism 6.0和SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（X±S）表示，不同时间点四组间比较采用析因设计资料的方差分析，分析时间效应、处理效应及其交互作用。若交互作用显著，进一步进行简单效应分析；否则，直接报告主效应。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rTMS对TBI后认知障碍大鼠mNSS评分的影响

析因设计方差分析结果显示，处理与时间对大鼠mNSS评分的交互作用显著（F=6.808，P<0.001）；处理主效应显著（F=131.199，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=27.288，P<0.001）。在0 h和24 h，TBI组、rTMS组mNSS评分均高于假手术组（P<0.05），但TBI组与rTMS组差异无统计学意义（P>0.05）；在7 d和14 d，rTMS组mNSS评分均低于TBI组（P<0.05）；在28 d，rTMS组和TBI组mNSS评分比较差异无统计学意义（P>0.05，见图1）。

2.2 rTMS对TBI后认知障碍大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10含量的影响

析因设计方差分析结果显示，对于大鼠血清TNF-α含量，处理与时间的交互作用显著（F=9.093，P<0.001）；处理主效应显著（F=31.791，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=37.348，P<0.001）。对于大鼠血清IL-6含量，处理与时间的交互作用显著（F=106.958，P<0.001）；处理主效应显著（F=239.020，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=400.645，P<0.001）。对于大鼠血清IL-10含量，处理与时间的交互作用显著（F=14.594，P<0.001）；处理主效应显著（F=58.326，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=50.073，P<0.001）。在0 h，四组间血清TNF-α、IL-6和IL-10含量差异均无统计学意义（P>0.05）；在24 h和7 d，rTMS组血清TNF-α和IL-6含量显著高于对照组和假手术组，但低于TBI组（P<0.05），rTMS组IL-10含量显著高于其他三组（P<0.05）；在14 d，rTMS组TNF-α、IL-6含量低于TBI组（P<0.05），但接近于对照组和假手术组，而rTMS组血清中IL-10含量高于TBI组（P<0.05）；在28 d，四组间血清TNF-α、IL-6和IL-10含量差异均无统计学意义（P>0.05，见图2）。

2.3 rTMS对TBI后认知障碍大鼠脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量的影响

析因设计方差分析结果显示，对于大鼠脑组织TNF-α含量，处理与时间的交互作用显著（F=79.857，P<0.001）；处理主效应显著（F=205.458，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=360.248，P<0.001）。对于大鼠脑组织IL-6含量，处理与时间的交互作用显著（F=73.346，P<0.001）；处理主效应显著（F=181.878，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=283.418，P<0.001）。对于大鼠脑组织IL-10含量，处理与时间的交互作用显著（F=17.164，P<0.001）；处理主效应显著（F=97.968，P<0.001）；时间的主效应也显著（F=59.975，P<0.001）。在0 h，四组间脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量差异均无统计学意义（P>0.05）；在24 h、7 d和14 d，rTMS组与其他三组相比，脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量差异均有统计学意义（P<0.05），rTMS组TNF-α、IL-6含量低于TBI组，IL-10含量显著高于TBI组；在28 d，四组间脑组织中TNF-α、IL-6含量差异均无统计学意义（P>0.05），但是rTMS组脑组织中IL-10含量略高于TBI组（见图3）。

3 讨论

创伤性脑损伤（TBI）后的神经炎症反应是影响神经修复与功能预后的关键病理环节。研究表明，促炎因子（如TNF-α、IL-6）与抗炎因子（如IL-10）的动态平衡对疾病转归具有决定性影响^［9-11］。重复经颅磁刺激（rTMS）作为一种非侵入性神经调控技术，在改善TBI后认知障碍方面显示出潜力，但其是否通过调节神经免疫平衡发挥作用尚需进一步验证。本研究通过动态观察rTMS对TBI大鼠血清和脑组织中TNF-α、IL-6和IL-10表达的时序性影响，系统探讨了rTMS在TBI后神经炎症调控中的作用。

TNF-α是TBI后反应最快的促炎因子之一，其在损伤后1~2 h即开始显著升高，6~24 h达到峰值，驱动急性期炎症级联反应^{［12，13］}。本研究结果显示，在损伤后24 h，TBI组血清和脑组织中TNF-α含量均显著升高，与文献报道一致。值得注意的是，rTMS组在24 h、7 d和14 d时TNF-α含量均显著低于TBI组，表明rTMS能够有效抑制TNF-α的过度表达。这一结果提示，rTMS可能通过干预早期炎症反应的关键信号通路，如NF-κB通路，从而抑制TNF-α的产生^{［14，15］}。

IL-6作为另一重要促炎因子，其表达高峰通常出现在损伤后24~48 h，在促进炎症反应和继发性神经损伤中发挥关键作用^{［13，16］}。本研究中，TBI组在24 h和7 d时血清和脑组织IL-6含量均显著升高，符合其表达动力学特征。rTMS组在上述时间点的IL-6含量均显著低于TBI组，说明rTMS对IL-6的表达也具有明显的抑制作用。考虑到IL-6主要由活化的小胶质细胞和星形胶质细胞产生，rTMS可能通过调节神经胶质细胞的活化状态，减少IL-6的合成与释放^［17］。

IL-10作为重要的抗炎因子，通常在促炎因子释放后反馈性升高，其表达高峰出现在损伤后48~72 h，在抑制过度炎症和促进组织修复中起关键作用^{［11，18］}。本研究显示，rTMS组在24 h至14 d期间血清和脑组织IL-10含量均显著高于TBI组，甚至在28 d时脑组织中IL-10含量仍略高于TBI组。这一结果表明，rTMS不仅能抑制促炎因子的表达，还能积极促进抗炎因子的产生，从而在更长时间范围内维持炎症平衡。这种双向调节作用可能是rTMS发挥脑保护作用的重要机制之一。

mNSS评分结果显示，rTMS组在7 d和14 d时神经功能缺损评分显著低于TBI组，这一改善时间窗与rTMS对炎症因子的调控时段高度吻合。值得注意的是，在炎症反应最为剧烈的24 h，rTMS组与TBI组mNSS评分尚无显著差异，而在炎症趋于平稳的28 d，两组间差异也不再显著。这一发现提示，rTMS对神经功能的改善作用可能与其在炎症反应关键期的免疫调节作用密切相关。

现有研究表明，rTMS可能通过多种机制调节神经炎症^{［14，15，17］}。一方面，rTMS可能通过激活胆碱能抗炎通路或调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能，抑制促炎因子的产生；另一方面，rTMS可能促进小胶质细胞和星形胶质细胞向抗炎表型转化，增加IL-10等抗炎因子的释放。本研究观察到的促炎因子下降和抗炎因子升高的现象与这些机制假设相符。此外，rTMS对炎症平衡的调节作用从急性期持续至慢性期，提示其具有长期的免疫调节潜力。

总之，本研究结果与张释双^［19］、邹成功等^［20］关于TBI后炎症因子动态变化的报道一致，也印证了贾飞阳等^［21］和成世梅等^［22］关于rTMS通过抑制神经炎症促进功能恢复的结论。此外，本研究从多个时间点系统揭示了rTMS对炎症平衡的双向调节作用，进一步拓展了其治疗TBI的机制认识。但本研究尚存在以下不足：①本实验采用啮齿类动物大鼠作为研究对象，其自身神经损伤修复能力比灵长类（人）强，减少了不同处理组效果的差异性；②炎症反应往往发生于创伤性脑损伤的数分钟到数小时内，本研究仅选取rTMS治疗后0 h、24 h、7 d、14 d和28 d这5个观测时点，未能覆盖炎症反应的所有关键作用时间，将来需要更进一步的动物和临床研究；③本研究尚需要结合行为学（如水迷宫）或分子生物学多维度验证rTMS的效果。未来研究将围绕“机制深挖”“参数优化”和“疗效关联”三大方向展开：首先，利用分子生物学技术（如流式细胞术）深入探究rTMS调控NF-κB等上游信号通路及特定免疫细胞（如小胶质细胞）的精确机制；其次，系统优化刺激频率、强度和治疗时间窗等参数，确立最佳治疗方案；最后将炎症因子变化与神经行为学功能（运动、认知）进行长期关联分析，并探索rTMS与药物的协同效应，最终为实现临床转化提供从分子到行为的完整证据链。

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基金资助

山西省基础研究计划资助项目(20210302123489)