蟾毒它灵促进内质网应激和细胞自噬抑制肝细胞癌增殖

摘要

目的 探讨蟾毒它灵（Bufotalin）对肝细胞癌的治疗作用及其机制。方法 人肝癌细胞株HepG2和Huh-7分别用0,10,25,50,100,500,1 000 nmol/L的蟾毒它灵处理24,48 h，使用CCK-8法检测蟾毒它灵对细胞存活率的影响。用0,2.5,5,10 nmol/L的蟾毒它灵处理，检测蟾毒它灵对细胞克隆形成能力的影响。人肝癌细胞株HepG2和Huh-7分为空白对照组和蟾毒它灵组（500 nmol/L），流式细胞术检测蟾毒它灵对凋亡和细胞周期的影响；DCFH-DA荧光探针染色检测细胞活性氧的含量；转录组测序（RNA-seq）检测细胞整体基因表达和信号通路变化。使用250,500,1 000 nmol/L的蟾毒它灵处理细胞，蛋白免疫印迹实验检测细胞内质网应激蛋白（ATF4,CHOP）和自噬相关蛋白（p62,Beclin1,LC3）的表达变化。人肝癌细胞株HepG2和Huh-7使用25,50,100,500,1 000 nmol/L的蟾毒它灵添加或不添加10μmol/L的氯喹，使用CCK-8法检测抑制自噬对蟾毒它灵作用的影响。H22小鼠肝癌细胞注入KM小鼠进行荷瘤实验，设置空白对照组、阳性药物5-氟尿嘧啶组（30 mg/kg）、蟾毒它灵低剂量组（1 mg/kg）和高剂量组（2 mg/kg），检测蟾毒它灵对肿瘤体内增殖的影响。结果 10,25,50,100 nmol/L的蟾毒它灵处理24,48 h后细胞存活率呈剂量依赖性降低（P<0.01）。2.5,5,10 nmol/L的蟾毒它灵处理后，细胞克隆形成能力也呈剂量依赖性降低（P<0.05）。与空白对照组相比，蟾毒它灵组细胞凋亡比率增加（P<0.05）,G0/G1期细胞降低（P<0.05）、G2/M期细胞增加（P<0.05）。与空白对照组比较，蟾毒它灵组活性氧产生增加（P<0.05）；内质网应激蛋白ATF4、CHOP和细胞自噬通路基因蛋白Beclin1、LC3-II表达水平显著上调（P<0.01）。与蟾毒它灵组比较，蟾毒它灵+氯喹组细胞存活率升高（P<0.05）。小鼠荷瘤实验结果表明，蟾毒它灵显著抑制小鼠体内肝癌细胞的增殖（P<0.05）。结论 蟾毒它灵通过诱导内质网应激和细胞自噬，促进细胞凋亡并抑制其增殖。

关键词

蟾毒它灵 / 肝细胞癌 / 细胞自噬 / 内质网应激 / 活性氧 / 抗肿瘤