去泛素化酶USP14参与多发性骨髓瘤细胞增殖和细胞周期调控的作用机制

摘要

目的 探讨去泛素化酶泛素特异性蛋白酶14（USP14）稳定核输出蛋白1（XPO1）参与多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖和细胞周期调控的作用机制。方法 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测MM患者与健康者骨髓样本以及HS-27A、U266、RPMI 8226、NCI-H929、MM.1S细胞中USP14 mRNA、XPO1 mRNA水平。将U266细胞随机分为对照组（control）、沉默对照组（si-NC）、沉默USP14组（si-USP14）、沉默USP14+过表达对照组（si-USP14+OE-NC）、沉默USP14+过表达XPO1组（siUSP14+OE-XPO1）。control组不做任何处理，其余各组均用Lipofectamine^TM2000转染相应序列48 h。Western blot检测USP14沉默效率，CCK-8及克隆形成实验检测细胞增殖活性[分别用450 nm波长下的光密度值(OD_{450 nm})与细胞克隆数表示]，流式细胞术检测细胞周期（G₀/G₁期、S期）变化情况，蛋白质免疫共沉淀检测USP14、XPO1相互作用，泛素化实验检测XPO1泛素化水平变化，免疫荧光检测XPO1、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）共定位情况，Western blot检测细胞增殖相关蛋白（PCNA、CyclinD1、p21）及USP14、XPO1表达。通过在裸鼠右肩皮下注射转染si-NC、si-USP14质粒的U266细胞悬液，将裸鼠分为si-NC组、siUSP14组，每组10只，检测沉默USP14对祼鼠移植瘤生长的影响。结果 与健康者比较，MM患者骨髓样本中USP14 mRNA、XPO1 mRNA水平升高（均P<0.05）。与HS-27A细胞比较，U266、RPMI 8226、NCI-H929、MM.1S细胞中USP14 mRNA、XPO1mRNA水平升高（均P<0.05）。与si-NC组比较，si-USP14组USP14、XPO1、PCNA、CyclinD1、XPO1/CyclinD1表达及细胞克隆数、OD_{450 nm}、S期细胞比例降低，p21表达及G₀/G₁期细胞比例、XPO1泛素化水平升高（P<0.05）；与si-USP14+OE-NC组比较，siUSP14+OE-XPO1组XPO1、PCNA、CyclinD1、XPO1/CyclinD1表达及细胞克隆数、OD_{450 nm}、S期细胞比例升高，p21表达及G₀/G₁期细胞比例、XPO1泛素化水平降低（P<0.05）。免疫共沉淀实验显示USP14与XPO1之间存在相互作用。裸鼠移植瘤实验显示，与si-NC组比较，si-USP14组裸鼠移植瘤体积和瘤体质量均减小（均P<0.05）。结论 USP14可能通过促进XPO1表达调控细胞周期进而抑制MM细胞恶性增殖。

关键词

去泛素化酶 / USP14 / XPO1 / 多发性骨髓瘤 / 增殖 / 周期调控 / 泛素化 / 移植瘤